Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Podsumowanie

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Streszczenie

Rośnie uznanie dla roli społeczności mikrobiologicznych jako krytycznych modulatorów ludzkiego zdrowia i chorób. Technologie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości pozwoliły na szybką i wydajną charakterystykę społeczności bakteryjnych przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA z różnych źródeł. Chociaż łatwo dostępne narzędzia do analizy sekwencji 16S rRNA mają ustandaryzowane przepływy pracy obliczeniowej, przetwarzanie próbek do ekstrakcji DNA pozostaje ciągłym źródłem zmienności między badaniami. Tutaj opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wacików. Opisujemy również dalsze metody sekwencjonowania genów 16S rRNA, w tym generowanie bibliotek sekwencjonowania, kontrolę jakości danych i analizę sekwencji. Przepływ pracy może pomieścić wiele typów próbek, w tym kał i wymazy pobrane z różnych lokalizacji anatomicznych i gatunków gospodarzy. Ponadto odzyskane DNA i RNA można rozdzielić i wykorzystać do innych zastosowań, w tym sekwencjonowania całego genomu lub sekwencjonowania RNA. Opisana metoda pozwala na wspólne podejście do przetwarzania dla wielu typów próbek i umożliwia dalszą analizę informacji genomicznych, metagenomicznych i transkrypcyjnych.

Wprowadzenie

Dolny drogi rodne, układ pokarmowy, drogi oddechowe i skóra człowieka są skolonizowane przez złożone społeczności bakteryjne, które są kluczowe dla utrzymania homeostazy tkanek i wspierania zdrowia gospodarza¹. Na przykład niektóre pałeczki kwasu mlekowego tworzą nieprzyjazne środowisko dla patogenów, zakwaszając sklepienie pochwy, wytwarzając efektory przeciwdrobnoustrojowe i modulując lokalną odporność gospodarza^2-4. Rosnące uznanie dla znaczenia mikrobiomu bakteryjnego spowodowało również wzrost zainteresowania charakteryzowaniem społeczności bakteryjnych w wielu kontekstach klinicznych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu mikrobiomu bakteryjnego na podstawie wymazów z narządów płciowych. Protokół można łatwo zmodyfikować w przypadku próbek kału i wymazów pobranych z innych lokalizacji anatomicznych i innych gatunków gospodarzy.

Ze względu na nieodłączne ograniczenia w liczbie próbek, które mogą być pobrane i przechowywane od danego uczestnika badania, protokół ten został zaprojektowany tak, aby ekstrahować DNA, RNA, a potencjalnie nawet białko z pojedynczego wymazu przy użyciu zaadaptowanej metody ubijania koralików opartej na fenolu i chloroformie^5,6. Połączenie fizycznego rozerwania ścian komórkowych bakterii z biciem kulek i rozerwaniem chemicznym za pomocą detergentów umożliwia szybką lizę bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i kwasoodpornych bez dodatkowych etapów trawienia enzymatycznego. W celu uzyskania wysokiej jakości RNA zaleca się stosowanie suchych wacików, które były przechowywane w temperaturze 4 °C lub niższej bezpośrednio po pobraniu i podczas transportu do laboratorium (jeśli dotyczy) oraz przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C.

Aby określić mikrobiom bakteryjny w danej próbce, procedura ta wykorzystuje sekwencjonowanie amplikonów genu 16S rRNA, które jest obecnie najbardziej opłacalnym sposobem kompleksowego przypisywania taksonomii bakterii i przeprowadzania względnej kwantyfikacji. Alternatywne metody obejmują celowany qPCR⁷, niestandardowe mikromacierze⁸ i sekwencjonowanie całego genomu⁹. Gen 16S rRNA zawiera dziewięć hiperzmiennych regionów i nie ma zgody co do optymalnego regionu V do sekwencjonowania w badaniach mikrobiomu pochwy. Tutaj używamy zestawu starterów 515F/806R i budujemy na rurociągu zaprojektowanym przez Caporaso i wsp.^10-12. Caporaso i wsp.Zestaw starterów 515F/806R umożliwia multipleksowanie setek próbek w jednym cyklu sekwencjonowania dzięki dostępności tysięcy zweryfikowanych starterów z kodami kreskowymi i kompatybilności z platformami sekwencjonowania Illumina. W przeciwieństwie do zestawu starterów 27F/338R¹³ opracowanego przez Human Microbiome Project, 515F/806R skutecznie wzmacnia również Bifidobacteriaceae, a tym samym dokładnie wychwytuje Gardnerella vaginalis, ważnego członka społeczności mikrobiologicznej pochwy u niektórych kobiet. Alternatywnie, para starterów 338F/806R została z powodzeniem wykorzystana do pirosekwencjonowania próbek pochwy¹⁴, a para starterów 515F/926R stała się niedawno dostępna do sekwencjonowania nowej generacji¹².

Na koniec, ten protokół dostarcza podstawowych instrukcji do przeprowadzenia analizy amplikonów 16S przy użyciu pakietu oprogramowania Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)¹⁵. Pomyślna implementacja opisanych tutaj poleceń QIIME daje tabelę zawierającą liczebność taksonomicznej bakterii dla każdej próbki. Do analizy można włączyć wiele dodatkowych etapów kontroli jakości, metod klasyfikacji taksonomicznej i etapów analizy, zgodnie ze szczegółowym opisem na stronie internetowej QIIME (http://qiime.org/index.html). Jeśli analiza będzie wykonywana na komputerze Apple, pakiet MacQIIME¹⁶ zapewnia łatwą instalację QIIME i jego zależności. Alternatywne pakiety oprogramowania do analizy sekwencji genów 16S rRNA obejmują Mothur¹⁷ i UPARSE¹⁸.

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony i zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Biomedycznych Uniwersytetu KwaZulu-Natal (Durban, Republika Południowej Afryki) oraz Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (2012P001812/MGH; Boston, Massachusetts).

