Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Procedura oceny skuteczności flokulantów do usuwania zdyspergowanych cząstek z ekstraktów roślinnych

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53940

⸱

9 kwietnia 2016

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj procedura projektowania eksperymentów pozwala na ocenę różnych flokulantów pod kątem ich zdolności do agregowania rozproszonych cząstek w ekstraktach roślinnych, zmniejszając w ten sposób zmętnienie i koszty dalszego przetwarzania.

Streszczenie

Rośliny są ważne dla ludzi nie tylko dlatego, że dostarczają towarów takich jak żywność, pasza i surowce, ale coraz częściej dlatego, że mogą być wykorzystywane jako platformy produkcyjne dla produktów o wartości dodanej, takich jak biofarmaceutyki. W obu przypadkach płynne ekstrakty roślinne mogą wymagać klarowania w celu usunięcia cząstek stałych. Optymalne klarowanie zmniejsza koszty filtracji i wirowania poprzez zwiększenie wydajności i trwałości. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie naładowanych polimerów znanych jako flokulanty, które sieciują rozproszone cząstki, aby ułatwić separację ciała stałego od cieczy. Nie ma mechanistycznych modeli flokulacji dla złożonych mieszanin, takich jak ekstrakty roślinne, dlatego zamiast nich stosuje się modele empiryczne. W tym miejscu opisano procedurę projektowania eksperymentów, która umożliwia szybkie badanie przesiewowe różnych flokulantów, optymalizując klarowanie ekstraktów roślinnych i znacznie zmniejszając zmętnienie. Uzyskane modele predykcyjne pozwalają na identyfikację odpornych warunków procesowych i zestawów polimerów o uzupełniających się właściwościach, np. efektywnej flokulacji w ekstraktach o określonej przewodności. Wyniki przedstawione w odniesieniu do ekstraktów z liści tytoniu można łatwo dostosować do innych gatunków roślin lub tkanek, a tym samym ułatwią opracowanie bardziej opłacalnych procesów końcowych dla towarów i farmaceutyków pochodzenia roślinnego.

Wprowadzenie

Rośliny są powszechnie wykorzystywane do produkcji towarów spożywczych, takich jak soki owocowe, ale mogą być również rozwijane jako platformy do produkcji produktów biofarmaceutycznych o wyższej wartości 1-3. W obu przypadkach dalsze przetwarzanie (DSP) często rozpoczyna się od ekstrakcji płynów z tkanek, takich jak liście lub owoce, a następnie klarowania ekstraktów zawierających cząstki 4,5. W przypadku produkcji biofarmaceutyków koszty DSP mogą stanowić nawet 80% całkowitych kosztów produkcji 6,7, co częściowo odzwierciedla wysokie obciążenie cząstkami obecnymi w ekstraktach przygotowanych metodami przełomowymi, takimi jak homogenizacja łopatkowa 8,9. Chociaż racjonalny dobór warstw filtracyjnych w celu dopasowania do rozkładu wielkości cząstek w ekstrakcie może zwiększyć wydajność filtra i obniżyć koszty 10,11, poprawa nigdy nie może przekroczyć pułapu pojemności bezwzględnej określonej przez liczbę cząstek, które muszą zostać zatrzymane na jednostkę powierzchni filtra w celu uzyskania klaracji.

Sufit może zostać podniesiony, jeśli mniej cząsteczek dotrze do powierzchni najdrobniejszych filtrów w ciągu filtracji, a można to osiągnąć, jeśli rozproszone cząstki zostaną zmieszane z polimerami znanymi jako flokulanty, które sprzyjają agregacji w celu utworzenia dużych kłaczków 12. Takie kłaczki mogą być zatrzymywane dalej przed filtrami workowymi za pomocą grubszych i tańszych filtrów workowych, zmniejszając obciążenie cząstkami docierającymi do drobniejszych i droższych filtrów wgłębnych. Polimery muszą mieć profile bezpieczeństwa odpowiednie do ich zastosowań, np. w przypadku biofarmaceutyków muszą być zgodne z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) i zazwyczaj muszą mieć masę molową >100 kDa i mogą być neutralne lub naładowane 13. Podczas gdy flokulanty obojętne na ogół działają poprzez sieciowanie zdyspergowanych cząstek, powodując ich agregację i tworzenie kłaczków o średnicach >1 mm 11, naładowane polimery neutralizują ładunek zdyspergowanych cząstek, zmniejszając ich rozpuszczalność, a tym samym powodując wytrącanie się 14.

