Artykuł metodologiczny

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

DOI:

10.3791/53914

⸱

21 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research, University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine, University of Salamanca

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnice w aktywności neuroprzekaźników i neuromodulatorów, a co za tym idzie, różne reakcje neuronalne, można znaleźć między znieczulonymi i przytomnymi zwierzętami. W związku z tym potrzebne są metody pozwalające na manipulowanie systemami synaptycznymi u obudzonych zwierząt w celu określenia udziału wejść synaptycznych w przetwarzaniu neuronalnym, na które nie mają wpływu środki znieczulające. W tym miejscu przedstawiamy metodologię budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Łącząc te procedury, przeprowadziliśmy mikrojonoforetyczne zastrzyki gabazyny w celu selektywnego blokowania receptorów GABAA w neuronach dolnego wzgórka myszy z krępowaną głową. Gabazyna z powodzeniem modyfikowała właściwości odpowiedzi neuronalnej, takie jak obszar odpowiedzi częstotliwościowej i adaptacja specyficzna dla bodźca. W ten sposób pokazujemy, że nasze metody są odpowiednie do rejestrowania aktywności pojedynczej jednostki i do analizowania roli określonych receptorów neuroprzekaźników w przetwarzaniu słuchowym.

Głównym ograniczeniem opisanej procedury jest stosunkowo krótki czas nagrywania (~3 godziny), który zależy od poziomu przyzwyczajenia zwierzęcia do sesji nagraniowych. Z drugiej strony, wiele sesji nagraniowych może być wykonanych na tym samym zwierzęciu. Przewagą tej techniki nad innymi procedurami eksperymentalnymi stosowanymi do manipulowania poziomem neuroprzekaźnictwa lub neuromodulacji (takimi jak zastrzyki ogólnoustrojowe lub stosowanie modeli optogenetycznych) jest to, że działanie leku jest ograniczone do lokalnych wejść synaptycznych do docelowego neuronu. Ponadto, produkcja elektrod na zamówienie pozwala na dostosowanie określonych parametrów w zależności od struktury neuronalnej i typu neuronu będącego przedmiotem zainteresowania (takich jak rezystancja końcówki w celu poprawy stosunku sygnału do szumu w nagraniach).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzajemne oddziaływanie pobudzenia i hamowania neuronów ma fundamentalne znaczenie dla przetwarzania informacji sensorycznych1. Wiadomo również, że znieczulenie ma silny wpływ na dynamikę aktywacji kory mózgowej i czasowy wzorzec wejść synaptycznych2,3. Na przykład zaobserwowano, że środki znieczulające zmieniają czas trwania reakcji wywołanych wzrokowo w neuronach korowych3,4. Co więcej, stosunek między pobudzającymi i hamującymi wejściami synaptycznymi jest różny u zwierząt znieczulonych i obudzonych4,5, zmieniając zarówno wskaźniki aktywności wywołanej, jak i spontanicznej6,7. Mierząc przewodnictwa synaptyczne, Haideri współpracownicy odkryli, że hamowanie odpowiadało wzbudzeniu amplitudy w znieczuleniu, podczas gdy podczas czuwania hamowanie było silniejsze niż pobudzenie. Odkrycia te skłaniają do opracowania procedur eksperymentalnych w celu zbadania wpływu określonych sygnałów synaptycznych na przetwarzanie sensoryczne u przebudzonych zwierząt.

Kontrolowane wyrzucanie naładowanych substancji neuroaktywnych poprzez stosowanie małych zastrzyków prądu (rzędu nA) było szeroko stosowane do badania udziału wejść synaptycznych i roli domniemanych receptorów komórkowych w przetwarzaniu sensorycznym8-13. Ta technika, znana jako mikrojonoforeza, pozwala na stosowanie leków w pobliżu zarejestrowanego neuronu, co przyczynia się do szybkiego i ograniczonego efektu. Procedura ta jest bardziej odpowiednia do badania miejscowego działania substancji neuroaktywnych w porównaniu z powszechnym efektem wywoływanym przez inne manipulacje eksperymentalne, takie jak zastrzyki ogólnoustrojowe, mikrodializa lub stosowanie technik optogenetycznych. Zazwyczaj konfiguracja elektrody typu piggy-back14,15 jest używana do jednoczesnego rejestrowania docelowego neuronu i dostarczania interesujących substancji neuroaktywnych. Składa się z elektrody rejestrującej przymocowanej do wielolufowej pipety, która przenosi substancje neuroaktywne. Modyfikacje oryginalnej procedury opisanej przez Haveya i Caspary'ego14 zostały wprowadzone. Na przykład elektroda wolframowa, zamiast szklanej, może być używana do rejestrowania aktywności neuronalnej16. Wcześniej opublikowane metody wytwarzania elektrod wolframowych17,18 obejmują trzy ogólne etapy: wytrawianie elektrolityczne końcówek drutu wolframowego, izolację szkła i dostosowanie ekspozycji końcówki do wymagań zapisu.