1. Ekstrakcja całkowitego kwasu nukleinowego z wymazów z szyjki macicy i pochwy

Uwaga: Wykonuj ekstrakcje kwasów nukleinowych w zestawach 16 próbek lub mniej. Protokół jak napisano poniżej zakłada, że próbki są przetwarzane w zestawach po 12 sztuk. W przypadku wykonywania wielu rund ekstrakcji należy seryjnie ponumerować partie ekstrakcyjne i zapisać numer partii ekstrakcyjnej każdej próbki, a także inne informacje o próbce (w tym metadane, takie jak numer identyfikacyjny uczestnika, wiek, data/godzina pobrania wymazu, rodzaj hormonalnej antykoncepcji, wyniki testów na infekcje przenoszone drogą płciową itp.) w tabeli 1.

1. Przygotowanie odczynników i dygestorium
   1. Przygotować bufor składający się z 200 mM chlorku sodu (NaCl), 200 mM Tris i 20 mM kwasu edetynowego (EDTA) w 100 ml wody wolnej od nukleaz. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm. Schłodzić porcję 10 ml buforu na mokrym lodzie.
   2. Dostosuj pH alkoholu fenolowo-chloroformowego: izoamylowego (IAA) (25:24:1) do pH 7,9, dodając 65 μl buforu alkalicznego Tris na 1 ml fenolu, wstrząsając mieszaniną przez 2 minuty i pozwalając obu fazom rozdzielić się w sposób naturalny lub przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze RT.
      Uwaga: Fenol jest toksyczny w przypadku połknięcia, wdychania lub w kontakcie ze skórą i oczami. Nie wdychać oparów. Nosić nieprzepuszczalne rękawice, okulary ochronne z bocznymi osłonami i fartuch laboratoryjny.
   3. Przefiltruj i wysterylizuj 25 ml 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS) przez filtr 0,22 μm. Przygotować 5 ml porcji wysterylizowanej karty charakterystyki.
   4. Schłodzić 10 ml podwielokrotności izopropanolu w temperaturze -20 °C.
   5. Przygotuj probówkę do ubijania koralików dla każdego wacika, który ma być przetworzony, ważąc 0,3 g szklanych kulek do sterylnej probówki o pojemności 2 ml, która jest odpowiednia dla ubijaka do koralików.
   6. Uzyskaj wymazy, pobierając próbki szyjki macicy za pomocą sterylnego wacika chłonnego. Natychmiast po pobraniu należy umieścić wacik w pustym i sterylnym kriowalu, przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 do 4 godzin podczas transportu do laboratorium i przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C. Przenieść waciki (znajdujące się w pojedynczych probówkach) do przetworzenia na mokry lód.
   7. Przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Użyj BSC z "gilzą" podłączoną do wydechu budynku, aby zapewnić prawidłowe usuwanie lotnych chemikaliów.
      1. Usuń wszystkie materiały z maski.
      2. Oczyść wszystkie powierzchnie okapu wybielaczem, a następnie odkażaczem, który usuwa RNazy, DNazy i DNA z powierzchni. Wyczyść wszystkie kolejne przedmioty wnoszone do kaptura za pomocą wybielacza, a następnie odkażania kwasem nukleinowym, w tym rękawice. Jeśli to możliwe, używaj świeżych odczynników wolnych od RNaz/DNaz, takich jak końcówki do pipet.
      3. Przyklej wysterylizowaną torbę na chemiczne zagrożenie biologiczne z tyłu kaptura. Wszystkie suche odpady zawierające fenol lub chloroform należy umieścić w tym worku w celu prawidłowej utylizacji.
      4. Umieść sterylną butelkę w kapturze, aby zebrać odpady płynne zawierające fenol lub chloroform.
2. Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa.
   1. Do każdej rurki do ubijania kulek dodać 500 μl buforu (z kroku 1.1.1), 210 μl 20% dodecylosiarczanu sodu i 500 μl fenolu:chloroformu:IAA (25:24:1, pH 7,9).
   2. Przenieś wacik z fiolki transportowej do rurki do ubijania kulek za pomocą nowej pary sterylnych kleszczyków. Dokładnie pocieraj główkę wacika o wewnętrzne ścianki rurki do ubijania koralików przez co najmniej 30 sekund. Po zakończeniu ponownie zamknij próbkę. W przypadku wykonywania ekstrakcji z wielu wacików należy zmieniać rękawiczki między każdą próbką.
   3. Schłodzić próbkę na lodzie przez co najmniej 10 minut. Wyjmij wacik z probówki do ubijania koralików, trzymając uchwyt wacika sterylną pęsetą, jednocześnie dociskając główkę wacika do wewnętrznej ścianki rurki za pomocą czystej końcówki P200. Wyrzuć waciki do suchego worka na odpady chemiczne. Uwaga: Działanie "ściągaczki" (naciśnięcie główki wacika) uwolni płyn z wacika chłonnego i zwiększy odzysk kwasu nukleinowego.
   4. Umieścić rurkę do ubijania kulek w ubijaku do kulek i homogenizować przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
   5. Odwirować rurkę do ubijania kulek przez 3 minuty przy 6 000 x g i 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń i oddzielenia fazy wodnej i fenolowej.
   6. Przenieść fazę wodną (~ 500 - 600 μl) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać równą objętość fenolu:chloroformu:IAA. Wymieszaj przez odwrócenie i krótkie wirowanie.
   7. Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
   8. Przenieść fazę wodną do nowej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Zachowaj ostrożność i nie przenoś materiału z warstwy międzyfazowej lub leżącej pod spodem fazy fenolowej. Zwróć uwagę na objętość przenoszonej fazy wodnej. Zachowaj fazę fenolową do przyszłej izolacji białka.
   9. Dodać 0,8 objętości izopropanolu i 0,1 objętości octanu sodu 3M (pH 5,5). Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie i krótkie wirowanie.
   10. Wytrącić kwas nukleinowy, schładzając probówkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny (do O/N).
3. Wytrącanie izopropanolu i mycie etanolem
   1. Wirować probówkę przez 30 minut w temperaturze około 16 000 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie użyć pipety, aby usunąć supernatant, pozostawiając osad nienaruszony.
   2. Dodaj 500 μl 100% etanolu. Usunąć osad za pomocą delikatnego wirowania lub pipetowania, nie dotykając osadu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
   3. Ostrożnie wyrzucić szwaczek etanolu, supernatant. Użyj pipety P10, aby usunąć jak najwięcej etanolu bez naruszania granulki.
   4. Suszyć pelety na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   5. Zawiesić osad w 20 μl ultra czystego buforu 0,1x Tris-EDTA. Pozostawić próbkę do schłodzenia na lodzie przez 10 minut i kilkakrotnie pipetować, aby zapewnić pełne ponowne wymieszanie. Jeśli osad się nie rozpuści, przenieś probówkę do bloku grzewczego o temperaturze 40 °C na maksymalnie 10 minut, aby ułatwić rozpuszczenie.
   6. Zmierz stężenie kwasu nukleinowego za pomocą spektrofotometru¹⁹.
   7. W razie potrzeby oddziel DNA od RNA za pomocą zestawu do czyszczenia kolumny, zgodnie z protokołem producenta²⁰.
   8. Przechowywać kwas nukleinowy w temperaturze -80 °C lub kontynuować.