Flokulację można poprawić, dostosowując parametry takie jak pH buforu lub przewodność, a także typ lub stężenie polimeru, aby dopasować je do właściwości ekstraktu 15,16. W przypadku ekstraktów tytoniowych poddanych wstępnej obróbce 0,5-5,0 g polietyleniminy L-1 (PEI) odnotowano ponad 2-krotny wzrost pojemności filtra wgłębnego w procesie pilotażowym o pojemności 100 litrów. Koszt tego polimeru wynosi mniej niż 10 € kg-1, więc jego wprowadzenie do procesu przyniosło oszczędności w wysokości około 6 000 € w przypadku filtrów i materiałów eksploatacyjnych na partię 16 lub nawet więcej w połączeniu z pomocami filtracyjnymi na bazie celulozy 17. Mimo to modele predykcyjne są potrzebne do oceny a priori korzyści ekonomicznych flokulantów, ponieważ ich włączenie może wymagać kroków wstrzymania 15-30 minut 16,18, co skutkuje dalszymi kosztami inwestycyjnymi zbiorników magazynowych. Jednak obecnie nie ma dostępnych modeli mechanistycznych, które mogłyby przewidzieć wynik takich eksperymentów ze względu na złożoną naturę flokulacji. W związku z tym opracowano bardziej odpowiednie podejście oparte na projektowaniu eksperymentów (DoE) 19, jak opisano w tym artykule. Niedawno opublikowano protokół dotyczący ogólnej procedury DoE 20 .

Małe urządzenia są teraz dostępne do wysokoprzepustowego badania przesiewowego warunków flokulacji 21. Jednak urządzenia te mogą nie symulować realistycznie warunków podczas flokulacji ekstraktów roślinnych, ponieważ wymiary naczynia reakcyjnego (~7 mm dla studzienek na płytce 96-dołkowej) i cząstek lub kłaczków mogą być oddalone od siebie o mniej niż rząd wielkości. Może to mieć wpływ na wzorce mieszania, a tym samym na moc predykcyjną modelu. Co więcej, ograniczenie procesów obejmujących wytrącanie się może być trudne ze względu na nieliniowe zmiany w zachowaniu mieszania i stabilności osadu 22. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono system badań przesiewowych na skalę laboratoryjną o przepustowości 50–75 próbek dziennie, dający wyniki, które można skalować od początkowej objętości reakcyjnej 20 ml do procesu pilotażowego o pojemności 100 litrów 16. W połączeniu z podejściem DoE pozwala to na wykorzystanie modeli predykcyjnych do optymalizacji procesów i dokumentacji w ramach koncepcji jakości według projektu.

Metoda opisana poniżej może być również dostosowana do biofarmaceutyków produkowanych w procesach opartych na hodowlach komórkowych, gdzie flokulanty są również rozważane jako narzędzie oszczędzające koszty 23. Można go również wykorzystać do modelowania wytrącania się białek docelowych z surowego ekstraktu w ramach strategii oczyszczania, jak wykazano w przypadku β-glukuronidazy wytwarzanej w rzepaku, kukurydzy i soi 24,25. Szczegółowy opis właściwości flokulantów można znaleźć w innym miejscu 16,26 i ważne jest, aby zapewnić, że stężenia polimerów w produkcie końcowym są albo nietoksyczne, albo niższe od szkodliwych poziomów 11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Opracowanie odpowiedniej strategii eksperymentalnej

