Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Podsumowanie

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Streszczenie

Utrzymanie stałego poziomu wapnia (^Ca2+) w siateczce sarkoplazmatycznej (SR) komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) jest niezbędne dla ich ogólnego stanu zdrowia. Znaczna część wewnątrzkomórkowej zawartości Ca^{2 +} znajduje się w magazynach SR w VSMC. Jako jedyna organella wewnątrzkomórkowa o ścisłym związku z otaczającą przestrzenią zewnątrzkomórkową poprzez połączenia błony plazmatycznej-SR, SR można uznać za pierwszą linię odpowiedzi na wszelkie nieprawidłowości w stanach przejściowych Ca²⁺ lub stres doświadczany przez komórkę. Wśród wielu jego funkcji, jedną z najważniejszych jest jego rola w przekazywaniu sygnałów regulowanych przez Ca²⁺ w całej komórce w celu wywołania dalszych reakcji w całej komórce. Powszechniejsze stosowanie cytoplazmatycznych wskaźników Ca^{2 +} w tym zakresie jest ogólnie niewystarczające do badań nad wysoce dynamicznymi zmianami w śródświetlnym magazynie Ca^{2 +} SR, które nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół bezpośredniego i przejrzystego pomiaru luminalnego SR Ca²⁺. To narzędzie jest przydatne do badania niuansów zmian w SR Ca^{2 +}, które mają znaczący wpływ na normalne funkcjonowanie i zdrowie komórki. Wahania zawartości SR Ca²⁺ mogą dostarczyć nam znacznej ilości informacji dotyczących reakcji komórkowych na choroby lub warunki stresowe doświadczane przez komórkę. W tej metodzie zmodyfikowana wersja wskaźnika Ca^{2 +} ukierunkowanego na SR, D1SR, jest używana do wykrywania wahań Ca^{2 +} w odpowiedzi na wprowadzenie czynników do hodowanych komórek mięśni gładkich aorty szczura (SMC). Po inkubacji ze wskaźnikiem D1SR stosuje się konfokalną mikroskopię fluorescencyjną i obrazowanie oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET) do bezpośredniej obserwacji zmian wewnątrzświetlnych poziomów Ca^{2 + SR w} warunkach kontrolnych i z dodatkiem środków agonistycznych, które działają w celu indukowania wewnątrzkomórkowego ruchu Ca^{2 +}.

Wprowadzenie

Ca²⁺ to bardzo ważny jon, który występuje w obfitości w każdej komórce ciała. Odgrywa znaczącą rolę w wielu różnych funkcjach komórkowych, w tym we wzroście, proliferacji, migracji i apoptozie^1-4. Powszechnie wiadomo, że Ca^{2 +} może wpływać na te procesy zarówno poprzez działania bezpośrednie, jak i pośrednie, a zatem zmiany normalnych wewnątrzkomórkowych stężeń tego jonu mogą łatwo spowodować negatywne skutki dla dotkniętych komórek. SR jest uważany za największy wewnątrzkomórkowy magazyn Ca²⁺ w komórce⁵. Poziomy Ca²⁺ w stanie stacjonarnym zarówno w SR, jak i cytoplazmie są zwykle utrzymywane poprzez ciągły przepływ do i z kanałów transportowych Ca²⁺ tej organelli. Stresujące warunki nałożone na komórki z powodu jakiejkolwiek formy urazu lub choroby są często związane ze znaczącymi zmianami w SR Ca^{2 +}, które mają długotrwały wpływ na zdrowie komórki. W najcięższych przypadkach niezdolność zestresowanej komórki do odzyskania i utrzymania poziomu SR^{Ca 2+} w stanie stacjonarnym może nawet doprowadzić do śmierci w wyniku apoptozy^6-8.