2. Amplifikacja PCR hiperzmiennego regionu V4 genu 16S rRNA

Uwaga: Wykonaj amplifikację PCR w zestawach 12 próbek lub mniej, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia i błędu ludzkiego. W przypadku wykonywania wielu rund amplifikacji należy ponumerować seryjnie partie amplifikacji i zapisać numer partii amplifikacji każdej próbki w tabeli 1.

1. Przygotowanie odczynników i kaptura PCR
   1. Do tabeli 1 należy dodać informacje o zestawie amplifikacji PCR, które posłużą jako podstawa pliku mapowania na etapie analizy sekwencji.
   2. Usuń wszystkie materiały z okapu PCR i dokładnie wyczyść powierzchnie wewnętrzne wybielaczem, a następnie odkażaczem, który usuwa RNazy, DNazy i DNA. Pamiętaj, aby odkazić każdy odczynnik i element wyposażenia (np. pipety) przed umieszczeniem ich w okapie. Przed przystąpieniem do pracy przy kapturze należy nosić świeże rękawice oczyszczone środkiem odkażającym kwasem nukleinowym.
   3. W razie potrzeby rozcieńczyć matrycę kwasu nukleinowego do 50 - 100 ng/μl przy użyciu wody wolnej od DNA i nukleazy.
   4. Rozmrozić porcje 5-krotnego bufora o wysokiej wierności (HF), dNTP i starterów w czystym kapturze PCR. Delikatnie zwirować i odwirować wszystkie roztwory po rozmrożeniu. Aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania oraz ryzyko zanieczyszczenia zapasów, przygotuj porcje 5x bufora HF, dNTP i starterów.
   5. Umieść czysty stojak na chłodziarkę stołową na probówki do mikrowirówek i chłodziarkę płytkową PCR w okapie.
2. Do reakcji PCR przygotuj mieszankę główną, łącząc 15,5 μl ultraczystej wody, 5 μl 5x buforu HF, 0,5 μl dNTP, 0,5 μl startera 515F forward starter, 0,75 μl 3% DMSO i 0,25 μl polimerazy dla każdej reakcji. Zbierz wszystkie składniki reakcyjne w chłodnicy i dodaj polimerazę na końcu. Dokładnie wymieszać pipetując. Podczas przygotowywania mieszanki wzorcowej dodać dwie dodatkowe próbki do liczby reakcji, aby uwzględnić błąd pipetowania.
3. Konfiguracja reakcji PCR:
   Uwaga: Amplifikacje należy wykonać w trzech powtórzeniach, co oznacza, że każda próbka jest amplifikowana w trzech oddzielnych reakcjach o objętości 25 μl. Uruchom kontrolę wody bez szablonu z każdą parą podkładów. Pracuj szybko, ale ostrożnie, unikając wprowadzenia jakichkolwiek zanieczyszczeń.
   1. Oznacz 8-dołkowy pasek indywidualnymi nakrętkami i umieść w chłodziarce PCR.
   2. Odpipetować 90 μl mieszanki wzorcowej do pierwszego dołka.
   3. Dodać 2 μl startera odwrotnego (plik uzupełniający 1). Należy pamiętać o uważnym zanotowaniu kodu kreskowego odwróconej startera używanego z każdą próbką w tabeli 1.
   4. Dobrze wymieszać i przenieść 23 μl mieszanki wzorcowej do czwartego dołka (kontrola bez matrycy).
   5. Dodaj 2 μl wody do czwartej studzienki.
   6. Dodać 6 μl odpowiedniej próbki do pierwszego dołka. Dobrze wymieszaj i przenieś 25 μl do drugiego dołka. Wymień końcówki i przenieś kolejne 25 μl z pierwszej studzienki do trzeciej. Mocno zakryj każdą studzienkę, uważając, aby nie dotknąć wnętrza studzienek ani nasadki w tym procesie.
   7. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki.
4. Wykonaj amplifikację PCR
   1. Przenieś probówki paskowe do termocyklera i uruchom następujący program: 30 sekund w temperaturze 98 °C, następnie 30 cykli po 10 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 57 °C i 12 sekund w temperaturze 72 °C, a następnie 10-minutowe zatrzymanie w temperaturze 72 °C i końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
   2. Wykonaj następujące czynności na czystym stole laboratoryjnym. Szybko obróć rurki, aby zebrać płyn ze ścianek. Połączyć trzykrotne reakcje PCR z każdej próbki o całkowitej objętości 75 μl w sterylnej znakowanej probówce. Przenieś również 25 μl każdej kontroli bez matrycy do oddzielnej sterylnej probówki. Nie należy jeszcze łączyć amplikonów z różnych próbek.
5. Walidacja udanej amplifikacji próbek metodą PCR za pomocą elektroforezy żelowej.
   1. Przygotuj 1,5% żel agarozowy (1,5 g proszku agarozy w 100 ml buforu 1x TAE) z wystarczającą ilością studzienek, aby pomieścić każdy amplikon, kontrolę wody i drabinę²¹.
   2. Gdy żel stwardnieje (około 30 min), przygotuj próbkę do elektroforezy: Dodaj 1 μl 6-krotnie obciążającego barwnika do nowej, oznakowanej probówki. Do tej probówki dodać 5 μl amplikonu i wymieszać pipetując.
   3. Gdy żel stwardnieje, wyjmij grzebienie, umieść żel w zbiorniku do elektroforezy i napełnij zbiornik 1x buforem TAE.
   4. Do pierwszego dołka dodaj 5 μl drabinki DNA.
   5. Załadować 5 μl amplikonu próbki do innego dołka. Załadować 5 μl amplikonu bez matrycy do oddzielnej studzienki. Kontynuować w razie potrzeby dla każdej próbki.
   6. Po załadowaniu wszystkich próbek wsuń pokrywę zbiornika na miejsce i włącz źródło zasilania na 120 V. Pozostaw żel na 30 - 60 minut.
   7. Zobacz żel w świetle UV.
      1. Sprawdź pomyślne wzmocnienie każdej próbki, odnotowując pojedyncze silne pasmo około 380 pz. Jeśli występuje podwójne pasmo, ponownie wzmocnij próbkę za pomocą innego odwróconego kodu kreskowego (krok 2.3). Jeśli w ogóle nie ma pasma, ponownie wzmocnij próbkę, używając tego samego odwróconego kodu kreskowego lub nowego odwróconego kodu kreskowego (krok 2.3). Jeśli ponowna amplifikacja nie powiedzie się, w próbce mogą być obecne inhibitory PCR, w takim przypadku należy przeprowadzić czyszczenie DNA na podstawie kolumny w celu usunięcia inhibitorów PCR.
         Uwaga: Pomyślna amplifikacja może nie być możliwa, jeśli stężenie bakteryjnego DNA w oryginalnej próbce jest niewystarczające (<5 ng/μl).
      2. Sprawdzić brak zanieczyszczenia odczynnikiem, odnotowując brak pasma w kontroli bez szablonu.
   8. Pozostałe 70 μl amplikonu należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Pozostałe 20 μl próbki kontrolnej bez matrycy należy odrzucić, zakładając, że nie daje ona prążka.