Interesującą i odkrytą dziedziną w neuronauce słuchowej jest badanie adaptacji specyficznej dla bodźca (SSA19). SSA to swoiste zmniejszenie odpowiedzi neuronalnej na powtarzające się dźwięki, które nie uogólnia się na inne, rzadko prezentowane dźwięki. Znaczenie SSA polega na jego potencjalnej roli jako mechanizmu neuronalnego leżącego u podstaw wykrywania dewiacji w mózgu słuchowym, a także możliwej neuronalnej korelaty dla późnego komponentu negatywności niedopasowania słuchowego potencjału wywołanego20,21. SSA występuje od IC do kory słuchowej19,22-24. Wykazano, że hamowanie za pośrednictwemGABA A działa jako mechanizm kontroli wzmocnienia na SSA7,16,25, na który, jak wykazano, wpływa również znieczulenie26. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który łączy wcześniej opisane metody rejestrowania jednojednostkowej aktywności neuronów IC przed i w trakcie stosowania selektywnego antagonisty receptorówA GABA u obudzonych myszy. Najpierw opisujemy produkcję elektrod typu piggy-back, a następnie metody chirurgiczne i rejestracyjne. Aby przetestować skuteczność uwalniania leku, porównaliśmy pole recepcyjne, a także poziom SSA neuronów IC przed i podczas mikrojonoforetycznego wyrzutu gabazyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Salamance za zgodą i przy użyciu metod zgodnych ze standardami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Salamance, a także standardami Unii Europejskiej (dyrektywa 2010/63/UE) dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach neurobiologicznych.

1. Elektrody wolframowe

Uwaga: Produkcja elektrod wolframowych opiera się na oryginalnej technice opisanej w Merrill i Ainsworth27 oraz Ainsworth i wsp.28 i wykonywane przy użyciu konfiguracji stacji roboczej opisanej w Bullock i wsp. Rozdział 17.