  1. Zidentyfikuj parametry środowiskowe i procesowe istotne dla procedury flokulacji, która ma zostać ustanowiona lub zoptymalizowana, t.j. czynniki mające najsilniejszy wpływ na flokulację. Zazwyczaj istnieje kilka takich parametrów, więc ze względu na brak modeli mechanistycznych niezbędne jest zastosowanie podejścia DoE, zgodnie z niedawnym opisem 20.
    1. Wybierz parametry (czynniki) w oparciu o dane literaturowe 12, wiedzę wstępną oraz doświadczenie z danym systemem. Typowe czynniki obejmują pH buforu, przewodność buforu, czas i temperaturę inkubacji, a także rodzaj i stężenie polimeru 15,16,27.
    2. Wykorzystaj te same źródła (patrz pkt 1.1), aby zdefiniować istotne zakresy dla każdego czynnika numerycznego oraz poziomy dla czynników kategorycznych.
    3. Zdefiniuj wyniki eksperymentalne (odpowiedzi), które będą monitorowane i wykorzystywane do oceny efektywności flokulacji. W zależności od systemu może to być mętność filtratu lub supernatantu, prędkość sedymentacji, wielkość agregatów lub wydajność następującego po nich filtra 16,23,28-30.
    4. Upewnij się, że analizy wykorzystywane do pomiaru odpowiedzi są ilościowe, solidne i powtarzalne/odtwarzalne, tak aby uzyskane wysokiej jakości dane mogły zostać uzupełnione o eksperymenty przeprowadzone później lub przez innego operatora.
  2. Wybierz typ DoE odpowiedni dla liczby badanych czynników oraz stopnia wiedzy zgromadzonej już na temat systemu. Skorzystaj z dostępnej literatury, aby zidentyfikować odpowiedni typ DoE 20.
    1. Wybierz plan przesiewowy (screening design), jeśli dostępnych jest mało informacji o badanym systemie flokulacji, należy przesiać dużą liczbę parametrów lub mało wiadomo o istotnych zakresach tych parametrów. Typowe plany przesiewowe to pełne i ułamkowe plany czynnikowe. Uwzględnij w planie punkty centralne, jeśli przewiduje się, że parametry będą miały nieliniowy wpływ, np. nasycenie powyżej pewnego progu 19.
    2. Wybierz metodologię powierzchni odpowiedzi (RSM), np. centralny plan kompozytowy (CCD) 31 lub plan optymalny 32,33, jeśli jedynie kilka czynników o znanych zakresach wymaga precyzyjnej charakterystyki.
  3. Skonfiguruj DoE za pomocą odpowiedniego oprogramowania, upewniając się, że spełnione są a priori kryteria jakości, takie jak frakcja przestrzeni planowania 20.

2. Przygotowanie eksperymentów flokulacyjnych

Etapy przetwarzania alg: ekstrakcja, flokulacja, filtracja workowa, filtracja wgłębna; porównanie metod.
Rycina 1: Schemat flokulacji ekstraktu roślinnego: skala przemysłowa (lewo) i skala laboratoryjna (prawo). Po ekstrakcji białek przy użyciu buforów wodnych, rozproszone cząstki szczątków komórkowych są agregowane poprzez dodanie flokulantów. Agregaty są następnie usuwane za pomocą kaskady filtracji workowej i wgłębnej, a pojemność tych filtrów wraz z mętnością filtratu mogą być wykorzystane bezpośrednio do pomiaru wydajności flokulacji.