3. Łączenie bibliotek i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

1. Stwórz pulę amplikonów, łącząc równą objętość (2 - 5 μl) każdego amplikonu w jednej sterylnej probówce. Jeśli pasmo z próbki wyglądało na szczególnie słabe, dodaj dwa razy więcej objętości w stosunku do reszty próbek.
2. Usuń startery PCR z puli amplikonów za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta²². Wykonaj czyszczenie za pomocą wielu kolumn, jeśli objętość puli amplikonów przekracza 100 μl. Uwaga: Każda kolumna ma pojemność 100 μl.
   1. Przechowuj bibliotekę w temperaturze -20 °C lub przejdź do następnego kroku.
3. W razie potrzeby połącz pule amplikonów bez podkładów, aby utworzyć ostateczną bibliotekę. Określić stężenie DNA w bibliotece za pomocą spektrofotometru lub systemu fluorometrycznego²³. Stosunek 260/280 między 1,8 a 2,0 wskazuje na czyste DNA.
4. Rozcieńczyć bibliotekę do 20 nM. Potwierdź jakość biblioteki, wizualizując pojedyncze pasmo około 400 pz za pomocą przyrządu do elektroforezy. Potwierdź stężenie w bibliotece za pomocą systemu fluorometrycznego²³.
5. Wykonać końcowe rozcieńczenie w wodzie w stosunku 1:10, aby rozcieńczyć bibliotekę do 2 nM. Następnie przechowuj bibliotekę w temperaturze 20 °C przez czas nieokreślony.
6. Wyślij podwielokrotność końcowej biblioteki z trzema wymaganymi starterami sekwencjonowania (Odczyt 1, Odczyt 2 i Indeks; patrz Tabele Materiałów/Sprzętu) do sekwencjonowania na sekwenserze Illumina. Jeśli zmultipleksowano mniej niż 300 próbek do sekwencjonowania, należy użyć jednorazowego przebiegu 300 pz i indeksu 12 pz odczytanego na MiSeq, z końcowym stężeniem biblioteki 5 pM i 10% denaturowanym skokiem PhiX. Patrz materiały uzupełniające Caporaso i wsp. ISME J, 2012¹⁰ w celu uzyskania szczegółowych instrukcji sekwencjonowania.

