Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Podsumowanie

Większość infekcji bakteryjnych wytwarza biofilm. Ze względu na środowisko, w którym działają, bakterie związane z biofilmem są często fenotypowo odporne na leki. Nowe cząsteczki przeciwbakteryjne, które zabijają bakterie w biofilmach, mają zatem wysoki priorytet. Opracowujemy test do szybkiego badania przesiewowego pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych, które są skuteczne w zwalczaniu biofilmów.

Streszczenie

Większość bakterii chorobotwórczych jest w stanie tworzyć biofilmy podczas infekcji, ale ze względu na trudności w manipulowaniu i ocenie biofilmów, zdecydowana większość prac laboratoryjnych jest przeprowadzana na komórkach planktonowych. W tym miejscu opisujemy test biofilmu na płytce kołkowej wykonany z użyciem Staphylococcus aureus. Biofilmy bakteryjne są hodowane na kołkach przymocowanych do 96-dołkowej pokrywy płytki mikromiareczkowej, przemywane przez delikatne zanurzenie w buforze i umieszczane na płytce prowokacyjnej leku. Po późniejszej inkubacji są one ponownie myte i przenoszone na końcową płytkę odzysku, w której fluorescencyjny barwnik rezazuryna służy jako wskaźnik żywotności. Test ten oferuje znacznie zwiększoną łatwość użycia, niezawodność i odtwarzalność, a także bogactwo danych, gdy jest przeprowadzany jako odczyt kinetyczny. Co więcej, test ten można dostosować do średnioprzepustowego podejścia do badań przesiewowych leków, w którym zamiast tego pobierany jest odczyt fluorescencyjny punktu końcowego, co stanowi ścieżkę dla wysiłków związanych z odkrywaniem leków.

Wprowadzenie

Mikroby chorobotwórcze mogą tworzyć biofilmy in vivo, prowadząc do nieostrych przewlekłych infekcji ¹. Zakażenie związane z biofilmem jest poważnym czynnikiem ryzyka procedur medycznych, które obejmują implantację ciał obcych (np. sztucznych protez kości, implantów piersi) lub instalację rurek dotchawiczych lub cewników moczowych ². W tych kontekstach terapia przeciwinfekcyjna jest prawie zawsze konieczna, ponieważ infekcje oparte na biofilmie rzadko są usuwane samodzielnie, nawet u osób immunokompetentnych. Staphylococcus aureus jest jednym z najczęściej obserwowanych patogenów związanych z powikłaniami związanymi z biofilmem występującymi podczas stosowania inwazyjnych wyrobów medycznych ³.

Niestety, sama natura biofilmów jako bariery ochronnej sprawia, że są one bardziej odporne na leczenie niż komórki planktonowe ^1,4, a ocena przewidywanej skuteczności klinicznej jest krytyczną częścią zarówno początkowego rozwoju leku, jak i nadzoru nad opornością na leki. Coraz częściej uznaje się, że warunki laboratoryjne, skoncentrowane na kulturach planktonowych, mogą nie odzwierciedlać wiernie rzeczywistej choroby ⁵. Problem dodatkowo komplikuje fakt, że replikacja fenotypów biofilmu jest trudna, a istniejące modele biofilmu są żmudne i cierpią z powodu dużej zmienności między i wewnątrz testów ⁶. W związku z tym wielu badaczy, z konieczności, domyślnie stosuje testy wrażliwości komórek planktonowych pod kątem wrażliwości na leki, potencjalnie zaniedbując w ten sposób ważny aspekt zjadliwości i choroby bakteryjnej.