Obecne badania nad komórkową dynamiką Ca²⁺ są ograniczone przez fakt, że niewiele badań testuje organelle Ca²⁺ przechowujące zawartość bezpośrednio^9-11. Najczęstszą praktyką jest natomiast pomiar cytoplazmatycznych poziomów Ca²⁺ jako pośredni pomiar zmian zawartości SR Ca^{2+ 12-14}. W tych eksperymentach Ca^{2 +} jest zwykle indukowany do uwolnienia z SR poprzez zastosowanie środków farmakologicznych powodujących wyczerpanie organelli (np. Thapsigargin). Następnie wyciąga się wnioski dotyczące zmian SR Ca²⁺ na podstawie wahań stężeń Ca²⁺ w cytoplazmie. Pomimo tego, że badacze mają jeszcze możliwość wyciągania takich wniosków w sposób okrężny, ta metoda pomiaru SR Ca²⁺ jest wyraźnie pośrednim sposobem pozyskiwania takich informacji, z wieloma ograniczeniami dotyczącymi interpretacji zebranych danych. Aby ominąć to wyraźne ograniczenie, konieczne jest zmierzenie ilości Ca²⁺ znajdującej się bezpośrednio w sieci świetlnej SR.

Kluczowe dla końcowego wyniku, jakim jest możliwość bezpośredniego rejestrowania wewnątrzświetlnych poziomów Ca²⁺ SR, są narzędzia do hodowli komórkowych i wskaźnik Ca ²⁺. W odniesieniu do danych, do których odwołuje się niniejszy manuskrypt, należy zauważyć, że użyte VSMC pochodziły z zamrożonej linii komórkowej. Komórki hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) + 10% surowicy nowonarodzonej cielęciny (NCS) w pasażach 22-26 dla opisanych eksperymentów, inkubowanych w stałej temperaturze 37 °C z 5% dopływem CO₂ . Na przykład przy użyciu obecnej metody komórki zostały z powodzeniem wyhodowane na mieszance białek, która symuluje środowisko zewnątrzkomórkowe wielu różnych typów tkanek¹⁵. Ważnym czynnikiem wpływającym na powodzenie badań nad SR Ca²⁺ jest rodzaj zastosowanej mieszanki białkowej; w tym przypadku konieczna była odmiana o niskim współczynniku wzrostu, aby składniki tego narzędzia nie wpływały na regularną sygnalizację Ca²⁺ i ruchy stale zachodzące w badanych komórkach. Po pomyślnym wzroście badanych komórek należy również skutecznie wprowadzić wskaźnik Ca²⁺ do tych hodowanych komórek. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu wektora adenowirusowego, który przenosi wskaźnik Ca^{2 +} D1SR znajdujący się w SR. Aby osiągnąć wysoką skuteczność transfekcji, komórki muszą być inkubowane z wektorami wirusowymi przez co najmniej 36-48 godzin przed obrazowaniem. Preparat ten stanowi niezawodne narzędzie do pomiaru stanów nieustalonych Ca²⁺ w świetle SR z wysoką dokładnością i powtarzalnością.

Wskaźnik D1SR używany w tym protokole jest zmodyfikowanym wariantem wskaźnika D1ER Ca²⁺, który został pierwotnie stworzony przez laboratorium dr Rogera Y. Tsiena na Uniwersytecie Kalifornijskim, San Diego, USA^9,16. Oryginalny D1ER należy do drugiej generacji genetycznie kodowanych wskaźników Ca^{2 +} zwanych kameleonami, które wykazują czułość Ca^{2 +} w znacznie szerszym zakresie (0,5-160 μM) w porównaniu z poprzednimi wskaźnikami Ca^{2 + 9,16}. Nowy wariant D1SR, będący darem od dr Wayne'a Chena (University of Alberta, Kanada), zawiera jednak zmutowaną sekwencję kalsekwetryny (zamiast sekwencji kalretykuliny, jak w oryginalnym D1ER). Zmutowana kalsekwestryna ma zmniejszone wiązanie z Ca^{2 +}, co eliminuje problem konkurowania z endogenną kalsekwestryną w wiązaniu z Ca^{2 +} w świetle SR¹¹. Wskaźnik D1SR zawiera skrócone, wzmocnione białko fluorescencyjne cyjanu (CFP) i białko żółtej fluorescencji (YFP), które wiążą się za pomocą białka łącznikowego zawierającego zmodyfikowaną kalmodulinę (CaM) i M13 (26-resztowy peptyd kinazy łańcucha lekkiego miozyny, który wiąże się z CaM). Sekwencja CaM-M13 została zmodyfikowana, aby zapobiec wiązaniu się M13 z endogenną kalmoduliną. Ponadto, aby zapewnić retencję SR, sekwencja kalsekwestryny została dodana na końcu 5' CFP¹¹. Po związaniu z Ca²⁺ domena CaM-M13 przechodzi zmiany konformacyjne, które powodują wzrost transferu energii między flankującym CFP a YFP, co jest rejestrowane jako wzrost intensywności sygnału FRET. Z drugiej strony, gdy stężenie luminalu SR Ca²⁺ spada, domena CaM-M13 ulega odwrotnym zmianom konformacyjnym, co skutkuje spadkiem transferu energii między flankującym CFP a YFP i znacznym spadkiem intensywności sygnału FRET.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty i procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego laboratorium Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej w Vancouver w Kanadzie.