4. Analiza sekwencji

Uwaga: Poniżej przedstawiono podstawowy potok do analizy sekwencji przy użyciu pakietu oprogramowania QIIME 1.8.0. Dla uproszczenia podane polecenia zakładają, że plik mapowania nazywa się mapping.txt, plik odczytu indeksu 12 pz nazywa się index.fastq, a plik odczytu sekwencjonowania 300 pz nazywa się sequences.fastq. Zainstaluj QIIME lub MacQIIME¹⁶ i zapoznaj się z podstawami systemu UNIX, aby wykonać te polecenia. Przeczytaj pełny przewodnik po QIIME pod adresem:

1. Wypełnij plik mapowania dla eksperymentu (Tabela 1). Uwzględnij jak najwięcej metadanych. Zwróć uwagę, które próbki zostały wyekstrahowane lub amplifikowane w tej samej partii, aby określić, czy występują efekty wsadowe.
2. Zapisz plik mapowania jako plik tekstowy, np. mapping.txt. Sprawdź poprawność formatowania pliku mapowania, wykonując następujące polecenia command:validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o mapping_output
   Uwaga: To polecenie wykorzystuje wbudowany skrypt QIIME "validate_mapping_file.py", który tworzy nowy folder o nazwie "mapping_output", zawierający plik .html wskazujący błędy pliku mapowania, jeśli takie występują.
3. Sprawdź jakość odczytów sekwencjonowania za pomocą programu do sprawdzania jakości danych sekwencyjnych o wysokiej przepustowości, takiego jak FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Rysunek 5 przedstawia jakość sekwencji podstawowej, której można oczekiwać po pomyślnym przebiegu.
   Uwaga: Sekwencer przypisuje każdej zasadzie nukleotydowej wynik jakości Phred, który odpowiada prawdopodobieństwu, że zasada została błędnie wywołana. Wynik jakości Phred wynoszący 10 wskazuje, że istnieje 10% szansy, że nukleotyd został nieprawidłowo przypisany, 20 oznacza 1% szansy, 30 oznacza 0,1% szansy, a 40 (najwyższy możliwy wynik) oznacza 0,01% szansy²⁴.
4. Używając pliku mapowania jako klucza, demultipleks, jakość filtruje dane sekwencjonowania i zapisuje wyniki w folderze (w tym przypadku o nazwie "sl_out"), wykonując to polecenie²⁵: split_libraries_fastq.py --rev_comp_mapping_barcodes -i sekwencje.fastq -o sl_out/ -b indeks.fastq -m mapping.txt -q 29
   Uwaga: Flaga q oznacza maksymalny nieakceptowalny wynik jakości Phred, np. "-q 29" odfiltrowuje wszystkie sekwencje z wynikami Phred poniżej 30, zapewniając 99,9% dokładności podstawowych wywołań.
5. Korzystając z bazy danych²⁶ (http://qiime.org/home_static/dataFiles.html) operacyjnej jednostki taksonomicznej (OTU) Greengenes 16S, wykonaj pobieranie OTU z otwartym odniesieniem, wykonując następujące polecenie²⁷: pick_open_reference_otus.py -i sl_out/seqs.fna -r 97_otus.fasta -o ucrss/ -s 0.1
   Uwaga: Flaga -s wskazuje część sekwencji, którym nie udało się wyrównać do referencyjnej bazy danych, która zostanie uwzględniona w klastrowaniu de novo. "-s 0.1" zawiera 10% nieudanych sekwencji w klastrowaniu de novo. Użyj flagi -a, aby zrównoleglić proces pobierania OTU i skrócić czas przetwarzania z dni do godzin, jeśli dostępnych jest wiele rdzeni.
6. Utwórz przyjazną dla użytkownika tabelę liczebności taksonomicznej, łącząc OTU na poziomie gatunków, wykonując to polecenie²⁸: summarize_taxa.py -i ucress/otu_table_mc2.biom -o summarized_otuSpecies/ -L 7
   Uwaga: Wynikową tabelę można łatwo wyświetlić w dowolnym oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Należy pamiętać, że sekwencjonowanie 16S rRNA nie zapewnia niezawodnie rozdzielczości na poziomie gatunku.
7. Określ różnorodność ekologiczną w każdej próbce, obliczając kilka wskaźników różnorodności alfa za pomocą skryptu QIIME alpha_diversity.py. Następnie określ różnorodność między parami próbek za pomocą skryptu QIIME beta_diversity.py.
8. Wizualizacja danych, np. za pomocą wykresu współrzędnych głównych EMPeror²⁹ lub mapy cieplnej.
9. Wykonaj formalne porównania statystyczne kategorii plików mapowania, np. za pomocą skryptu³⁰ compare_catagories.py QIIME.

Wyniki

Ogólny przegląd protokołu, który umożliwia określenie względnej liczebności bakterii z wymazu za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA, jest pokazany na rysunku 1. Protokół został zoptymalizowany pod kątem wymazów z pochwy u ludzi, ale można go łatwo dostosować do większości miejsc pobierania próbek z błony śluzowej i innych gospodarzy. Rysunek 2 przedstawia wysokiej jakości DNA i RNA, które można wyizolować za pomocą protokołu bicia koralików. Rysunek 3 ilustruje udaną amplifikację PCR 12 próbek, gdzie każda amplifikacja próbką dawała pojedyncze silne prążki o odpowiedniej wielkości, a każda kontrola wody nie dawała prążka. Rysunek 4 ilustruje kwantyfikację końcowej puli bibliotecznej przed sekwencjonowaniem. Rysunek 5 przedstawia typowy profil jakości sekwencji po pojedynczym przebiegu MiSeq 300 pz.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd protokołu. Najpierw kwas nukleinowy ekstrahuje się z wacika przez ubijanie kulek w buforowym roztworze zawierającym fenol, chloroform i alkohol izoamylowy. Zmienny region 4 genu 16S rRNA jest następnie amplifikowany z otrzymanego kwasu nukleinowego za pomocą PCR. Amplikony PCR z nawet setek próbek są następnie łączone i sekwencjonowane w jednym przebiegu. Uzyskane sekwencje są dopasowywane do referencyjnej bazy danych w celu określenia względnej liczebności bakterii. Cały protokół można wykonać w ciągu około trzech dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wysokiej jakości kwas nukleinowy ekstrahowany metodą ubijania kulek fenolu: chloroformu. A) jakość DNA, oceniana za pomocą spektrofotometru. Stosunek A260/A280 między 1,8 a 2,0 wskazuje na czysty kwas nukleinowy, który nie jest zanieczyszczony fenolem lub białkiem. (B) Po oczyszczeniu kolumny, protokół ten może dać wysokiej jakości RNA, na co wskazują silne piki 16S i 23S rRNA. (C) Degradacja RNA może nastąpić, jeśli próbka nie jest przechowywana w niskiej temperaturze po pobraniu (podczas transportu i przechowywania) lub jeśli RNazy są obecne podczas przetwarzania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Potwierdzenie udanej amplifikacji genu 16S rRNA przy użyciu zestawu starterów 515F i kodu kreskowego 806R. Góra) Elektroforeza żelowa służy do potwierdzenia obecności pojedynczego pasma około 380 par zasad w każdej próbce, która została amplifikowana za pomocą matrycy. Brak pasma wskazuje na nieudane wzmocnienie; jest to zwykle spowodowane błędem ludzkim i reakcję PCR z tej próbki należy powtórzyć. Na dole) Żadna kontrolka szablonu (wody) nie działa równolegle z tą samą parą starterów, nie powinna mieć obecnego pasma. Obecność pasma w kontroli wody wskazuje na zanieczyszczone odczynniki; Wyrzuć odczynniki, które mogą być zanieczyszczone i ponownie wykonaj amplifikacje PCR zarówno matrycy, jak i kontroli wody dla tej pary starterów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Kwantyfikacja końcowego stężenia puli bibliotecznej i walidacja wielkości biblioteki. Po połączeniu poszczególnych amplikonów próbek należy określić stężenie w końcowej puli bibliotecznej. Pula biblioteczna musi być następnie dalej rozcieńczona, aby osiągnąć stężenie 2 nM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Reprezentatywny wykres słupkowy wyników jakości sekwencji na każdej pozycji odczytu. To normalne, że jakość sekwencji spada po 200 parach zasad, ale średni wynik jakości powinien pozostać powyżej 30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział:

