Artykuł metodologiczny

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

DOI:

10.3791/53933

⸱

8 maja 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane jest uważane za zapalną chorobę autoimmunologiczną, która charakteryzuje się powstawaniem zmian w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), co skutkuje upośledzeniem funkcji poznawczych i motorycznych. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest użytecznym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego, ponieważ charakteryzuje się również powstawaniem zmian w OUN, upośledzeniem motorycznym, a także jest napędzane reakcjami autoimmunologicznymi i zapalnymi. Jeden z modeli EAE jest indukowany peptydem pochodzącym z białka oligodendrocytów mieliny (MOG)35-55 u myszy. U myszy EAE rozwija się postępujący przebieg choroby. Ten kurs jest podzielony na trzy fazy: fazę przedkliniczną (dzień 0 - 9), początek choroby (dzień 10 - 11) i fazę ostrą (dzień 12 - 14). SM i EAE są indukowane przez autoreaktywne limfocyty T, które infiltrują OUN. Te limfocyty T wydzielają chemokiny i cytokiny, które prowadzą do rekrutacji kolejnych komórek odpornościowych. W związku z tym zbadano rozmieszczenie komórek odpornościowych w rdzeniu kręgowym podczas trzech faz choroby. Aby podkreślić punkt czasowy choroby, w którym rozpoczyna się aktywacja/proliferacja/akumulacja limfocytów T, limfocytów B i monocytów, oceniono również rozmieszczenie komórek odpornościowych w węzłach chłonnych, śledzionie i krwi. Ponadto określono poziomy kilku cytokin (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFα, IFNγ) w trzech fazach choroby, aby uzyskać wgląd w procesy zapalne choroby. Podsumowując, dane stanowią przegląd profilu funkcjonalnego komórek odpornościowych podczas patologii EAE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane (MS) i odpowiadający mu model zwierzęcy, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), wykazują autoimmunologiczne zmiany w zapaleniu układu nerwowego (OUN). Wcześnie aktywne zmiany chorobowe SM i EAE charakteryzują się obecnością naciekających komórek odpornościowych. Etiologia stwardnienia rozsianego pozostaje nieznana, ale powszechnie uważa się, że wiąże się to z niszczeniem mieliny za pośrednictwem autoreaktywnych limfocytów T. Te autoreaktywne limfocyty T wydzielają prozapalne cytokiny i chemokiny, które przyciągają z krążenia inne komórki odpornościowe, takie jak limfocyty B, monocyty i neutrofile. Monocyty różnicują się w makrofagi. Interferon gamma (IFNγ) wydzielany przez autoreaktywne limfocyty T polaryzuje makrofagi w makrofagi prozapalne. Prozapalne makrofagi uwalniają cytokiny i reaktywne formy tlenu, które sprzyjają apoptozie w oligodendrocytach. Śmierć oligodendrocytów prowadzi do demielinizacji. Ponadto limfocyty B różnicują się w komórki plazmatyczne i uwalniają autoprzeciwciała przeciwko osłonce mielinowej, co ostatecznie prowadzi do degradacji mieliny. Utrata mieliny prowadzi do degradacji aksonów i neuronów, a tym samym do powstawania miejsc zmian chorobowych w OUN, które stanowią główną cechę MS1. Na obrzeżach limfocyty T i limfocyty B są aktywowane w węzłach chłonnych, namnażają się w śledzionie i migrują przez krążenie do ośrodkowego układu nerwowego. Monocyty i neutrofile namnażają się w szpiku kostnym, a także migrują przez krążenie do ośrodkowego układu nerwowego.