  1. Do rejestrowania jednojednostkowej aktywności zewnątrzkomórkowej neuronów IC należy użyć elektrod o impedancji końcówki 1,5 - 2,5 MΩ. Tutaj etapy związane z produkcją elektrody wolframowej są opisane tylko pobieżnie, ponieważ szczegółowy opis znajduje się w wyżej wymienionych odniesieniach.
  2. Umieść druty wolframowe w specjalnie skonstruowanym narzędziu do wyrównywania (Rysunek 1A), aby pomóc w ich przycięciu na żądaną długość. Narzędzie do wyrównywania składa się z 30 igieł (25 G) przyklejonych równolegle w odstępach co 2 mm, z ogranicznikiem na jednym końcu, aby ograniczyć długość drutów do ~40 mm. Ostrożnie przymocuj luźne końce drutów taśmą klejącą, a resztę drutu odetnij mocnymi nożyczkami.
  3. Delikatnie pociągnij za taśmę, aby usunąć druty wolframowe z narzędzia do wyrównywania, upewniając się, że wszystkie przewody pozostają przymocowane do taśmy. Zwiń taśmę na polerowany mosiężny trzpień (Rysunek 1B,C), mocno przytrzymując przewody przy wrzecionie, aby zapewnić dobre połączenie elektryczne.
  4. Podłącz wrzeciono do silnika o prędkości 5 obr./min w stacji roboczej i zanurz wystające końcówki drutu w roztworze do trawienia (KNO2, 90 g na 80 ml). Ustawić oś wrzeciona pod kątem 45° w stosunku do powierzchni roztworu do trawienia. Zanurz końcówki przewodów tak, aby ~1/3 przewodów stykało się z roztworem.
  5. Zanurz elektrodę prętową z pręta węglowego w kąpieli trawiącej, aby zamknąć obwód. Użyj szczotki do splotu z miedzi sprężynowej, aby nałożyć wytrawianie na wał wrzeciona, gdy wrzeciono się obraca. Dostosuj prąd przepływający przez elektrody i roztwór trawiący do 250 mA. Zatrzymaj wytrawianie końcówki, gdy prąd spadnie do 200 mA. Końcówki drutu zostaną wytrawione w bardzo cienkich punktach.
  6. Przełóż jeden zaostrzony drut przez płomień, aby usunąć wszelkie pozostałości tłuszczu i kleju. Umieść drut (koniec do przodu) w kapilarze ze szkła borokrzemianowego (1.5 mm OD, 0.86 mm ID) tak, aby jego dolny koniec był zablokowany modeliną. Clamp pipetę pionowo u góry i u dołu. Pociągnij pipetę za pomocą cewki grzewczej (średnica 5 mm, głębokość 5 mm) i zawieszonego tłoka. Gdy drut jest ciągnięty w dół przez ciężar tłoka, stopione szkło tworzy wokół niego bardzo cienką powłokę.
  7. Zdejmij szkło zakrywające końcówkę na ostrym końcu elektrody za pomocą stopionej kulki tetraboranu sodu. Aby uformować kulkę, wymieszaj tetraboran sodu (~0,25 g) z niewielką ilością wody (~0,5 ml) i powoli umieść go na elemencie grzejnym, aż stopi się w kulkę o średnicy ~2 mm. Temperatura elementu grzejnego jest kontrolowana za pomocą potencjometru. Umieść koralik i element grzejny na ramieniu manipulatora przymocowanym do stołu i przesuwaj je, aż koralik zostanie zogniskowany pod mikroskopem w małym powiększeniu.