1. Przygotowanie naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem do mikroskopii konfokalnej opartej na FRET

1. Przygotuj płytki, stosując poniższą procedurę 36-48 godzin przed eksperymentami.
2. Pobrać wybraną galaretowatą mieszaninę białek i 0,25% trypsyny-EDTA z magazynu w temperaturze -20 °C i przechowywać je w mobilnej łaźni lodowej do czasu użycia.
   UWAGA: Mieszaninę białek powlekających należy wystawić na działanie RT tylko przez krótki czas, aby zapobiec zestaleniu się mieszaniny przed użyciem. Roztwór trypsyny powinien być również schłodzony do czasu, gdy będzie potrzebny; alternatywnie, trypsynę można pobrać z magazynu w temperaturze -20 °C po wykonaniu kroku 1.5.
3. Przygotować mieszaninę białek w rozcieńczeniu 1:25: DMEM (bez dodatku surowicy, schłodzona). Przenieść odpowiednią objętość mieszanki białkowej/DMEM na każdą przygotowywaną płytkę. W przypadku płytek ze szklanym dnem o średnicy 35 mm dodaj około 200 μl, aby całkowicie pokryć wewnętrzny szklany okrąg na spodzie płytki.
4. Pozostaw płytki na co najmniej 30 minut w komorze bezpieczeństwa i w temperaturze pokojowej. W tym czasie ogrzej DMEM z 10% NCS do 37 °C w łaźni wodnej.
5. Podgrzej trypsynę w łaźni wodnej do temperatury 37 °C bezpośrednio przed kolejnymi krokami.
6. Usunąć DMEM, który znajduje się obecnie w kolbie hodowlanej, za pomocą szklanej pipety i odsysania. Umyć podłogę kolby ciepłym sterylnym PBS, aby usunąć pozostałe pozostałości DMEM.
7. Usunąć wcześniej wyhodowane komórki mięśni gładkich z dna kolby:
   UWAGA: Kolba została założona kilka dni po tym etapie, aby umożliwić komórkom osiągnięcie pożądanej konfluencji (około 80%) przed przygotowaniem płytki. Komórki pierwotnie zawieszono w kolbie w 20 ml DMEM z 10% NCS i inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% dopływem CO₂ przez 24 godziny, po czym zapas DMEM został odświeżony, a komórki zostały zwrócone do inkubatora. DMEM był odświeżany co 48 godzin, postępując zgodnie z tymi początkowymi krokami, aż komórki osiągnęły konfluencję.
   1. Szybko umyć kolbę 1 ml trypsyny, a następnie usunąć 1 ml trypsyny za pomocą odsysania.
   2. Dodać kolejny 1 ml trypsyny i pozostawić na dłuższy okres (około 30-60 sekund), przetrząsając kolbę, aby upewnić się, że enzym styka się z całym dnem kolby.
   3. Obserwuj, ile komórek oderwało się pod mikroskopem, aż do momentu, gdy będą zadowolone z oddzielenia od kolby. Naprzemiennie przetrząsać roztwór trypsyny i sprawdzać oderwanie komórek, aż do uzyskania zadowalającej proporcji komórek oddzielonych od kolby.
      UWAGA: Kolbę można umieścić z powrotem w inkubatorze na około 30-60 sekund, aby przyspieszyć ten proces w temperaturze 37 °C.
   4. Po usunięciu komórek za pomocą trypsyny, dodać świeży DMEM z 10% NCS do kolby, aby zatrzymać reakcję trypsyny (wystarczająca objętość, aby trypsyna stanowiła 1/8 całkowitej objętości w kolbie).
      UWAGA: Na przykład, przy użyciu kolby hodowlanej o pojemności 250 ml, byłoby to 7 ml DMEM dodane do 1 ml trypsyny, aby uzyskać 8 ml roztworu komórkowego.
8. Otrzymany roztwór komórkowy przenieść z kolby do czystej (oznakowanej) stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Dodać 1 ml świeżego DMEM plus 10% NCS do każdej przygotowywanej płytki (wystarczająca pożywka wystarczy na 24 godziny).
10. Delikatnie odwróć probówkę zawierającą roztwór komórkowy wiele razy, aby rozbić wszelkie osady, które mogły się uformować.
11. Odpipetować odpowiednią objętość delikatnie wymieszanego roztworu komórkowego do każdej płytki.
    UWAGA: Zalecany numer SMC platerowany dla tego protokołu to 0,5-0,8 x 10⁶ na 35 mm szalek hodowlanych. Liczby te mogą się różnić w zależności od typu ogniwa i powinny być testowane i modyfikowane przez każde laboratorium.
12. Dokładnie obracaj każdą płytkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek na szklanym dnie.