Wynaczynienie leukocytów ze szpiku kostnego, śledziony i węzłów chłonnych do krwi lub z krwiobiegu do OUN jest procesem wieloetapowym, który zależy od kilku czynników, w tym od interakcji molekularnych między leukocytami a śródbłonkiem, w których pośredniczą chemokiny i receptory chemokin. Wytwarzanie chemokin przez różne typy komórek może być indukowane podczas reakcji immunologicznej przez cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNFα), IFNγ i interleukina-6 (IL-6), która następnie rekrutuje komórki odpornościowe do miejsca zapalenia2,3. Komórki odpornościowe prezentują podzbiór receptorów chemokinowych na swojej powierzchni, w zależności od typu komórki i szlaku migracji do miejsca zapalnego. Tak więc CXCR2, CCR1 i CXCR1 ulegają ekspresji na dojrzałych neutrofilach w szpiku kostnym i krwi4, a wiązanie jego ligandów, odpowiednio CXCL2, CCL5 lub CXCL6, aktywuje neutrofile i sprzyja ich przyleganiu do śródbłonka, a następnie migracji komórek do tkanek5-9. CCL2 i CCL20 przyciągają monocyty i komórki Th1 / Th1710, które eksprymują odpowiednio CCR211 i CCR612. CCR1 i CCR5, wyrażane przez różne typy komórek, w tym limfocyty T, monocyty i makrofagi13, wiążą CCL3, CCL5 i CCL7 i są regulowane w górę podczas MS14. CXCR3 ulega ekspresji na limfocytach T i wiąże CCL9, CCL10 i CCL1115.

Jedną z głównych strategii w leczeniu SM jest wyczerpanie komórek odpornościowych lub zapobieganie infiltracji komórek odpornościowych do OUN. W związku z tym w EAE badano blokadę specyficznych receptorów chemokin. Antagonizm lub delecja genetyczna CCR116, CCR217, CCR718 lub CXCR219 zmniejsza patologię EAE, podczas gdy antagonizm lub delecja genetyczna CCR120, CCR520 lub CXCR321 nie zmniejsza patologii. W związku z tym ekspresja specyficznych receptorów chemokinowych na leukocytach ma kluczowe znaczenie dla infiltracji tych ostatnich do OUN i dyktuje przebieg EAE.

Wyczerpanie komórek odpornościowych jest skuteczną strategią leczenia dla pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, ponieważ infiltrowane komórki odpornościowe uwalniają cytokiny, takie jak TNFα, IL-6 i IL-1β, które z kolei promują proces zapalny lub degradację neuronów22. Ponadto autoreaktywne komórki Th1 uwalniają IFNγ, który z kolei stymuluje makrofagi do uwalniania TNFα, IL-1β i IL-23.

Ten manuskrypt opisuje indukcję EAE, określenie rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin (mRNA) w różnych tkankach u myszy EAE. Komórki izolowano w różnych momentach przebiegu choroby, aby zapewnić zależny od czasu przegląd procesów zapalnych, które ostatecznie prowadzą do powstania zmian w OUN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Nasze procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komisję Etyki Regierungspräsidium Darmstadt (Niemcy) i potwierdzają przepisy krajowe i europejskie. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

1. Model EAE

  1. Wprowadzenie modelu EAE
    1. Do indukcji EAE należy użyć 10- do 13-tygodniowych samic myszy 129S4/SvJae×C57BL/6.
    2. Podać myszom podskórne wstrzyknięcie w górną i dolną część pleców encefalitogennego peptydu MOG35 - 55 (glikoproteina mielinowa oligodendrocytów) (200 μg), zemulgowanego w 200 μl kompletnego adiuwantu Freunda (CFA) zawierającego 400 μg Mycobacterium tuberculosis.
      Uwaga: Jako ujemną, niewywołującą choroby kontrolę pozorowaną, można zastosować niekompletny adiuwant Freunda zawierający Mycobacterium tuberculosis, w tej samej objętości i tą samą drogą.
    3. Następnie, i ponownie 24 godziny później, należy podać myszom dootrzewnowe wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (w sumie 0,2 μg, rozcieńczonej w 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, PBS). Użyj nieleczonych myszy jako grupy kontrolnej, aby móc porównać chore ze zdrowymi zwierzętami.
      Uwaga: Możliwe jest również wywołanie EAE za pomocą 200 - 300 μg peptydu MOG35 - 55, 300 - 500 μg Mycobacterium tuberculosis w CFA i 0,2 - 0,3 μg toksyny krztuścowej w objętości 0,1 - 0,2 ml na wstrzyknięcie.
    4. Począwszy od tygodnia po wstrzyknięciu, należy codziennie badać myszy pod kątem objawów klinicznych (patrz krok 1.2.1)
      Uwaga: Dzień wystąpienia choroby różni się w różnych eksperymentach, ale w warunkach panujących w naszym laboratorium jest to około 11 dnia, a zatem tutaj dzień 14 definiuje się jako 3 dni po wystąpieniu choroby. U wszystkich myszy w niniejszym badaniu wystąpiły objawy kliniczne.
  2. Punktacja myszy
    1. Sklasyfikuj objawy kliniczne według wyników klinicznych w następujący sposób: 0) brak objawów, 0,5) porażenie dystalne ogona, 1) całkowity paraliż ogona, 1,5) utykanie ogona i łagodne osłabienie tylnych nóg, 2) wiotki ogon i silne osłabienie tylnych nóg, 2,5) wiotki ogon i paraliż jednej tylnej nogi, 3) wiotki ogon i paraliż obu tylnych nóg, 3.5) paraliż obu kończyn tylnych i osłabienie jednej kończyny przedniej (myszy osiągające ten wynik zostały poddane eutanazji, zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi).