Tutaj opisujemy protokół oznaczania bakterii, w szczególności S. aureus, w wcześniej wyhodowanych biofilmach, wykorzystując 96-dołkowy system biofilmu oparty na 96 dołkach ^7,8. Podczas gdy protokół tworzenia i prowokacji biofilmu jest zasadniczo zgodny z zaleceniami producenta, przedstawiamy alternatywną, bogatą w informacje metodologię ilościowego określania żywotności biofilmu po prowokacji. Krótko mówiąc, bakterie są hodowane w płytce kołkowej, gdzie biofilmy tworzą się na wystających kołkach przymocowanych do pokrywy płytki. Po utworzeniu biofilmu kołki delikatnie zanurza się w studzienkach świeżej płytki wypełnionej PBS w celu usunięcia komórek planktonu. Pokrywka kołkowa, z dołączonymi biofilmami, jest przenoszona na nową płytkę prowokacyjną, zawierającą różne stężenia antybiotyków do oznaczenia. Po drugiej inkubacji pokrywki są ponownie usuwane, myte i przenoszone na płytkę regeneracyjną zawierającą barwnik rezazurynowy, gdzie poddawane są końcowej inkubacji. Konwersja resazuryny może być rejestrowana kinetycznie lub traktowana jako odczyt końcowy po określonym okresie rekonwalescencji. Ta oparta na barwniku metoda ilościowego określania żywotności biofilmów różni się znacznie od żmudnej metodologii opartej na zliczaniu CFU (jednostki tworzące kolonie) opisanej w pierwotnym protokole ⁷. Pomiary OD₆₀₀ płytki prowokacyjnej leku i kinetyki konwersji resazuryny służą jako odczyty żywotności odpowiednio komórek planktonu i biofilmu, oferując szybki, wiarygodny, bogaty w informacje i technicznie prosty test na przeżycie biofilmu.

Protokół

1. Inicjacja biofilmu

1. Wyhoduj kulturę organizmu wytwarzającego biofilm w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Zaszczepić szczep Staphylococcus aureus Newman w 10 ml pożywki Muellera-Hintona z bulionu glicerynowego. Wszystkie prace związane z obchodzeniem się z S. aureus należy wykonywać w rękawicach i w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej (100-200 obr./min).
3. Oznacz OD₆₀₀ kultury za pomocą spektrofotometru i standardowej kuwety (długość ścieżki: 1 cm).
4. Obliczyć objętość (V) kultury potrzebną do przygotowania 20 ml inokulum z OD_{600 (inokulum)} 0,1 w pożywce cheleksowanej Roswell Park Memorial Institute (CRPMI)⁹, korzystając ze wzoru: [V = 20 ml*0,1/OD_{600 (kultura)}]
   Uwaga: Odniesienie 9 zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania CRPMI.
   1. Dodać obliczoną objętość kultury (od góry) do probówki wirówkowej i komórek osadu, wirując przez 1 minutę przy 10 000 x g. Aby przygotować inokulum biofilmu, należy odessać zużytą pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml CRPMI.
5. Wlać inokulum do zbiornika o pojemności 25 ml.
6. Ostrożnie zdejmij pokrywkę ze sterylnej 96-dołkowej płytki kołkowej, pociągając ją prosto do góry.
   Uwaga: Należy uważać, aby nie zanieczyścić kołków zwisających z pokrywy. Pokrywę można położyć do góry nogami na czystej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
7. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 200 μl, dodaj 125 μl inokulum do każdej studzienki w rzędach od A do G dolnej płytki.
8. Napełnij 125 μl sterylnego podłoża CRPMI w każdym dołku rzędu H jako kontrolę sterylności.
9. Weź pokrywkę kołka i przytrzymaj ją nad dnem talerza z kołkami skierowanymi w dół. Ostrożnie wyrównaj poszczególne kołki z odpowiednimi dołkami. Unikaj fizycznego kontaktu między płytą a kołkami. Po wyrównaniu ostrożnie opuść pokrywę w dół. Unikaj niewspółosiowości, ponieważ ponowna regulacja wykonana po dotknięciu kołków dolnej płyty może zanieczyścić kontrolę sterylności w rzędzie H.
10. Uszczelnij pokrywkę do płytki folią parafinową, aby zapobiec parowaniu i umieść w zamykanej plastikowej torbie, szczelnie zamykając. Utrzymuj objętość powietrza w worku na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować parowanie.
11. Inkubować bez wytrząsania w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ .
    Uwaga: 48 godzin wzrostu było optymalne dla S. aureus, ale będzie się różnić w zależności od użytego organizmu.
    Uwaga: Chociaż inkubacja statyczna jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji testu, delikatne wytrząsanie z prędkością 150 obr./min na wytrząsarce mikropłytek jest możliwą odmianą, która może zwiększyć tworzenie biofilmu niektórych izolatów S. aureus.