#SampleID	Kod kreskowy Kolejność		LinkerPrimer Kolejność			rcbcPodkład	Typ próbki	Ekstrakcja Partia	Wzmocnienie Talerz	opis
#An przykładowy plik mapowania można znaleźć pod adresem: http://qiime.org/_static/Examples/File_ Formaty/ Example_ Mapping_ File.txt
Zobacz materiał AG2350	TCCCTTGTCTCC		CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT			RCBC000	Szyjka macicy Wymaz	1	ZA

Tabela 1. Szablon pliku mapowania. Utworzenie dokładnego i dokładnego pliku mapowania ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wykonania protokołu. Plik mapowania jest nie tylko wymagany do wykonania QIIME, ale także umożliwia badaczowi utrzymanie powiązania między kodem kreskowym próbki a metadanymi, analizowanie danych pod kątem wszelkich systematycznych odchyleń (np. zmienności między partiami) oraz określenie interesujących korelacji między metadanymi a populacjami bakterii. Dostępny jest podstawowy plik mapowania, ale użytkownicy są zachęcani do dodawania jak największej liczby kolumn zawierających metadane. Przykłady dodatkowych metadanych dotyczących wymazu z pochwy obejmują wiek uczestniczki, datę/godzinę pobrania wymazu, rodzaj hormonalnej antykoncepcji (jeśli dotyczy), wyniki testów na infekcje przenoszone drogą płciową itp.

Plik uzupełniający 1. Lista sekwencji odwróconych starterów z kodami kreskowymi¹⁰. Pierwsze trzy kolumny mogą służyć do ukończenia pliku mapowania, a ostatnia kolumna zawiera całą sekwencję starterów do celów porządkowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji i charakterystyki względnej liczebności bakterii w ludzkim wymazie z pochwy. Protokół ten można łatwo dostosować do innych typów próbek, takich jak kał i wymazy z innych miejsc ciała, a także do próbek pobieranych z wielu różnych źródeł. Ekstrakcja kwasu nukleinowego poprzez ubijanie kulek w buforowym roztworze fenolu i chloroformu pozwala na izolację zarówno DNA, jak i RNA, co jest szczególnie ważne podczas pracy z cennymi próbkami pobranymi w ramach badań klinicznych. Wyizolowane bakteryjne DNA doskonale nadaje się do identyfikacji taksonomicznej bakterii i składania genomu, podczas gdy jednoczesne zbieranie RNA daje możliwość określenia funkcjonalnego wkładu bakterii, gospodarza i wirusa poprzez sekwencję RNA. Opisany protokół wykorzystuje zwalidowany jednoetapowy zestaw starterów, który został z powodzeniem wdrożony na szerokim zakresie typów próbek, w tym na próbkach ludzkich, psich i środowiskowych¹⁰. Dostępność tysięcy starterów z kodami kreskowymi umożliwia multipleksowanie próbek i ogromne oszczędności na kosztach sekwencjonowania. Całkowity koszt (w tym wszystkie odczynniki, pojedynczy przebieg sekwencjonowania i startery, ale nie sprzęt) wynosi około 20 USD za próbkę, gdy 200 próbek jest multipleksowanych. Ponadto istnieje bardzo wysoka odtwarzalność, gdy wiele wymazów z tego samego miejsca próbki jest przetwarzanych niezależnie przez cały rurociąg. Ogólnie rzecz biorąc, protokół jest opłacalny, elastyczny, niezawodny i powtarzalny.