  8. Przymocuj drut pokryty szkłem do szkiełka i umieść go pod mikroskopem. Przesuń suwak za pomocą stage pokrętła, aż końcówka i koralik tetraboranowy będą ostre. Podgrzej koralik, aż lekko się rozpuści i włóż końcówkę drutu ~10 - 15 μm. Wyłącz potencjometr grzania. Gdy kulka ostygnie, kurczy się i usuwa szkło z końcówki elektrody, odsłaniając znajdujący się pod spodem wolfram. Elektroda wolframowa jest gotowa do użycia.

2. Produkcja szklanych pipet wielobeczkowych

  1. Zabezpiecz końce wielolufowych szklanych kapilar (pięć beczek w konfiguracji H) rurkami termokurczliwymi, aby umożliwić lepszy chwyt zacisków ściągacza i zapobiec pękaniu, a następnie umieść jedną w ściągaczu pionowym.
  2. Aby uzyskać długość końcówki ~15 mm, należy ustawić ściągacz na następujące parametry: Ciepło: 84, Siła magnesu podrzędnego: 49, Siła magnesu głównego: 38. Dostosuj te parametry do konkretnej konfiguracji, a także po wymianie elementu grzejnego.
  3. Pociągnij kapilarę, aby uzyskać dwie pipety z zasłoniętymi końcówkami. Zamontuj pipetę na szkiełku podstawowym z plasteliny i rozbij końcówkę pipety pod mikroskopem, aż średnica zewnętrzna wyniesie ~20 - 30 μm, używając cienkich nożyczek lub kleszczyków lub płaskiej strony skalpela. Jeśli złamana krawędź jest zbyt szorstka, należy ją udoskonalić za pomocą techniki ściegu tetraboranowego opisanej w kroku 1.7.
  4. Umieść elektrodę wolframową (z sekcji 1) w uchwycie wykonanym z igły 20 G na końcu 3-osiowego miniaturowego mikropozycjonera zamontowanego na stoliku mikroskopu. Za pomocą kleszczy zegnij koniec elektrody pod kątem 5 - 10°, ~30 mm od końcówki.
  5. Pod mikroskopem ostrożnie ustaw elektrodę wolframową nad końcówką wielolufową. Po wyrównaniu opuść elektrodę, aż zetknie się z wielolufą, wpasowując się w rowek między dwiema górnymi lufami. Przesuń końcówkę elektrody, aż wystaje ~15 - 20 μm od końcówki wielolufy. Kąt między elektrodą a wielolufową powinien być jak najmniejszy, aby uzyskać lepsze wiązanie i cieńszy zestaw.
  6. Nałóż niewielką kroplę światłoutwardzalnego kleju w odległości ~ 5 mm od końcówek. Uważaj, aby klej nie dotarł do końcówki, aby uniknąć zablokowania kanałów wielolufowych.
  7. Utwardź klej za pomocą lampy LED o niebieskim świetle. W razie potrzeby powtórz nakładanie/utwardzanie kleju, aby uzyskać lepsze wiązanie.
  8. Delikatnie przesuwaj stolik mikroskopu, aż koniec elektrody wolframowej zostanie zwolniony z uchwytu. Zdejmij zestaw typu piggy-back ze zjeżdżalni.
  9. Owiń środkową część elektrody typu piggy-back w krótką rurkę termokurczliwą i nałóż szybko utwardzającą się żywicę epoksydową odpowiednią do szkła, aby dodatkowo przymocować elektrodę wolframową do wielolufy.