2. Transfekcja przejściowa z wektorem adenowirusowym przenoszącym wskaźnik D1SR Ca²⁺

1. Po dodaniu pożywki i roztworu komórkowego do każdej płytki, pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C przy 5% dopływie CO₂ przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić komórkom prawidłowe przyłączenie się do szkła na dnie naczyń. Sprawdzaj płytki pod mikroskopem w odstępach 15 minut, aż komórki zostaną wyraźnie przymocowane.
2. Pobrać podwielokrotność adenowirusa-D1SR z magazynu w temperaturze -80 °C i przechowywać w mobilnej łaźni lodowej w celu przetransportowania do komory bezpieczeństwa biologicznego.
3. Odpipetować żądaną dawkę (wielokrotność infekcji 100) schłodzonego D1SR do każdej płytki.
   UWAGA: Obliczenie objętości roztworu adenowirusa potrzebnego na płytkę zależy od miana wirusa w oryginalnym roztworze podstawowym, które jest przedstawione jako jednostka tworząca blaszkę (PFU). Opierając się na naszym doświadczeniu, zalecamy wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100, co jest interpretowane jako liczba cząsteczek wirusa potrzebnych do zakażenia jednej komórki mięśni gładkich (SMC) na płytce hodowlanej.
4. Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C z 5% zapasem CO₂ O/N.
5. Następnego dnia uzupełnij komórki 1 ml świeżego DMEM plus 10% NCS.
6. Inkubować płytki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ O/N.