Część tego protokołu dotycząca ekstrakcji kwasów nukleinowych jest ograniczona przez środki ostrożności wymagane podczas pracy z fenolem i chloroformem oraz wyzwania związane z automatyzacją rurociągu do wysokowydajnego, 96-dołkowego formatu płytki. Dodatkowo energiczne bicie kulek używane do mechanicznej lizy przycina bakteryjne DNA do około 6 kilofragmentów zasady; jeśli do dalszych zastosowań wymagane są dłuższe fragmenty DNA, czas ubijania kulek powinien zostać skrócony. Ograniczenia części tego protokołu dotyczącej identyfikacji bakterii są nieodłącznie związane z każdą metodą, która opiera się na sekwencjonowaniu genu 16S rRNA. Sekwencjonowanie 16S rRNA jest idealne do identyfikacji bakterii na poziomie rodzaju, a nawet gatunku, ale rzadko zapewnia identyfikację na poziomie szczepu. Podczas gdy zmienny region V4 genu 16S rRNA zapewnia solidną dyskryminację wśród większości gatunków bakterii¹¹, może być konieczne zastosowanie dodatkowych metod obliczeniowych, takich jak oligotypowanie³¹ , w celu precyzyjnej identyfikacji niektórych gatunków, takich jak Lactobacillus crispatus. Wreszcie, informacji o dokładnych zdolnościach funkcjonalnych bakterii w danej próbce nie można określić za pomocą samego sekwencjonowania genu 16S rRNA, chociaż protokół ten umożliwia ekstrakcję całego genomu DNA i RNA, które można wykorzystać w tym celu.

Najważniejszym krokiem do zapewnienia sukcesu tego protokołu jest zachowanie szczególnej ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas pobierania próbek, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji PCR. Zapewnij sterylność w momencie pobierania próbki, zakładając czyste rękawice i używając sterylnych wacików, probówek i nożyczek. Aby ocenić zanieczyszczenie materiałów do pobierania, należy pobrać wymazy z kontroli ujemnej, umieszczając dodatkowe niewykorzystane wymazówki bezpośrednio w probówkach transportowych w momencie pobierania próbek. W laboratorium wykonaj wszystkie etapy wstępnej amplifikacji w wysterylizowanym okapie zawierającym tylko odkażone materiały eksploatacyjne i używając wyłącznie odczynników molekularnych, wolnych od DNA. Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych należy zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu, używając nowych sterylnych kleszczyków i świeżych rękawiczek do każdej próbki oraz trzymając wszystkie probówki zamknięte, chyba że są używane. Równoległe przetwarzanie niewykorzystanych wymazówek zapewnia sterylność zarówno pobrania próbki, jak i ekstrakcji kwasów nukleinowych; Niewykorzystane waciki nie powinny dawać osadu po wytrąceniu izopropanolu i umyciu etanolem. Jeśli pojawi się osad, należy przeprowadzić amplifikację genu 16S rRNA, aby określić możliwe źródło zanieczyszczenia (np. obecność Streptococcus lub Staphylococcus wskazywałaby na zanieczyszczenie skóry). Dodatkowo należy równolegle wykonywać amplifikacje PCR bez reakcji kontrolnych matrycy, aby upewnić się, że odczynniki i reakcje PCR nie zostały zanieczyszczone. Jeśli w kontrolce bez szablonu pojawi się prążek, wyrzuć odczynniki i powtórz amplifikację ze świeżymi odczynnikami. Podjęcie tych środków ostrożności zapewni pomyślne sekwencjonowanie interesujących nas bakterii.

Etap amplifikacji PCR zwykle wymaga najwięcej rozwiązywania problemów. Amplifikacja w zestawach po dwanaście próbek zapewnia równowagę między wydajnością a spójnością. Całkowity brak pasm na wszystkich próbkach w danym zestawie amplifikacyjnym wskazuje na systematyczną awarię, np . zapomnienie o dodaniu odczynnika lub nieprawidłowe zaprogramowanie termocyklera. Brak pasma w kilku próbkach jest zwykle spowodowany błędem ludzkim, a wzmocnienia powinny być ponownie uruchamiane z tym samym parowaniem próbki i odwróconego startera. W przypadku dalszego braku pasma, próbka może być ponownie amplifikowana za pomocą odwróconego startera z innym kodem kreskowym. Powtarzające się niepowodzenia amplifikacji z wieloma odwróconymi starterami mogą wskazywać na obecność inhibitora w próbce. W takim przypadku czyszczenie DNA za pomocą kolumny często usuwa inhibitory bez znaczącej zmiany względnej liczebności bakterii. Jeśli po amplifikacji powstaje wiele prążków, ponownie amplifikuj próbkę innym kodem kreskowym odwróconego startera.

Oprócz zapobiegania skażeniu środowiska i zapewnienia amplifikacji pojedynczego konkretnego produktu, skuteczne sekwencjonowanie zależy od staranności podczas przygotowywania puli bibliotecznej. Celem jest połączenie równomolowych ilości amplikonów każdej próbki, aby zapewnić w przybliżeniu taką samą liczbę odczytów sekwencjonowania na próbkę. Jeśli stężenia kwasów nukleinowych przed amplifikacją są porównywalne, wystarczy dodać równe objętości amplikonów każdej próbki podczas tworzenia puli bibliotecznej. Jeśli jednak stężenia kwasów nukleinowych są znacznie różne i dodane w równej objętości, próbka o niskim stężeniu kwasu nukleinowego będzie słabo reprezentowana przy małej liczbie odczytów. W takim przypadku możliwe jest dodanie większej objętości amplikonów z próbki o niskim stężeniu w oparciu o względną intensywność pasma żelowego. Alternatywnie możliwe jest bardziej rygorystyczne usuwanie starterów z poszczególnych amplikonów, ilościowe określenie stężenia amplikonów w poszczególnych próbkach za pomocą zestawu do kwantyfikacji fluorometrycznej dsDNA i precyzyjne łączenie równomolowych ilości każdej próbki.

Po wygenerowaniu dobrze zbilansowanej puli amplikonów krytyczne staje się dokładne zmierzenie stężenia w puli. Późniejsze staranne rozcieńczanie i zwiększanie za pomocą PhiX w celu zwiększenia złożoności odczytu ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnych wyników sekwencjonowania. Sekwencery o wysokiej przepustowości, które wykorzystują sekwencjonowanie przez syntezę, są bardzo wrażliwe na gęstość klastra w komórce przepływowej. Załadowanie puli bibliotek, która jest zbyt skoncentrowana, spowoduje nadmierne grupowanie, z niższymi wynikami jakości, niższymi danymi wyjściowymi i niedokładną demultipleksacją³². Załadowanie puli bibliotek, która jest zbyt rozcieńczona, również spowoduje niską wydajność danych. Staranne określenie ilościowe puli bibliotecznej przed sekwencjonowaniem zapewni optymalne wyniki.