  1. Opracowanie ogólnego schematu przebiegu eksperymentu (Rysunek 1).
    1. Należy użyć urządzenia do ekstrakcji, które zapewnia taki sam rozkład wielkości cząstek, jakiego oczekuje się (lub jaki zaobserwowano) w końcowej skali zastosowania, np. specjalistycznego homogenizatora. Jeśli to możliwe, należy zaprojektować model ekstraktora w mniejszej skali, zgodnie z opisem dla homogenizacji liści tytoniu 10.
    2. Należy określić objętości ekstraktu stosowane podczas doświadczeń z flokulacją (w tym przypadku 20 ml). Należy wybrać objętość, która pozwoli na obecność reprezentatywnej liczby cząstek w naczyniu reakcyjnym; np. doświadczenia z flokulacją w alikwotach 20 ml dały powtarzalne i skalowalne wyniki dla ekstraktów z tytoniu zawierających ~7% [w/v] substancji stałych 34 i cząstki o wielkości od ~0,5 µm do ~3 mm 16.
    3. Wszystkie operacje monitorowania i etapy po flokulacji należy zaprojektować tak, aby były reprezentatywne dla końcowej skali zastosowania, np. wybierając filtry o takich samych właściwościach zatrzymywania cząstek, jak te stosowane w skali produkcyjnej.
  2. Uprawa roślin, z których pozyskiwane będą ekstrakty.
    1. Należy użyć tej samej linii roślin, w tym przypadku Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, oraz tych samych warunków uprawy, które będą stosowane podczas produkcji, zgodnie z wcześniejszym opisem 33.
    2. W przypadku przetwarzania innych surowców, należy je przygotować tak, aby były reprezentatywne dla końcowej skali zastosowania, np. stosując autentyczne bufory, uwzględniając wszelkie etapy rozcieńczania w procesie oraz przestrzegając przewidywanego pH i przewodności, w tym przypadku pH 7,5 i przewodności 30 mS cm-1.
  3. Przygotowanie akcesoriów do filtracji, urządzeń do monitorowania mętności i naczyń do pobierania próbek.
    1. Materiały filtracyjne należy dociąć do wymaganych rozmiarów, w tym przypadku 15 x 15 cm2, jeśli nie są to moduły gotowe do użycia. Należy upewnić się, że wszystkie urządzenia monitorujące i analityczne są sprawne, a wszystkie probówki do próbek są odpowiednio opisane.
    2. Mimo że są to proste czynności, należy przygotować te elementy z wyprzedzeniem, aby nie powodowały przerw podczas właściwych doświadczeń z flokulacją. Należy unikać opóźnień, ponieważ mogą one wpłynąć na wyniki, biorąc pod uwagę, że flokulacja jest procesem zależnym od czasu.
  4. Przygotowanie roztworów zapasowych flokulantów. OSTROŻNIE: Podczas pracy z flokulantami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, np. rękawice. Materiały te mogą być niebezpieczne (etykiety zagrożeń zgodnie z normami Europe UE 67/548/CEE, 1999/45/CE obejmują N, Xi lub Xn). Należy unikać wdychania pyłu i zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów. Pracować pod wyciągiem.
    1. Należy wybrać stężenie zapasowe dla każdego flokulanta, w tym przypadku 80,0 g L-1 dla dwóch użytych flokulantów PEI. Należy wybrać stężenia jak najwyższe, aby uniknąć rozcieńczenia próbki podczas dodawania flokulanta, co zmniejszyłoby stężenie cząstek i tym samym wpłynęło na wydajność flokulacji.
    2. Należy uwzględnić wszelkie wstępne rozcieńczenia wynikające z formulacji polimeru producenta, np. jeśli polimer jest dostarczany jako 50% [w/v] roztwór wodny. Do tej pory za najodpowiedniejsze uznano roztwory zapasowe flokulantów o stężeniu 4-8% [w/v].
    3. Biorąc pod uwagę powyższe kwestie, należy upewnić się, że stężenie flokulanta nie powoduje powstania roztworu o bardzo wysokiej lepkości, który utrudnia pipetowanie, co mogłoby prowadzić do błędów z powodu nieprawidłowego dostosowania końcowego stężenia flokulanta.