3. Leki stosowane w mikrojonoforezie

Uwaga: Leki stosowane do mikrojonoforezy muszą mieć ładunek elektryczny po rozpuszczeniu w wodzie. Należy zapoznać się z literaturą, aby sprawdzić, czy lek, który Cię interesuje, jest odpowiedni do tej procedury. Tutaj opisano procedurę dla gabazyny, antagonisty receptora GABAA.

  1. Przefiltrować wodę destylowaną za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm w celu wysterylizowania wody i upewnienia się, że nie zawiera substancji rozpuszczonych. Przygotuj ~1,000 μl 20 mM gabazyny za pomocą tej destylowanej wody.
  2. Dostosować pH rozcieńczenia do 4 za pomocą 0,2 μm przefiltrowanego NaOH za pomocą elektrody pH z cienką końcówką.
  3. Przechowywać 100 - 200 μl porcji w temperaturze -20 ºC. Rozmrozić w dniu nagrania. Tego dnia, zanim zwierzę zostanie skrępowane, napełnij beczki (3 - 5 μl) elektrody wielolufowej lekami, używając mikrostrzykawki o pojemności 100 μl wyposażonej w elastyczną igłę z tworzywa sztucznego.

4. Chirurgia i wszczepienie szpilki

  1. Przeprowadź eksperymenty na dwóch samcach myszy CBA/J (Mus musculus) o wadze 27 i 30 g. Postępuj zgodnie z procedurami chirurgicznymi i rejestracyjnymi Bryanta i współpracowników29, Portforsa i współpracowników30-32 oraz Duque i Malmierca26.
  2. W dniach poprzedzających operację należy zająć się zwierzętami i przyzwyczaić je do komory rejestracyjnej, pozwalając im na swobodną eksplorację. Wykonuj 3 sesje dziennie, każda trwająca co najmniej 30 minut. W ten sposób zwierzęta będą spokojniejsze i wygodniejsze podczas nagrań.
  3. Znieczulić mysz za pomocą mieszanki ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) wstrzykiwanej domięśniowo. Przy tej dawce zwierzę jest głęboko znieczulone przez około 1 godzinę. W razie potrzeby należy podać dawki uzupełniające w wysokości jednej trzeciej dawki początkowej.
  4. Umieść zwierzę na kocu grzewczym ustawionym tak, aby utrzymywał temperaturę 38 ± 1 ºC i ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie za pomocą dwóch nauszników i pręta do gryzienia. Uważaj, aby nie przebić błony bębenkowej za pomocą nauszników.
  5. Chroń oczy, nakładając kroplę żelu okulistycznego.
  6. Ogol skórę głowy nożyczkami i nałóż powidon-jod w celu dezynfekcji skóry.
  7. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę i cofnąć okostną pokrywającą ciemieniową i bardziej rostralną część kości potylicznych.
  8. Przyklej lekki duraluminiowy słupek (waga ~0,65 g, długość 30 mm, rysunek 2A) z okrągłą i płaską podstawą (średnica 5 mm) na czaszce. Przyklej srebrny drut do środka sztycy, pozostawiając jego końce wolne. Srebrny drut zostanie wykorzystany jako elektroda referencyjna do zapisu elektrofizjologicznego.
  9. Nałóż cienką warstwę światłoutwardzalnego kleju na czaszkę i podstawę słupka głównego. Odczekaj 10 sekund i umieść słupek nad obszarem rostralnym kości ciemieniowych, wzdłuż linii środkowej.
  10. Aby uzyskać skuteczną siłę wiązania, klej należy utwardzić światłem za pomocą źródła niebieskiego światła przez 20 sekund.
  11. Wywierć trzy otwory wokół i za podstawą sztycy za pomocą wiertarki elektrycznej i małego wiertła.
  12. Umieść dwie zegarka (o długości ~2 mm) w wywierconych otworach, aby służyły jako dodatkowe punkty kontaktowe między czaszką a sceną główną. wymagają 11/2 obrotu, aby uzyskać dokładne dopasowanie. Przetestuj za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że nie są poluzowane.
  13. Włóż końcówkę srebrnego przewodu uziemiającego do trzeciego otworu, upewniając się, że styka się z oponą twardą. Nałóż niewielką kroplę wodoodpornego kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować drut do czaszki.
  14. Zastosuj kompozyt światłoutwardzalny, aby wzmocnić połączenie słupka głowy z czaszką. Zakryj podstawę sztycy, dolną część srebrnego drutu i, uważając, aby nie wystawać za lambdę, aby umożliwić dostęp podczas nagrywania. Utwardzać za pomocą źródła światła niebieskiego.
  15. Cofnij mięsień z tyłu szyi w pobliżu jego przyczepu do czaszki. Używając małej trepanacji (o średnicy 2,35 mm), wywierć okrągłe okienko tuż pod szwem lambda i bocznie do linii środkowej, aby odsłonić dolny wzgórek (IC). Gdy brzegi są luźne, podciągnij kość pokrywającą drobną pęsetą. Jeśli wystąpi krwawienie, spłucz je zimnym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby je zatrzymać.
  16. Wykonaj małą (~1 mm szerokości i ~1 mm wysokości) ścianę wokół okna z kompozytu i utwardź ją światłem.
  17. Przykryj odsłoniętą czaszkę i mięsień maścią z antybiotykiem. Następnie zwilż odsłoniętą powierzchnię układu scalonego sterylną solą fizjologiczną i przykryj ją wazeliną, wypełniając studzienkę powstałą po wykonaniu ściany wokół okna nagrywającego.
  18. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie (0,03 mg/kg, rozcieńczony w stosunku 1:10 w jałowym roztworze soli fizjologicznej) jako środek przeciwbólowy.
  19. Trzymaj zwierzę na kocu grzewczym, dopóki się nie obudzi i wróć do klatki w celu odzyskania sił po operacji przez trzy dni przed sesjami nagraniowymi. Zwierzęta domowe w indywidualnej klatce dla szczurów, aby zapobiec czyszczeniu galaretki przez kolegów z klatki, a sztyft dotyka metalowej osłony siatki. Umieść trochę urozmaicenia w klatce, gdy zwierzę jest trzymane pojedynczo. Ponadto codziennie zmieniaj trociny, aby zapobiec infekcji i dokładnie sprawdzaj, czy zwierzę prawidłowo wraca do zdrowia i nie wykazuje żadnych oznak dyskomfortu. Sprawdź również, czy wazelina znajduje się nad oknem nagrywania, chroniąc odsłonięty mózg.