2. Przygotowanie pojedynczych komórek do analizy cytometrii przepływowej

Uwaga: Mieszanina przeciwciał składa się z 1 μl CD45-Vioblue, 2 μl CD8-eFluor650, 0,5 μl CD11b-eFluor605, 0,5 μl F4/80-PE-Cy7, 1 μl CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 μl CD11c-AlexaFluor700, 1 μl CD19-APC-H7 i 1 μl Ly6G-APC-Cy7.

Uwaga: Jeśli pobierasz krew, węzły chłonne, śledzionę i rdzeń kręgowy, procedura jest następująca: Myszy są głęboko znieczulone kombinacją izofluranu (2% karbogenu na minutę) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała). Następnie otwórz klatkę piersiową, usuń krew za pomocą patyczka wewnątrzsercowego i wykonaj perfuzję myszy śródsercowo za pomocą zimnego PBS. Następnie usuń węzły chłonne, następnie śledzionę, a na końcu rdzeń kręgowy. Jeśli nie ma potrzeby perfuzji dosercowej myszy, należy je poddać eutanazji w głębokim znieczuleniu przez zwichnięcie szyi.

  1. Izolacja splenocytów
    1. Znieczulenie myszy kombinacją izofluranu (2% karbogenu na minutę) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała).
    2. Zwilż obszar nacięcia 80% izopropanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia włoskami i otwórz klatkę piersiową wzdłużnie, bez nakłuwania głębszych tkanek, za pomocą nożyczek.
    3. Perfuzja myszy śródsercowo z zimnym PBS pH 7,023,
      Uwaga: Śledziona znajduje się w lewym górnym kwadrancie brzusznym pod klatką piersiową. Jeśli badana ma być tylko śledziona, narząd ten może zostać usunięty przed perfuzją, aby zachować wszystkie typy komórek będących przedmiotem zainteresowania.
    4. Usuń śledzionę i odetnij około 1/8 i zważ ją. Przechowywać próbkę w PBS na lodzie.
    5. Przecisnąć tkankę śledziony przez sito o oczkach 70 μm (umieszczone na probówce o pojemności 50 ml) za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml.
    6. Umyj siatkę 5 ml PBS. Wirować przy 1 800 x g przez 3 min. Zawiesić osad w 500 μl roztworu lizyjącego.
      Uwaga: Na tym etapie może być konieczne wykonanie różnicowego zliczania komórek, jeśli później stosowana jest alternatywna metoda analizy FACS, która nie wykorzystuje kulek (patrz sekcja 3).
    7. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) i dodać 500 μl PBS. Wirować przez 6 minut przy 650 x g w temperaturze pokojowej (RT).
    8. Powtórzyć etap mycia z 500 μl PBS. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS, dodać 2 μl buforu blokującego receptor Fc-1 (FcRI) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    9. Dodać 13 μl mieszaniny przeciwciał, inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, dodać 500 μl PBS i wirować przez 6 minut przy 650 x g przy suchej smosji. Odrzucić supernatant.
      Uwaga: Procedura barwienia producenta zaleca pojedyncze pranie, ale dodatkową redukcję zabrudzeń tła można uzyskać, opcjonalnie powtarzając krok prania jeszcze raz lub dwa razy.
    10. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS (lub ewentualnie w buforze do separacji białek, aby potencjalnie zmniejszyć zlepianie się komórek) i przenieść go do probówki cytometrii przepływowej. Utrzymuj komórki na lodzie.
  2. Izolacja komórek węzłów chłonnych
    1. Znieczulenie myszy kombinacją izofluranu (2% karbogenu na minutę) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała).
    2. Zwilż miejsce nacięcia 80% izopropanolem i otwórz klatkę piersiową wzdłużnie za pomocą nożyczek. Perfuzja myszy dosercowo z zimnym PBS pH 7,023.
    3. Aby wyizolować pachwinowy węzeł chłonny, ostrożnie usuń skórę w okolicy biodra i ostrożnie wydłub węzeł chłonny z tkanki tłuszczowej za pomocą kleszczy. Zważyć pachwinowy węzeł chłonny i przechowywać próbkę w PBS na lodzie.
      Uwaga: W naszych badaniach używaliśmy pachwinowych węzłów chłonnych, ponieważ O'Connor i wsp. stwierdzono, że duża liczba aktywowanych monocytów, makrofagów, neutrofili i limfocytów T była obecna w pachwinowych węzłach chłonnych po indukcji EAE24.
