Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Podsumowanie

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Streszczenie

Utrzymanie stałego poziomu wapnia (^Ca2+) w siateczce sarkoplazmatycznej (SR) komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) jest niezbędne dla ich ogólnego stanu zdrowia. Znaczna część wewnątrzkomórkowej zawartości Ca^{2 +} znajduje się w magazynach SR w VSMC. Jako jedyna organella wewnątrzkomórkowa o ścisłym związku z otaczającą przestrzenią zewnątrzkomórkową poprzez połączenia błony plazmatycznej-SR, SR można uznać za pierwszą linię odpowiedzi na wszelkie nieprawidłowości w stanach przejściowych Ca²⁺ lub stres doświadczany przez komórkę. Wśród wielu jego funkcji, jedną z najważniejszych jest jego rola w przekazywaniu sygnałów regulowanych przez Ca²⁺ w całej komórce w celu wywołania dalszych reakcji w całej komórce. Powszechniejsze stosowanie cytoplazmatycznych wskaźników Ca^{2 +} w tym zakresie jest ogólnie niewystarczające do badań nad wysoce dynamicznymi zmianami w śródświetlnym magazynie Ca^{2 +} SR, które nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół bezpośredniego i przejrzystego pomiaru luminalnego SR Ca²⁺. To narzędzie jest przydatne do badania niuansów zmian w SR Ca^{2 +}, które mają znaczący wpływ na normalne funkcjonowanie i zdrowie komórki. Wahania zawartości SR Ca²⁺ mogą dostarczyć nam znacznej ilości informacji dotyczących reakcji komórkowych na choroby lub warunki stresowe doświadczane przez komórkę. W tej metodzie zmodyfikowana wersja wskaźnika Ca^{2 +} ukierunkowanego na SR, D1SR, jest używana do wykrywania wahań Ca^{2 +} w odpowiedzi na wprowadzenie czynników do hodowanych komórek mięśni gładkich aorty szczura (SMC). Po inkubacji ze wskaźnikiem D1SR stosuje się konfokalną mikroskopię fluorescencyjną i obrazowanie oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET) do bezpośredniej obserwacji zmian wewnątrzświetlnych poziomów Ca^{2 + SR w} warunkach kontrolnych i z dodatkiem środków agonistycznych, które działają w celu indukowania wewnątrzkomórkowego ruchu Ca^{2 +}.

Wprowadzenie

Ca²⁺ to bardzo ważny jon, który występuje w obfitości w każdej komórce ciała. Odgrywa znaczącą rolę w wielu różnych funkcjach komórkowych, w tym we wzroście, proliferacji, migracji i apoptozie^1-4. Powszechnie wiadomo, że Ca^{2 +} może wpływać na te procesy zarówno poprzez działania bezpośrednie, jak i pośrednie, a zatem zmiany normalnych wewnątrzkomórkowych stężeń tego jonu mogą łatwo spowodować negatywne skutki dla dotkniętych komórek. SR jest uważany za największy wewnątrzkomórkowy magazyn Ca²⁺ w komórce⁵. Poziomy Ca²⁺ w stanie stacjonarnym zarówno w SR, jak i cytoplazmie są zwykle utrzymywane poprzez ci....

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty i procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego laboratorium Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej w Vancouver w Kanadzie.

1. Przygotowanie naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem do mikroskopii konfokalnej opartej na FRET

1. Przygotuj płytki, stosując poniższą procedurę 36-48 godzin przed eksperymentami.
2. Pobrać wybraną galaretowatą mieszaninę białek i 0,25% trypsyny-EDTA z magazynu w temperaturze -20 °C i przechowywać je w mobilnej łaźni lodowej do czasu użycia.
   UWAGA: Mieszaninę białek powlekających należy wystawić na działanie RT t....

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać przy użyciu opisanego procesu w celu zarejestrowania danych o stężeniu Ca²⁺ w świetle SR, w porównaniu do powszechnie stosowanego sposobu pośredniego pomiaru zmian stężeń Ca²⁺ w magazynach organelli poprzez obserwację fluktuacji Ca²⁺ w cytoplazmie.

Rysunek 1A przedstawia migawkę obszaru zainteresowania (ROI) kultur.......

Dyskusja

Protokół ten opisuje transfekcję VSMC adenowirusem D1SR w celu zbadania stężeń Ca²⁺ w świetle SR. Metoda ta pozwala na bezpośredni pomiar Ca²⁺ w tej organelli, a także na jej przemieszczanie się do/z SR w wyniku zastosowania różnych środków przenoszących wapń. Metoda ta ma wiele zalet dla badaczy pracujących nad kompleksowym zrozumieniem, w jaki sposób zmiany poziomów SR i cytoplazmatycznego Ca^{2 +} wpływają na ogólny stan zdrowia komórek i jak te zmiany są ze sobą powiązane. Tradycyjna obs.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (wysoka glukoza, pirogronian)	Technologie życia	11995-065	Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced (Zredukowany czynnik wzrostu membrany podstawnej), 5 ml	Corning	356230	Przechowywać w temperaturze -20 ° C aż do momentu tuż przed użyciem
Serum dla nowonarodzonych cieląt	Sigma-Aldrich		Utrzymuj w temperaturze -20 ° C aż do tuż przed użyciem
35 mm płytki ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0,2 μ M wentylowana niebieska kolba uszczelniająca korek	BD Falcon	353136
EDTA Technologie żywotności roztworu		25200056	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C aż do tuż przed użyciem
50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Prezent
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C aż do tuż przed użyciem
1,5 ml Czarne probówki do mikrowirówek	Argos Technologies	T7100BK
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (z aplikacją FRET SE Wizard)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	Oprogramowanie GraphPad, Inc.

Trypsyna /