    4. Jeśli to możliwe, dla wszystkich flokulantów należy zastosować to samo stężenie zapasowe, co ułatwi opracowanie schematu pipetowania (2.5), zmniejszając tym samym prawdopodobieństwo błędów.
    5. Należy dostosować pH i przewodność każdego roztworu zapasowego flokulanta do warunków ekstraktów, w tym przypadku pH 4−10 i przewodność 15−55 mS cm-1. Należy przygotować oddzielne roztwory zapasowe dla jednego flokulanta, jeśli dla danego polimeru testowany jest więcej niż jeden zestaw warunków pH i/lub przewodności.
    6. Roztwory zapasowe flokulantów należy przygotowywać na świeżo, nie wcześniej niż 48 h przed użyciem. Chociaż flokulację można indukować za pomocą zapasów polimerów przechowywanych przez ponad 4 tygodnie, wydajność może spaść z powodu hydrolizy polimeru przy wysokich lub niskich wartościach pH. Szczegóły znajdują się w dokumentacji producenta.
    7. Należy upewnić się, że parametry wybrane dla DoE mogą być precyzyjnie dostosowane dla każdej próbki podczas eksperymentu, np. zapewniając dostęp do łaźni grzewczych/chłodniczych w celu regulacji temperatur inkubacji, w tym przypadku 4 °C, 20 °C i 37 °C. Jeśli mieszanie podczas flokulacji jest częścią eksperymentu, należy upewnić się, że urządzenie do mieszania jest reprezentatywne dla końcowej skali zastosowania pod względem krytycznych parametrów, takich jak doprowadzona moc.
  5. Przekształcenie harmonogramu DoE w schemat pipetowania.
    1. Należy przeliczyć różne stężenia flokulantów do przetestowania na objętości roztworu zapasowego, który zostanie dodany do próbek ekstraktu: podzielić końcowe stężenia flokulanta przez stężenie zapasowe i pomnożyć przez objętość próbki stosowaną w doświadczeniach z flokulacją. Należy określić największą wynikową objętość końcową, np. jeśli 20 ml próbki miesza się z maksymalnie 2 ml roztworu zapasowego flokulanta, wyniesie ona 22 ml.
    2. Należy obliczyć objętości buforu wymagane do utrzymania tej samej objętości końcowej we wszystkich alikwotach flokulacyjnych na podstawie największej objętości dodawanego roztworu zapasowego flokulanta, np. jeśli do próbki musi zostać dodane 0,75 ml roztworu zapasowego flokulanta, to wymagane jest 1,25 ml buforu, aby utrzymać końcową objętość próbki 22 ml (2.5.1).
    3. Należy zsumować objętości roztworów zapasowych flokulantów dla każdego polimeru i warunków flokulacji, aby obliczyć całkowite objętości roztworów zapasowych wymagane dla DoE.
  6. Zbiór liści tytoniu i przygotowanie ekstraktu.
    1. Należy usunąć sześć górnych liści (lub tyle, ile wskazują instrukcje procesu) z roślin tytoniu w odpowiednim wieku, np. 6-tygodniowych, i przenieść je do odpowiedniego urządzenia do ekstrakcji, takiego jak homogenizator lub prasa śrubowa.
    2. Należy dodać trzy objętości buforu ekstrakcyjnego na gram biomasy, np. 300 ml na 100 g, i mieszać przez 8 min.
    3. Należy przygotować poszczególne ekstrakty z odpowiednimi buforami, jeśli testowane są różne wartości pH i/lub przewodności. W tym przypadku wiąże się to z homogenizacją materiału roślinnego przez 3 x 30 s w blenderze lub sokowirówce 34.
    4. Alternatywnie ekstrakt można przygotować w sposób reprezentatywny dla badanego procesu.
  7. Podział ekstraktu na alikwoty i dodanie buforu.
    1. Ekstrakt należy mieszać ręcznie i dokładnie przez całą procedurę, aby zapewnić homogeniczność próbek i równomierny rozkład cząstek.
    2. Ekstrakt należy precyzyjnie rozdzielić między wcześniej opisane probówki reakcyjne poprzez zlewanie, w tym przypadku po 20 ml do każdego naczynia. Samostojące probówki 50 ml ułatwiają obsługę i są idealne dla próbek 20 ml.
    3. Za pomocą odpowiedniej pipety należy dodać objętość każdego buforu ekstrakcyjnego wymaganą do utrzymania stałej objętości końcowej dla każdej poszczególnej probówki reakcyjnej.