    4. Przecisnąć węzeł chłonny przez sito o oczkach 70 μm (umieszczone na probówce o pojemności 50 ml) za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml.
    5. Umyj siatkę 5 ml PBS. Wirować przy 2.400 x g przez 8 min. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 0,2% BSA/PBS, dodać 2 μl buforu blokującego FcRI i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Dodać 13 μl mieszaniny przeciwciał, inkubować 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności, dodać 500 μl PBS i wirować przez 6 minut przy 650 x g w stężeniu sotum.
    7. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl PBS (lub odpowiednim buforze do pracy) i przenieść go do probówki do cytometrii przepływowej.
  3. Izolacja komórek krwi
    1. Dodać 50 μl 20 mM HEPES do 50 μl krwi (stabilizowanej EDTA) i dodać 500 μl roztworu lizyzowego. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodać 500 μl PBS. Wirować przez 6 minut przy 650 x g przy suchej temperaturze względnej. Odrzucić supernatant i powtórzyć etap płukania.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl 0,2% BSA/PBS, dodać 2 μl buforu blokującego FcRI i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Dodać 13 μl mieszaniny przeciwciał, inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, dodać 500 μl PBS i wirować przez 6 minut przy 650 x g przy smo s. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl PBS i przenieść go do probówki cytometrii przepływowej.
  4. Izolacja komórek rdzenia kręgowego
    1. Znieczulenie myszy kombinacją izofluranu (2% karbogenu na minutę) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała).
    2. Zwilż miejsce nacięcia 80% izopropanolem i otwórz klatkę piersiową wzdłużnie za pomocą nożyczek. Perfuzja myszy dosercowo z zimnym PBS pH 7,023.
    3. Zwilż obszar nacięcia na plecach i ponownie wykonaj podłużne cięcie skalpelem i usuń skórę.
    4. Wytnij lędźwiową część kręgosłupa (która unerwia kończyny tylne) i przepłucz ją strzykawką wypełnioną PBS, aby usunąć rdzeń kręgowy. Odciąć około 1/3 rdzenia lędźwiowego, zważyć go i przechowywać próbkę w PBS na lodzie.
    5. Wirować przy 250 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, dodać 500 μl roztworu do oddzielania komórek i HBSS (1:1). Dodać 3 mg/ml kolagenazy A i 1 jednostkę/ml DNazy I, zdekoltować komórki przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół i inkubować przez 30 minut z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 400 obr./min.
      Uwaga: Jeśli jest to preferowane, zawiesinę komórek można oczyścić z zanieczyszczającej mieliny i resztek komórkowych poprzez wirowanie w gradiencie gęstości, co może poprawić czułość pomiaru cytometrii przepływowej, zmniejszając w ten sposób autofluorescencję tła i liczbę zdarzeń, które należy uzyskać (patrz punkt 3.5).
    6. Wirować przy 250 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS)/minimalnej pożywki (DMEM) Dulbecco i ponownie zdekoltować komórki, powtarzając pipetowanie w górę i w dół.
    7. Wirować przy 250 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap mycia.
    8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS i przecisnąć rdzeń kręgowy przez sito o oczkach 70 μm (umieszczonym na probówce o pojemności 50 ml) za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 2 ml.
    9. Umyj siatkę 4 ml PBS. Wirować przy 1 800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl 0,2% BSA/PBS, dodać 2 μl odczynnika blokującego FcRI i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    10. Dodać 13 μl mieszaniny przeciwciał, inkubować 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności, dodać 500 μl PBS i wirować przez 6 minut przy 650 x g w stężeniu sotum.
    11. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS (lub odpowiednim buforze do pracy) i przenieść go do probówki do cytometrii przepływowej.