3. Pomiar SR Luminal Ca²⁺ za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

1. Po inkubacji O/N usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.
2. Przemyć płytkę hodowlaną 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS zawierającego (w mmol·L⁻¹) NaCl 140, glukozę 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl₂ 1,5 i MgCl₂ 1 (pH 7,4) trzy razy.
3. Dodać 1 ml świeżego, ciepłego buforu HEPES-PSS bezpośrednio przed rozpoczęciem zapisu.
4. Wykonaj wstępne obrazowanie za pomocą aplikacji FRET SE (Sensitized Emission) (lub podobnej funkcji) w oprogramowaniu powiązanym z mikroskopem konfokalnym.
   1. Po otwarciu aplikacji kliknij zakładkę "Konfiguracja", aby dostosować ustawienia w celu osiągnięcia pożądanych warunków eksperymentalnych.
   2. Ręcznie zmień ustawienia kanału, tak aby komórki były wzbudzane w sekwencji przy 440 nm (dla kanałów donorowych i FRET) i 513 nm (dla kanału akceptorowego). Zbierz długości fal emisji przy 488 nm (dla donora) i 535 nm (dla FRET i akceptora).
   3. Ustaw intensywność światła na 15% transmisji, z czasem ekspozycji na wzbudzenie komórek wynoszącym 150 ms (czas nagrywania dla trzech sekwencyjnych kanałów donorowych CFP, FRET i akceptorowych YFP) i 10-sekundowymi odstępami między ekspozycjami.
5. Ustabilizuj płytkę na stoliku mikroskopu.
6. Użyj przycisku "Na żywo", aby sprawdzić rozdzielczość obrazu. Dostosuj ustawienia dalej, aż zostanie osiągnięta żądana rozdzielczość.
7. Pozostając na karcie "Konfiguracja", zrób zdjęcie próbki za pomocą przycisku "Przechwyć obraz".
8. Przechodząc do zakładki "Ocena", wybierz odpowiednią metodę obliczania wydajności FRET dla przeprowadzanych eksperymentów. Metoda 3, wykorzystująca obliczenia ratiometryczne [E_A(i) = B/A], jest zalecana do eksperymentów z udziałem wielbłądów, takich jak wskaźnik D1SR.
9. Przełącz się na zakładkę "Wykres", aby móc obserwować wartości intensywności rejestrowane w formie wykresu podczas eksperymentu.
10. Narysuj ROI w przeglądarce obrazów, aby obserwować odpowiednią średnią intensywność tego obszaru zainteresowania na wykresie w miarę postępu eksperymentu.
    UWAGA: Badacz może również zdecydować się na narysowanie wielu ROI i jednoczesne rejestrowanie i wyświetlanie odpowiednich intensywności na wykresie. Alternatywnie, badacze mogą nakreślić pojedynczy zwrot z inwestycji do wstępnego nagrania i przystąpić do nakreślenia wielu zwrotów z inwestycji w późniejszym czasie, otwierając plik eksperymentu w wersji oprogramowania zorientowanej na analizę danych.
    UWAGA: Więcej informacji na temat kroków wymaganych do skonfigurowania eksperymentów opartych na FRET można znaleźć w instrukcjach kreatora aplikacji FRET. Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w kreatora FRET, do ręcznego ustawienia parametrów nagrywania można użyć następującego protokołu.
11. Rozpocznij nagrywanie i pozwól na gromadzenie danych przez co najmniej 3 minuty, aby zapewnić stały podstawowy zapis sygnału przed wprowadzeniem interesującego czynnika.
12. Wprowadzić czynnik przemieszczający Ca²⁺ (np. 2 μM thapsigargin; 100 nm endoteliny-1) jako narzędzie do zubożania SR Ca²⁺, poprzez ręczne pipetowanie wcześniej ustalonej dawki bezpośrednio do płytki w miejscu jak najbliżej rejestrowanego obszaru zainteresowania. Kontynuuj nagrywanie przez żądany czas po zabiegu.
13. Rejestruj ratiometryczne obrazy seryjne FRET (512 x 512 pikseli) za pomocą 63-krotnego obiektywu olejowego konfokalnego mikroskopu odwróconego za pomocą aplikacji FRET SE.
14. Zbierz dane wynikające z obrazowania z klastra 5-10 SMC w każdym regionie zainteresowania (ROI), a następnie sformatuj i przeanalizuj za pomocą oprogramowania opartego na statystyce.
    1. Aby zapisać dane do późniejszego wykorzystania, kliknij prawym przyciskiem myszy na nagrany ślad i wybierz opcję "Eksportuj", aby zapisać arkusz kalkulacyjny z zarejestrowanymi średnimi intensywnościami sygnału na wybranym przez badacza dysku.
    2. Znormalizuj dane z każdego pojedynczego eksperymentu, dzieląc każdy punkt danych przez początkową wartość intensywności obserwowaną w punkcie czasowym 0 sekund.
    3. Importuj znormalizowane dane z arkuszy kalkulacyjnych do pliku projektu programu statystycznego, ręcznie kopiując i wklejając odpowiednie wiersze danych z ich oryginalnego arkusza kalkulacyjnego na sekundę.
    4. Automatycznie generuj wykresy odpowiadające zestawom danych wklejonym do programu.
       UWAGA: Domyślne ustawienia programu generują wykresy liniowe na podstawie zaimportowanych danych. Typ wyświetlanego wykresu można zmienić, klikając przycisk "Wybierz inny typ wykresu" pod nagłówkiem "Zmień" znajdującym się na głównym pasku narzędzi.
    5. Zbierz dane reprezentujące wiele niezależnych badań w większej grupie identycznych eksperymentów w jednym arkuszu danych, aby uzyskać średni ślad dla konkretnego przeprowadzonego testu.