5. Zapis elektrofizjologiczny i mikrojonoforeza

  1. Po powrocie do zdrowia należy dać zwierzęciu czas na przyzwyczajenie się do środowiska nagrywania i skrępowania głowy. Przyzwyczaj zwierzę, mocując sztycę do uchwytu, podczas gdy mysz siedzi na specjalnie wykonanym amortyzowanym piankowym ograniczniku wyrzeźbionym zgodnie z rozmiarem jego ciała (Rysunek 2B). Ograniczy to ruchy myszy i przyczyni się do jej spokoju.
  2. Zacznij od 10-minutowych sesji i stopniowo zwiększaj czas trwania do 120 minut. Podczas sesji nagradzaj zwierzęta słodkimi płynami (mleko skondensowane, rozcieńczone w wodzie w proporcji 30:70) w określonych odstępach czasu33. Później, podczas sesji nagraniowej, daj tę samą nagrodę na początku i na końcu sesji lub gdy żaden neuron nie jest izolowany.
  3. Jeśli zwierzę jest bardzo pobudzone przed zapisem, wstrzyknij łagodną uspokajający acepromazynę (2 mg/kg, dootrzewnowo). W zależności od interesującego układu nerwowego, środek uspokajający może wpływać na wyniki.
  4. Pozwól zwierzęciu swobodnie eksplorować komorę nagraniową przez 5 - 10 minut.
  5. Umieść ciało zwierzęcia w piankowym, specjalnie zaprojektowanym amortyzowanym ograniczniku (Rysunek 2B).
  6. Przymocuj sztycę do uchwytu przymocowanego do ramy stereotaktycznej (Rysunek 2C). To dobry moment, aby dać zwierzęciu płynną nagrodę.
  7. Przykryj ciało zwierzęcia bawełnianym kocem i luźno zapnij go za pomocą plastikowego półcylindra i taśmy klejącej.
  8. Wyjmij wazelinę z okienka nagrywania i spłucz ciepłą sterylną solą fizjologiczną.
  9. Rejestruj aktywność neuronalną i jonoforetyczne zastosowanie gabazyny.
    1. Umieść elektrodę wielolufową na uchwycie, sterowaną przez mikronapęd i podłączoną do mikromanipulatora.
    2. Podłącz przewody do nagrywania za pomocą małych zacisków krokodylkowych. Podłącz dodatni zacisk do końca elektrody wolframowej, a zacisk uziemiający do srebrnego drutu, który styka się z oponą twardą.
    3. Umieść niepowlekany srebrny drut wewnątrz każdej beczki, tak aby jeden koniec stykał się z roztworem, a drugi koniec był dostępny. Podłącz te końce do urządzenia do mikrojonoforezy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Przesuń elektrodę wielolufową, aż końcówka zetknie się z powierzchnią mózgu. Zastosuj ciepłą sterylną sól fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu tkanki mózgowej. W tym momencie zastosuj prąd retencyjny (-10 nA dla gabazyny, sprawdź literaturę dla danego leku), aby uniknąć wycieku leku z końcówki lufy, szukając aktywności pojedynczej jednostki.
    5. Stosuj standardowe techniki izolowania aktywności zewnątrzkomórkowej pojedynczego neuronu. Uzyskaj obszar odpowiedzi częstotliwościowej (FRA) neuronu, tj. kombinację częstotliwości i intensywności zdolną do wywołania odpowiedzi, ponieważ neuron jest wrażliwy na te dźwięki34-36.
    6. Wybierz dwie częstotliwości (f1 i f2), które wywołują podobną szybkość i wzór wypalania. Przedstaw każdą z tych częstotliwości jako rzadki i powtarzający się bodziec zgodnie z dziwacznym paradygmatem.
      Uwaga: W skrócie, w paradygmacie dziwaków, jedna częstotliwość (f1) jest przedstawiana jako bodziec powtarzalny o wysokim prawdopodobieństwie wystąpienia, podczas gdy druga (f2) to rzadko występujący bodziec dewiacyjny, losowo przeplatany między powtarzającymi się. W drugiej dziwacznej sekwencji względne prawdopodobieństwa dwóch bodźców są odwrócone. Szczegóły paradygmatu stymulacji zostały opisane wcześniej22,37.
    7. Uwolnij gabazynę, przesuwając prąd na wartości dodatnie (10 - 20 nA). Ponownie uzyskać FRA i powtórzyć dziwaczny paradygmat pod zastosowaniem gabazyny. Utrzymać wyrzut do momentu zaobserwowania widocznego wpływu na szybkość wypalania; Zwykle trwa to 5 - 20 minut, w zależności od konkretnego leku, jego stężenia i wielkości prądu wyrzutowego. Powtórz protokół zapisu, aby uzyskać wartości pod wpływem leku.
    8. Zatrzymaj wstrzykiwanie, przywracając prąd do wartości przechowywania. Poczekaj, aż efekt leku zmyje się, monitorując, czy FRA lub odpowiedź na dziwaczny paradygmat powraca do wartości kontrolnych.
      Uwaga: Sesje nagraniowe mogą trwać od 2 do 3 godzin dziennie i powinny zostać zakończone wcześniej, jeśli zwierzę wykazuje jakiekolwiek oznaki dyskomfortu lub zmagania się. Podać płyn z nagrodą i przykryć komorę nagraniową wazeliną.