3. Flokulacja ekstraktów roślinnych za pomocą różnych polimerów

  1. Pipetuj wymaganą objętość roztworu treściwego flokulanta, w tym przypadku 0.1−2.0 ml, do próbek sekwencyjnie, zgodnie z randomizowaną kolejnością serii określoną przez DoE. Każdą próbkę należy dokładnie wymieszać bezpośrednio po dodaniu flokulanta poprzez intensywne wstrząsanie ręczne przez dokładnie 20 sec.
    1. W razie potrzeby dostosuj czas wstrząsania dla innych substratów, aby zapewnić dokładne wymieszanie, jednak ściśle przestrzegaj spójnych czasów mieszania dla wszystkich próbek. Należy pamiętać, że przedłużone mieszanie może spowodować nieodwracalne rozbicie kłaczków, a niespójna siła przykładana podczas wstrząsania może zafałszować wyniki flokulacji.
  2. Opcjonalnie: zmodyfikuj opisaną powyżej procedurę w celu jednoczesnego zastosowania dwóch lub więcej flokulantów.
    1. Opcja 1: Zamiast pojedynczego polimeru dodaj mieszaninę dwóch lub więcej flokulantów, w tym przypadku PEI i chitosan. Stosuj kombinacje flokulantów zdefiniowane w DoE. Uwzględnij stosunek oraz bezwzględne stężenia polimerów jako poszczególne parametry podczas konfiguracji DoE (1.1).
    2. Opcja 2: Dodaj dwa lub więcej polimerów sekwencyjnie do ekstraktu.
      1. Podczas konfiguracji DoE przyjmij jako dodatkowe czynniki stężenia poszczególnych polimerów, ich typ oraz czas inkubacji pomiędzy kolejnymi dodaniami do ekstraktu.
      2. Zastosuj również to podejście, aby sprawdzić, czy wielokrotne dodawanie pojedynczego polimeru może poprawić flokulację. Użyj dodawania stopniowego, aby symulować powolne dodawanie flokulanta, np. w czterech krokach, gdzie w każdym dodaje się 0.25 ml roztworu treściwego flokulanta o stężeniu 80 g L-1 do objętości 20 ml w ciągu 4 min, co może naśladować dodawanie flokulanta z prędkością przepływu 0.25 ml min-1.
      3. W każdym przypadku określ nową maksymalną końcową objętość próbki dla tej konfiguracji, dodając maksymalne objętości wszystkich flokulantów do objętości próbki (tutaj nadal 22 ml), i w razie potrzeby przelicz wymagane objętości roztworów treściwych flokulantów oraz buforów do korekty objętości.
  3. Inkubuj próbki przez czasy zdefiniowane w DoE, zazwyczaj 3-30 min, aby umożliwić tworzenie kłaczków. Upewnij się, że wszystkie pozostałe warunki inkubacji, np. temperatura, są ustawione zgodnie z DoE.
  4. Obserwuj i dokumentuj tworzenie kłaczków. Rejestruj postęp flokulacji zgodnie z wymaganiami, np. jako mm osadzania kłaczków na min, mierząc wysokość osadzonych ciał stałych. W razie potrzeby przedłuż flokulację o dłuższy okres, np. przez noc.
  5. Przefiltruj flokulowany ekstrakt.
    1. Użyj materiałów filtrujących przygotowanych wcześniej (2.3), aby sklarować flokulowany ekstrakt po odpowiednim czasie inkubacji, przelewając flokulowane próbki przez materiał filtrujący do czystego naczynia lub probówki reakcyjnej.
      1. Nie resuspenduj osadzonych kłaczków przed filtracją i aplikuj ekstrakt na filtr z prędkością ~300 ml min-1, co odpowiada 3−4 sec dla próbki 20 ml.
      2. Potwierdź sprawność etapu filtracji, jeśli w eksperymentach laboratoryjnych zastosowano inny materiał niż w procesie końcowym pod kątem zatrzymywania cząstek, np. mierząc rozkład wielkości cząstek w obu typach próbek 11.
    2. Przeanalizuj filtrat pod kątem mętności i/lub rozkładu wielkości cząstek zgodnie z wymaganiami, używając odpowiednich urządzeń, np. turbidymetru.
    3. Opcjonalnie: powtórz analizę po wydłużonym czasie inkubacji, np. 12−24 hr, aby zbadać tworzenie lub ponowne tworzenie niestabilnych kłaczków.
  6. Przeanalizuj próbki pod kątem zdefiniowanych wcześniej odpowiedzi (1.1.3).
    1. Pobierz próbki z filtratów i przeanalizuj je pod kątem dodatkowych parametrów odpowiedzi, np. stężeń różnych białek docelowych lub cennych produktów.
    2. Opcjonalnie: przeanalizuj retentat (głównie ciała stałe) pod kątem tych samych parametrów, aby zamknąć bilans masowy procesu. W szczególności określ wpływ flokulantów na odzysk cieczy, porównując masę ciał stałych pozostałą po tym, jak próbki zostały poddane lub nie poddano ich działaniu flokulanta.
  7. Potwierdź jakość danych i przenieś wyniki do oprogramowania DoE.
    1. Wyszukaj wartości ekstremalne w zebranych danych odpowiedzi, np. niespodziewanie wysokie wartości.
    2. Upewnij się, że wszystkie dane odpowiedzi są prawidłowo przypisane do odpowiadających im warunków eksperymentalnych.
    3. Przenieś wyniki do oprogramowania DoE i upewnij się, że standardowa i randomizowana kolejność serii nie zostały pomylone.