2. Przygotowanie Płytki Wyzwania Biofilmu

1. W dniu, w którym odbywa się wyzwanie dotyczące biofilmu, należy wziąć świeżą 96-dołkową płytkę i dodać 100 μl CRPMI, zrównoważonej do RT, do każdej studzienki w rzędach od B do H. Aby uniknąć niespójnych wyników, należy użyć płytki 96-dołkowej, która może pomieścić 200 μl pożywki, gdy kołki znajdują się w środku, i zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm.
2. Rozcieńczyć oddzielnie do 4 badanych związków w 1,0 ml CRPMI do 2x pożądanego stężenia końcowego, w celu uwzględnienia końcowego rozcieńczenia w kroku 2.7.
   Uwaga: Dobrym punktem wyjścia jest 8-krotne zwiększenie stężenia hamującego komórek planktonowych.
3. Dodać 200 μl związku 1 w studzienkach A1 do A3, związku 2 w studzienkach A4 do A6, związku 3 w studzienkach A7 do A9 i związku 4 w studzienkach A10 do A12.
4. Szeregowo rozcieńczyć badane związki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść 100 μl z rzędu A do rzędu B i wymieszać.
5. W ten sposób kontynuuj przenoszenie 100 μl dobrze do dołka. Wymieszaj po każdym przeniesieniu i zatrzymaj w rzędzie F.
6. Po wymieszaniu wyrzucić 100 μl z rzędu F do pojemnika na odpady. Nie przelewaj żadnych płynów do rzędów G i H.
7. Dodać 100 μl CRPMI do każdego dołka płytki za pomocą pipety wielokanałowej, aby doprowadzić objętość do 200 μl. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z ostatecznym układem płyt.

3. Wyzwanie Biofilmu

1. Dodać 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do świeżej sterylnej płytki 96-dołkowej, która zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm
.
2. Usunąć plastikową torbę i folię parafinową z inkubowanej płytki inicjującej biofilm.
3. Podnieś pokrywę prosto do góry. Unikaj kontaktu kołków z dnem płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie biofilmu. Zachowaj dolną część do późniejszej analizy OD₆₀₀ (patrz 3.8).
4. Spłukać komórki planktonu, umieszczając wieczko kołka na płytce zawierającej PBS (od kroku 3.1). Zanurz kołki na 5 sekund, wyjmij z PBS i zanurz się ponownie, uważając, aby nie uderzyć kołkami o boki studni.
5. Umieść wypłukaną pokrywkę kołka w talerzu wyzywającym. Unikaj niepotrzebnego kontaktu kołków z dolną płytą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie biofilmu, prowadząc do niespójnych wyników.
6. Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść w zamykanej plastikowej torbie, jak opisano w kroku 1.10.
7. Inkubować płytkę bez wstrząsania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
8. Pobrać dolną część płytki inicjującej biofilm z ppkt 3.3. Ponownie zawiesić bakterie w każdym dołku za pomocą pipety wielokanałowej i zmierzyć OD₆₀₀ za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek, aby potwierdzić wzrost występujący we wszystkich studzienkach z wyjątkiem kontroli sterylności w rzędzie H.