6. Analiza danych

  1. Zmierzyć FRA przed i w trakcie wstrzyknięcia gabazyny, a także poziom SSA.
  2. Określ ilościowo siłę odpowiedzi SSA za pomocą wspólnego wskaźnika SSA (CSI) i wskaźnika SSA specyficznego dla częstotliwości (SI), jak opisano wcześniej19,22,23,38,39. CSI i SI odzwierciedlają znormalizowaną różnicę między reakcją neuronalną na rzadki bodziec a odpowiedzią na powtarzający się. Dodatnie wartości CSI i SI wskazują, że odpowiedź neuronalna (skoki na bodziec) była wyższa lub rzadka niż do powtarzających się tonów.
  3. Porównaj dane z kontroli i stanu wyrzutu leku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarejestrowaliśmy jednojednostkową aktywność 4 dobrze odizolowanych neuronów IC. Typowe stosunki sygnału do szumu uzyskiwane podczas nagrań zewnątrzkomórkowych u obudzonych myszy pokazano na rysunku 3B. Rycina 4A przedstawia obszar odpowiedzi częstotliwościowej (FRA) każdego neuronu przed i podczas blokady receptorówA GABA za pomocą gabazyny. Zaobserwowano wzrost siły odpowiedzi (skoki/bodziec), a także poszerzenie strojenia spektralnego. Przyr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrojonoforeza substancji neuroaktywnych u obudzonych zwierząt jest potężną techniką badania i analizowania roli specyficznych sygnałów synaptycznych w aktywności pojedynczych neuronów40,41. Co ważniejsze, procedura ta pozwala na określenie wpływu neuroprzekaźników i neuromodulatorów na obwody nerwowe bez potencjalnej ingerencji środków znieczulających. Tutaj pokazujemy, że zastosowanie gabazyny w IC obudzonych myszy silnie zmieniło strojenie częstotliwości (Figura 4A), wzorce odpowiedzi czas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został sfinansowany z grantów MINECO BFU201343608-P i PSI2013-49348-EXP, a grant JCYL SA343U14 do podstawowego finansowania MSM i MRC dla ARP. YAA posiadała stypendium CONACyT (216106) i SEP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drut wolframowyHarvard Apparatus LTD33-00990,005 cala x 3 cale
Kapilara ze szkła borokrzemianowego Harvard Apparatus LTD30-0053Standardowa ścianka borokrzemianowa bez żarnika, 1,5 mm OD, 0,86 mm ID, 100 mm długości
Szklane kapilary wielolufowe Światowe instrumenty precyzyjne5B120F-4 Kapilara 5-bębnowa, długość 4 cali, średnica zewnętrzna 1,2 mm, z żarnikiem
DiaplusDiaDent2001-2101Klej światłoutwardzalny, służy do mocowania elektrody wolframowej do szklanej pipety wielolufowej
G-BondGC Corporation2277Klej światłoutwardzalny, służy do mocowania słupka do czaszki zwierzęcia
CharismaHeraeus Kulzer66000087Kompozyt światłoutwardzalny, służy do wzmocnienia połączenia słupka z czaszką
Araldit CristalCeys 2-składnikowyepoksyd, stosowany do dalszego zabezpieczenia mocowania elektrody wolframowej do szklanej pipety wielolufowej
Koc grzewczyCibertecRTC1
Ramka stereotaktycznaNarishigeSR-6NZmodyfikowana dla myszy
Urządzenie mikrojontoforetyczneHarvard Apparatus LTDNeurofor BH-2W zestawie pompy jonoforetyczne IP-2 (po jednej dla każdego kanału dostarczania leku) i moduł balansu
Wielolufowy szklany ściągacz do pipetNarishigeModel PE-21
Lampa LEDTechnofluxCV-2155 W, 430-485 nm
MicroFilWorld Precision InstrumentsMF34G-5Elastyczna igła z tworzywa sztucznego, 34 AWG
ImalgeneMerialKetamine, 100 mg/ml
RompunBayerKsylazyna, 20 mg / ml
Gabazyna / SR-95531SigmaS106Przygotuj ~ 1000 mikro; l 20 mM gabazyny w wodzie destylowanej i dostosować pH do 4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
  2. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  3. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  4. Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
  5. Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
  6. Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
  7. Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
  8. Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
  9. Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
  10. Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
  11. Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
  12. Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
  13. Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
  14. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
  15. Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358(2013).
  16. Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297(2012).
  17. Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
  18. Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
  19. Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
  20. Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
  21. Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111(2014).
  22. Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
  23. Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071(2010).
  24. von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
  25. Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107(2012).
  26. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
  27. Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
  28. Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
  29. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
  30. Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
  31. Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
  32. Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
  33. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
  34. Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
  35. Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
  36. Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
  37. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89(2013).
  38. Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
  39. Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119(2013).
  40. Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
  41. Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
  42. Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
  43. Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
  44. LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
  45. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wzg rze dolnewstrzykni cie gabazynyreceptory GABAaktywno pojedynczych jednostekunieruchomienie g owykonstrukcja elektrody

Powiązane artykuły