4. Ocena DoE

  1. Użyj wbudowanych narzędzi analizy danych w oprogramowaniu DoE, aby opracować model predykcyjny zgodnie z wcześniejszym opisem 20.
    1. W razie potrzeby wybierz odpowiedni tryb transformacji danych w celu ułatwienia budowy modelu, w tym przypadku logarytmiczny10Stosunek większy niż 10 dla największego kontra najmniejsza wartość odpowiedzi wskazuje, że może być wymagana transformacja danych. Należy zidentyfikować najbardziej odpowiednią transformację, korzystając z właściwych narzędzi statystycznych, np. wykres pudełkowo-wąsowy Boxa-Coxa 35.
    2. Należy wybrać model bazowy, który (i) odpowiada wybranemu planowi doświadczeń (DoE) (1.2) oraz (ii) jest zgodny z dotychczasową wiedzą na temat badanego układu, w oparciu o narzędzia analizy wariancji (ANOVA) oprogramowania do DoE. np. wielomian drugiego stopnia często lepiej oddaje obserwowany efekt czasu inkubacji niż wielomian pierwszego stopnia.
    3. Usuń nieistotne czynniki modelu, np. p >0,05, lub interakcje czynników iteracyjnie poprzez ich odrzucanie, co pozwala na zmniejszenie złożoności modelu i zwiększenie jego mocy predykcyjnej.
    4. Potwierdź jakość modelu poprzez porównanie R2, skorygowane R²2 or przewidywane R2 wraz z wykresem prawdopodobieństwa rozkładu normalnego dla reszt studentizowanych, wykresem reszt w funkcji kolejności prób, wykresem wartości przewidywanych względem rzeczywistych oraz wykresem Boxa-Coxa 36Wszystkie R2 wartości powinny mieścić się w zakresie 0,2.
    5. Należy upewnić się, że końcowy model jest zgodny z podstawowymi założeniami fizyki i termodynamiki, np. nie przewiduje się wystąpienia ujemnych stężeń.
  2. Należy wykorzystać model do przewidzenia warunków najkorzystniejszych dla badanego układu, w tym przypadku niskiej mętności.
    1. Wybierz najważniejsze odpowiedzi oraz ich preferowane stany, np. minimalna mętność. Połącz te wybory poprzez maksymalizację funkcji pożądalności lub podobnych narzędzi, które są wbudowanymi funkcjami wielu pakietów oprogramowania do DoE 36.
    2. W zależności od zamierzonego zastosowania modelu należy przeprowadzić serie potwierdzające w celu zweryfikowania optymalnych warunków i/lub ogólnej mocy predykcyjnej modelu, np. jeśli warunki przewidywane jako najkorzystniejsze nie były częścią wstępnego planowania eksperymentów (DoE), należy wybrać je jako eksperymenty uzupełniające.