4. Oznaczanie biofilmu

1. Użyć czytnika płytek wyposażonego w komorę inkubacyjną i zdolnego do wykonywania odczytów fluorescencji kinetycznej w celu wykrycia konwersji rezazuryny. Skonfiguruj 24-godzinny pomiar fluorescencji kinetycznej przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 590 nm.
2. Ustaw temperaturę komory na 37 °C i odczytuj tabliczkę co 20 minut. Ustaw czytnik płytek na pomiar od spodu płytki zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Przygotować płytkę do mycia, dodając 200 μl PBS za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnej płytki 96-dołkowej.
4. Przygotować pożywkę do odzyskiwania biofilmu, dodając 400 μl 0,8 mg/ml roztworu podstawowego resazuryny do 20 ml pożywki CRPMI do końcowego stężenia 16 μg/ml resazurin.
   Uwaga: Rezazuryna jest znanym środkiem drażniącym skórę. Podczas obsługi używaj fartucha laboratoryjnego, okularów przeciwbryzgowych i rękawiczek. Zastosowano CRPMI jako pożywkę do odzyskiwania biofilmu, ponieważ zapewnia ona najniższy sygnał tła, ale w razie potrzeby można ją zastąpić pożywką Muellera Hintona.
5. Dodać 150 μl pożywki do odzyskiwania biofilmu za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki.
6. Przenieś płytkę prowokacyjną z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie usuń plastikową torbę i folię uszczelniającą.
7. Zdjąć pokrywkę kołka z płytki prowokacyjnej i spłukać komórki planktonowe w PBS, jak opisano w ppkt 3.4. Zachowaj dolną część płytki prowokacyjnej do późniejszej analizy OD₆₀₀ (patrz 4.10).
8. Po wypłukaniu umieść pokrywkę kołka w dnie płytki zawierającej pożywkę do odzyskiwania biofilmu.
9. Owiń bok płyty folią parafinową, uważając, aby nie zasłaniać dna studzienek obwodowych. Natychmiast po owinięciu płytki należy umieścić ją na czytniku płytek i rozpocząć odczyt kinetyczny w ciągu 24 godzin, inicjując wcześniej wykonany protokół kinetyczny reazuryny od kroku 4.1.
10. Aby określić ilościowo wzrost komórek planktonowych, który może, ale nie musi wystąpić podczas prowokacji, odczytaj OD₆₀₀ całego dna płytki prowokacyjnej za pomocą czytnika mikropłytek. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w kroku 3.8.
    Uwaga: Ostrożnie ponownie zamieszaj zawartość każdej studzienki, ponieważ komórki zrzucające biofilm mają tendencję do wzrostu w kępach na dnie studzienki. Wszelkie pęcherzyki w studni będą silnie zakłócać odczyty OD₆₀₀ i należy ich unikać lub usunąć przed odczytem.

Wyniki

Test z rezazuryną jest wystarczająco czuły, aby wiarygodnie wykryć bardzo niewielką liczbę żywych komórek zdolnych do replikacji w pożywce wolnej od leku po ekspozycji. W tej metodologii minimalne stężenie eradykujące biofilm definiujemy jako najniższe stężenie, przy którym nie obserwuje się konwersji rezazuryny w ciągu 24 hr. Test z rezazuryną opiera się na cząsteczkach utleniających występujących w metabolicznie aktywnych komórkach, które zmieniają kolor barwnika z niebieskiego na różow...

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy zmodyfikowany test biofilmu do określania aktywności badanych inhibitorów na biofilmy S. aureus, koncentrując się na stanie metabolicznym komórek związanych z biofilmem. Podczas gdy opisane procedury inicjacji i prowokacji biofilmu w większości naśladowały zalecenia producenta, zastosowanie barwnika resazuryny do wykrywania i ilościowego oznaczania komórek związanych z biofilmem, które przetrwały 24-godzinną prowokację inhibitorem, znacznie upraszcza zalecaną procedurę odzyskiwania komór...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 średni cheleks przez 1 godzinę z żywicą Chelex 100, a następnie uzupełniony 10% niecheleksedem RPMI-1640
Żywica Chelex 100	Bio Rad	142-2822
MBEC-płytki	Innovotech	19111
Resazurin Sól sodowa	Sigma	R7017	800 µ g/ml w wodzie DI        Sterylna
platforma do wytrząsania mikropłytek z filtrem	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Czytnik płytek	Oprogramowanie Biotek
Gen5	Biotek		Rejestracja i analiza konwersji resazuryny
Neocuproine	Sigma	N1501	przygotować 10 mM zapasu w 100% etanolu, przechowywać w temperaturze -80 º C
Siarczan miedzi	Acros Organics	7758-99-8	przygotować 100 mM roztwór podstawowy w wodzie, przechowywać w temperaturze 4 º C
Cu-Neocuproine	Self-Made		Wytwarzany przez zmieszanie równych molowców neokuproiny i siarczanu miedzi. Mieszaninę rozcieńczono w pożywce CRPMI do pożądanego stężenia.
Gentamycyna	Sigma	G3632-1G