Sekwencjonowanie genu 16S rRNA zapewnia kompleksową ocenę bakterii obecnych w danej próbce i jest absolutnie krytycznym pierwszym krokiem w generowaniu hipotez. Obecność bogatego zestawu metadanych umożliwia badaczowi testowanie powiązań między poszczególnymi gatunkami bakterii a ważnymi czynnikami biologicznymi. Co więcej, te same informacje 16S można wykorzystać do wywnioskowania funkcji bakterii za pomocą narzędzi takich jak PICRUSt³³. Ostatecznym celem jest wykorzystanie charakterystyki 16S do zidentyfikowania nowych powiązań, które mogą być dalej testowane i walidowane w systemach modelowych, przyczyniając się do naszego rosnącego zrozumienia wpływu mikrobiomu bakteryjnego na zdrowie i choroby ludzkie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt:
Można użyć dowolnego kaptura do PCR, np. AirClean 600.
Termocykler			Można użyć dowolnego termocyklera z podgrzewaną pokrywą, np. MJ Research PTC-200.
System elektroforezy			Można zastosować dowolny system elektroforezy, np. system do elektroforezy żelowej Thermo Scientific Owl EasyCast B1
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Każda inna metoda kwantyfikacji DNA będzie wystarczająca
Bioanalizator	Agilent	2100	Alternatywą jest instrument Agilent 2200 TapeStation. Nie jest to absolutnie konieczne, ale bardzo pomocne.
MiSeq lub HiSeq	Illumina
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały:
Wacik do pobierania próbek Catch-All	Epibio	QEC89100	Można użyć innych wacików, ale wacik Catch-All jest zalecany przez Human Microbiome Project.
ELIMINase	Fisher	04-355-31
SteriFlip 50 ml urządzenie filtrujące (0,22 &mikro; m)	EMD Millipore	SCGP00525
0,1 mm	BioSpec	11079101
2 ml rurki z nakrętką	Sarstedt	72.694.006	Do bicia koralików
UltraPure 5M NaCl	Life Technologies	24740-011	Biologia molekularna klasy
1 M Tris-HCl	Ambion (Invitrogen)	AM9856	Biologia molekularna Klasa
0,5 M EDTA	Ambion (Invitrogen)	AM9260G	Biologia molekularna Klasa
Dodecyl siarczan sodu, 20% roztwór	Fisher	BP1311-200	Biologia molekularna
Klasa UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz / RNaz	Ambion	10977-015	Klasa biologii molekularnej, do przygotowania buforu
BioReagent 2-Propanol, do biologii molekularnej, ≥ 99,5%	Sigma	I9516-500ML	Klasa biologii molekularnej
Fenol: Chloroform: IAA, 25: 24: 1	Invitrogen	AM9730	Ostrzeżenie: Toksyczny
3 M octan sodu, pH 5,5	Life Technologies	AM9740	Biologia molekularna klasy
Jednorazowe sterylne kleszcze polistyrenowe, PS	Cole Parmer	EW-06443-20
1,5 ml, przezroczyste, czyste probówki do PCR	Eppendorf
Woda klasy PCR	MoBio	17000-11	Do PCR
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England Biolabs	M0530S
dNTP mix	Sigma	D7295-0,5 ml
0,2 ml 8-tubka PCR z dołączonymi przezroczystymi płaskimi nakrętkami, naturalna	USA Scientific	1492-3900	Wszelkie paski z 8 probówkami, które są inhibitorami DNazy, RNazy, DNA i PCR praca
Agarose	BioExpress	E-3121-25
50x bufor TAE	Lonza	51216
Barwnik żelowy DNA	Invitrogen	S33102
6x Barwnik ładujący DNA	Thermo (Fisher)	R0611
50 pz GeneRuler Ladder	Thermo (Fisher)	SM0373
Zestaw DNA/RNA AllPrep	Qiagen	80284
Zestaw do czyszczenia UltraClean PCR	MoBio	12500-100
Quant-iT Zestaw do oznaczania DNA PicoGreen dsDNA	Thermo Fisher Scientific	P11496	Alternatywą jest kwantyfikacja fluorometryczna Qubit (Life Technologies)
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Primers:
515F (starter do przodu) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'Zamów			przy 100 nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie w temperaturze 100 &mikro;M. **Critical: startery muszą być ponownie zawieszone w wodzie MoBio PCR Grade Water (patrz wyżej) w kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.**
Reverse starters, patrz Plik kodu uzupełniającego i: Zalecany			jest ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt IDTW przypadku zamawiania dużych zestawów starterów należy zamówić płytkę 96-dołkową w skali 100 nmol. Zawiesić ponownie w temperaturze 100 μM. Pełne wskazówki dotyczące zamawiania podkładu i ponownego przygotowania do spożycia http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc.  **Critical: podkłady muszą być ponownie zawieszone w wodzie MoBio PCR Grade (patrz wyżej) w kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.**
Read 1 Podkład sekwencjonujący 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3'25			nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie przy 100 &mikrom.
Odczyt 2 Podkład sekwencjonowania 5'-AGT, CAG, TCA, GCC, GGA, CCA, CHV, GGG, TWT, CTA AT-3'26			nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie przy 100 &mikrom.
Indeks: Sekwencjonowanie Elementarz: 5'-ATT, AGA, WAC, CCB, DGT, AGT, CGT, GCT, GAC, TGA, CT-3'27			nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie przy 100 &mikrom.
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	Wymagane w przypadku wykonywania sekwencjonowania we własnym zakresie. Jeśli sekwencjonowanie będzie wykonywane przez centrum sekwencjonowania innej firmy, będzie ono już miało PhiX.