4. Przygotowanie cytoplazmatycznego wskaźnika Ca²⁺

1. Rozpuść 0,0125 g kwasu pluronowego (PA) w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w czarnej probówce do mikrowirówki (może być konieczne ogrzanie probówki w mobilnej łaźni wodnej, aby pomóc rozpuścić PA).
2. Pobrać probówkę (50 μg) cytoplazmatycznego barwnika wskaźnikowego Ca²⁺ (Fluo-4 AM) z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C.
3. Owiń tubkę z barwnikiem w folię, aby w jak największym stopniu chronić ją przed kontaktem ze światłem.
4. Odpipetować 45 μl roztworu DMSO+PA do probówki zawierającej barwnik. Zawiń roztwór DMSO+PA w folię i przechowuj w temperaturze pokojowej.
5. Dokładnie wymieszać zawartość probówki, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół. Alternatywnie, sonikować probówkę z barwnikiem przez 10 min.
   UWAGA: Każda metoda dokładnego rozprowadzenia barwnika w roztworze DMSO+PA będzie wystarczająca; Jest to po prostu kwestia preferencji badacza. Jeśli badacz zdecyduje się na sonikację roztworu, powinno to być wykonane w odizolowanym obszarze/pomieszczeniu, gdzie inni nie będą dotknięci hałasem. Badacz powinien również używać ciężkich tłumików w celu ochrony uszu.
   1. W przypadku roztworu sonikacyjnego włóż owiniętą folią probówkę zawierającą barwnik do uchwytu rurki piankowej i umieść w 2/3 pełnej (z dH₂O) kąpieli sonicyjnej.
   2. Umieść kąpiel soniczną w odizolowanym miejscu/pomieszczeniu i włącz maszynę (upewnij się, że ochronne nakrycie głowy jest na miejscu przed rozpoczęciem procesu sonikacji). Pozostaw miejsce i pozostaw maszynę włączoną na 10 minut przed jej wyłączeniem i wyjęciem rurki (trzymaj owiniętą folią, aby chronić przed światłem tak długo, jak to możliwe).
6. Dokładnie wymieszany roztwór przelać na ciemne probówki do mikrowirówek (5 μl na probówkę, powinno wystarczyć w sumie 10 probówek).
7. Owinąć każdą podwielokrotną probówkę w folię. Oznaczyć probówki i przechowywać w środku osuszającym w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Pomiar cytoplazmatycznego Ca²⁺