3. Analiza cytometryczna przepływowa

  1. Należy wcześniej miareczkować wszystkie przeciwciała, aby określić optymalne stężenia, jak opisano przez Olescha i wsp.Lokal mieszkalny 25.
  2. Użyj koralików kompensacyjnych wychwytywania przeciwciał do kompensacji jednego koloru, aby utworzyć wielokolorowe matryce kompensacyjne zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Codziennie kontroluj kalibrację przyrządu za pomocą specjalnych koralików zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Bezpośrednio przed pomiarem cytometrii przepływowej dodać do komórek wzorzec bezwzględnej liczby 30 μl cytometrii przepływowej (w celu izolacji, patrz sekcja 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) w celu wyznaczenia bezwzględnej liczby komórek. Zamiast używać koralików do liczenia, komórki można policzyć.
  5. Pobrać próbki (komórki ze śledziony, węzłów chłonnych i krwi: 100 000 zdarzeń, rdzeń kręgowy: 500 000 zdarzeń) do cytometru przepływowego i przeanalizować za pomocą specjalnego oprogramowania do cytometrii przepływowej.
    1. Otwórz oprogramowanie do cytometrii przepływowej i dodaj fcs 3.0 files, naciskając przycisk "dodaj próbki".
    2. Otwórz dodany plik, klikając dwukrotnie. Dostosuj kanały dla osi x i y. Aby wybrać interesujące nas populacje komórek, utwórz bramkę (patrz rysunek 4).