1. Wykonaj czynności opisane w punktach 1.1-1.12, aby przygotować płytki hodowlane SMC aorty szczura.
2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki po 48 godzinach od posiewu.
3. Usunąć wcześniej przygotowaną podwielokrotność cytoplazmatycznego wskaźnika Ca²⁺ (5 μl) z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i przechowywać w mobilnej łaźni lodowej do czasu użycia.
4. Przemyć płytkę hodowlaną 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS zawierającego (w mmol·L⁻¹) NaCl 140, glukozę 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl₂ 1,5 i MgCl₂ 1 (pH 7,4) trzy razy.
5. Wymieszać wskaźnik z 1 ml ciepłego HEPES-PSS i umieścić go na płytce hodowlanej.
6. Inkubować SMC ze wskaźnikiem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (24 °C).
7. Wyjąć wskaźnik z płytki hodowlanej i trzykrotnie przemyć 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS.
8. Dodać 1 ml świeżego, ciepłego buforu HEPES-PSS bezpośrednio przed rozpoczęciem zapisu.
9. Rejestruj obrazy seryjne (512 x 512 pikseli) za pomocą 63-krotnego obiektywu olejowego konfokalnego mikroskopu odwróconego.
   1. Ręcznie zmień ustawienia tak, aby komórki były wzbudzane przy 488 nm, a długości fal emisyjnych były zbierane przy 555 nm z prędkością skanowania 700 Hz.
   2. Ustaw intensywność światła na 15% transmisji, z czasem ekspozycji na wzbudzenie 150 ms komórek (czas, w którym komórki są wystawione na działanie światła w wyznaczonych odstępach czasu podczas nagrywania) i 5-sekundowymi przerwami między ekspozycjami.
10. Ustabilizuj płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij nagrywanie.
11. Nagrywaj przez co najmniej 3 minuty, aby zapewnić stały podstawowy zapis sygnału przed wprowadzeniem czynnika będącego przedmiotem zainteresowania.
12. Wprowadź czynnik przemieszczający Ca²⁺ (np. 2 μM thapsigarginę) jako narzędzie do zubożania SR Ca²⁺ (zgodnie z opisem w kroku 3.16) i kontynuuj rejestrację przez żądany czas po zabiegu.
13. Rejestruj intensywność sygnału za pomocą oprogramowania specyficznego dla mikroskopu, uśredniając sygnały fluorescencji (F/F₀) z klastra 5-10 SMC w każdym obszarze zainteresowania (ROI). Zbieraj, formatuj i analizuj dane wynikające z obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy danych. Zobacz kroki 3.18.1-3.18.5, aby zapoznać się z opisem zbierania i analizy danych za pomocą tego oprogramowania.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać przy użyciu opisanego procesu w celu zarejestrowania danych o stężeniu Ca²⁺ w świetle SR, w porównaniu do powszechnie stosowanego sposobu pośredniego pomiaru zmian stężeń Ca²⁺ w magazynach organelli poprzez obserwację fluktuacji Ca²⁺ w cytoplazmie.

Rysunek 1A przedstawia migawkę obszaru zainteresowania (ROI) kultur...

Dyskusja

Protokół ten opisuje transfekcję VSMC adenowirusem D1SR w celu zbadania stężeń Ca²⁺ w świetle SR. Metoda ta pozwala na bezpośredni pomiar Ca²⁺ w tej organelli, a także na jej przemieszczanie się do/z SR w wyniku zastosowania różnych środków przenoszących wapń. Metoda ta ma wiele zalet dla badaczy pracujących nad kompleksowym zrozumieniem, w jaki sposób zmiany poziomów SR i cytoplazmatycznego Ca^{2 +} wpływają na ogólny stan zdrowia komórek i jak te zmiany są ze sobą powiązane. Tradycyjna obs...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (wysoka glukoza, pirogronian)	Technologie życia	11995-065	Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced (Zredukowany czynnik wzrostu membrany podstawnej), 5 ml	Corning	356230	Przechowywać w temperaturze -20 ° C aż do momentu tuż przed użyciem
Serum dla nowonarodzonych cieląt	Sigma-Aldrich		Utrzymuj w temperaturze -20 ° C aż do tuż przed użyciem
35 mm płytki ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0,2 μ M wentylowana niebieska kolba uszczelniająca korek	BD Falcon	353136
EDTA Technologie żywotności roztworu		25200056	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C aż do tuż przed użyciem
50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Prezent
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C aż do tuż przed użyciem
1,5 ml Czarne probówki do mikrowirówek	Argos Technologies	T7100BK
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (z aplikacją FRET SE Wizard)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	Oprogramowanie GraphPad, Inc.

Trypsyna /