4. Ilościowa analiza PCR

  1. Izolacja mRNA i transkrypcja do cDNA
    1. Wyekstrahuj mRNA z lędźwiowego rdzenia kręgowego (1/3), śledziony (1/8) i pachwinowych węzłów chłonnych za pomocą fenolu-chloroformu i wytrój etanolem26.
      1. W tym celu homogenizować tkankę w 1 ml mieszaniny tiocyjanianu guanidyny i fenolu, inkubować przez 10 minut. Dodać 200 μl chloroformu i ponownie inkubować przez 10 minut.
      2. Po etapie wirowania (18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C) przemyć górną fazę wodną 500 μl izopropanolu i odwirować (18 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C).
      3. Umyć granulat 500 μl etanolu i po odwirowaniu (18 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C) wysuszyć granulat w koncentratorze próżniowym (5 min w temperaturze 30 °C). Następnie ponownie zawiesić granulat w 30 μl wody.
    2. Aby wyekstrahować mRNA z krwi, odwirować 500 μl krwi stabilizowanej EDTA (300 x g 10 min 4 °C).
      1. Weź kożuchową sierść zawierającą białe krwinki i rozcieńczyć w 1 ml roztworu lizującego (150 mM NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4).
      2. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej należy odwirować komórki przy stężeniu 650 x g przez 6 minut, a następnie dwukrotnie przepłukać PBS.
      3. Ekstrahuj mRNA z białych krwinek (WBC) za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Przeprowadź syntezę cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zawierającego losowe heksamery, zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 200 ng mRNA do syntezy cDNA.
  2. Ilościowy PCR
    1. Aby określić ilościowo ilość określonego mRNA, użyj 1 μl cDNA, 1 μM startera do przodu/do tyłu i fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA zgodnie z instrukcjami producenta27. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami zestawów starterów. Zmierz wartości CT IL-1β, IL-6, IL-23, IFNγ, TNFα i PPIA (izomeraza peptydyloprolilowa) za pomocą ilościowego systemu PCR.
    2. Aby określić względną ekspresję mRNA, należy użyć metody porównawczej CT (próg cyklu)27.
      1. W tym celu należy znormalizować wartości CT docelowych genów do poziomów ekspresji PPIA, odejmując średnią wartość CT PPIA od genu docelowego, jak opisano w poprzednich badaniach (Barthelmes i wsp.28, Schiffmann i wsp. 29, Schiffmann i wsp. 30). Następnie należy obliczyć tak zwane wartości ΔΔCT, za pomocą których normalizuje się wartości ΔCT docelowych genów myszy EAE do poziomu ekspresji docelowych genów myszy nieleczonych, ponownie poprzez odjęcie średniej wartości ΔCT u myszy nieleczonych od wartości ΔCT u myszy EAE.
      2. Aby uzyskać względną ekspresję mRNA docelowego genu, oblicz stosunek za pomocą następującego wzoru: 2-ΔΔct.
  3. Przetestuj specyfikę każdego startera. Określ wielkość wzmocnionego fragmentu za pomocą 2% żelu agarozowego31. Rozmiar fragmentu przedstawiono w tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd różnych metod opisanych w tym artykule. 1) Myszy otrzymują wstrzyknięcie antygenu MOG35-55 i rozwijają początkowe objawy kliniczne po 10,7 ± 0,3 dniu28. Reprezentatywny przebieg choroby myszy EAE przedstawiono na rysunku 1. 2) Różne tkanki (śledziona, węzły chłonne, rdzeń kręgowy lędźwiowy) i krew są pobierane od myszy kontrolnych i EAE w różnych punktach c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj model EAE zyskał najwięcej uwagi jako model stwardnienia rozsianego i jest rutynowo stosowany w testowaniu strategii terapeutycznych dla stwardnienia rozsianego32. Choroba myszy wykazuje wiele cech klinicznych i histologicznych stwardnienia rozsianego i jest spowodowana indukcją autoimmunizacji antygenów neuronalnych. Uczulenie na antygeny mielinowe wiąże się z dysfunkcją bariery krew-mózg, a tym samym infiltracją komórek odpornościowych do OUN. Nasze odkrycia pokazują, że komórki odpornościowe p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJP jest konsultantem firm Xellia i Leo Pharmaceuticals.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grupę Szkoleniową Fundacji Else Kröner-Fresenius (EKFS) Research Training Group - Pharma (TRIP) oraz przez "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" z kraju związkowego Hesja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System detekcji sekwencji ABI Prism 7500 Applied Biosystems, Austin, Stany Zjednoczoneilościowy system PCR
AccutaseSigma Aldrich Monachium, NiemcyA6964roztwór do odrywania komórek
CD3-PE-CF594BD, Heidelberg, Niemcy562286
CD4-V500BD, Heidelberg, Niemcy560782
CD8-eFluor650eBioscience, Frankfurt, Niemcy95-0081-42
CD11b-eFluor605eBioscience, Frankfurt, Niemcy93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, Heidelberg, Niemcy560583
CD19-APC-H7 BD, Heidelberg, Niemcy560143
CD45-Vioblue Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130-092-910
CompBeadsBD, Heidelberg, NiemcyKoraliki kompensacyjne552843
Collagenase ASigma Aldrich Monachium, NiemcyC0130
Cytometryczny wzorzec zliczania bezwzględnego Polyscience, Eppelheim, NiemcyBLI-580-10
Konfiguracja cytometru i śledzenie koralików BD, Heidelberg, Niemcy642412
DNase ISigma Sigma Aldrich Monachium, NiemcyD5025
EAE KitHooke Laboratories, Lawrence, USAEK2110
F4/80-PE-CY7 BioLegend, Fell, Niemcy123114
zestaw do syntezy cDNA z pierwszą nicią Thermo Scientific, Schwerte, NiemcyF1612
Fc-1 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy130-092-575
Cytometryczny wzorzec bezwzględny cytometrii przepływowejPolyscience, Eppelheim, Niemcy580
Oprogramowanie FlowJo v10 Treestar, Ashland, USAoprogramowanie do cytometrii przepływowej
LSRII/Fortessa BD, Heidelberg, Niemcycytometr przepływowy
Ly6G-APC-Cy7 BD, Heidelberg, Niemcy560600
Roztwór do lysingu BD, Heidelberg, Niemcy349202
Maxima SYBR Green Thermo Scientific, Schwerte, NiemcyK0221fluorescencyjny barwnik wiążący DNA 
Zestaw RNeasy Mini Qiagen, Hilden, Niemcy74104Zestaw do ekstrakcji RNA
Bufor blokujący receptor

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409(2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187(2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136(2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisMultiple Sclerosis ModelMyelin Oligodendrocyte GlycoproteinComplete Freunds AdjuvantPertussis Toxin InjectionLymph Node IsolationSpinal Cord DissectionSpleen Immune CellsFlow Cytometry AnalysisCytokine Expression Analysis

Powiązane artykuły