5. Udoskonalenie modelu i weryfikacja mocy predykcyjnej

  1. Zawęź początkową przestrzeń projektową do najbardziej pożądanych warunków operacyjnych, np. niską mętność w zakresie 0−1,000 NTU, w oparciu o prognozy modelu (4.2).
  2. Skonfiguruj nowy plan DoE w tych zakresach, uwzględniając tylko te czynniki, które zostały zidentyfikowane jako istotne lub relewantne (4.1.2)).
    UWAGA: Czynnik może być istotny z punktu widzenia analizy modelu, ale nieistotny dla procesu, tj. jego wpływ na odpowiedź wynosi <1% w porównaniu z wpływem innych czynników.
  3. Powtarzaj kroki 1-5.2, aż jakość prognoz modelu będzie zgodna z wymaganiami, np. gdy odchylenie standardowe modelu wskazane przez oprogramowanie będzie wystarczające dla zamierzonego zastosowania. Jeśli jest to konieczne, zmodyfikuj strategię eksperymentalną dla tych iteracji, np. stosując tylko jeden flokulant w fazie doprecyzowania.
  4. Przenieś i potwierdź wyniki z modelu w skali pomniejszonej do skali pilotowej lub końcowej skali produkcyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Flokulacja ekstraktu z tytoniu z różnymi polimerami

Opisana powyżej metoda została z sukcesem wykorzystana do opracowania procesu flokulacji ekstraktów tytoniowych podczas produkcji przeciwciała monoklonalnego (przeciwciało neutralizujące HIV 2G12) oraz białka fluorescencyjnego (DsRed) (Rycina 1) 16, a następnie przeniesiona na inne białka, w tym lektyny, kandydaty na szczepionki przeciw malarii oraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym aspektem do rozważenia podczas planowania DoE w celu charakterystyki flokulacji cząstek jest fakt, że projekt musi być w zasadzie w stanie wykryć i opisać przewidywane lub możliwe efekty 36,38, np. wpływ pH, rodzaju polimeru oraz stężenia polimeru 16. Dlatego przed rozpoczęciem właściwych eksperymentów istotna jest ocena ułamka przestrzeni projektu (FDS). FDS to ułamek wielowymiarowej przestrzeni eksperymentalnej (obejmowanej przez czynniki projektu, np. pH), w obręb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Chciałbym podziękować Dr. Thomasowi Rademacherowi za dostarczenie transgenicznych nasion tytoniu oraz Ibrahimowi Al Amedi za uprawę roślin tytoniu. Pragnę podziękować dr. Richardowi M. Twymanowi za pomoc redakcyjną oraz prof. dr. Rainerowi Fischerowi za owocne dyskusje. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach Advanced Grant "Future-Pharma", wniosek nr 269110, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fundację Fraunhofera Przyszłości) oraz programy wewnętrzne Fraunhofer-Gesellschaft w ramach grantu nr 269110. Przyciągaj 125-600164.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przenośny mętnościomierz 2100PHach4650000Zmętnienie
Przeciwciało 2G12PolymunAB002Przeciwciało referencyjne
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01Urządzenie SPR
BP-410Furh2632410001Filtr workowy
Catiofast VSHBASF79002360Środek
flokulacyjnyWirówka 5415DEppendorf5424 000.410Wirówka
Probówka wirówkowa 15 mlLabomedic2017106Probówka reakcyjna
Probówka wirówkowa 50 ml wolnostojącaLabomedic1110504Probówka reakcyjna
ChitozanCarl Roth GmbH5375.1Środek flokulacyjny
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEsoftware
Fosforan disodowyCarl Roth GmbH  4984.3 Komponent Media
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Nawóz
Forma -86C Zamrażarka ULTThermoFisher88400Zamrażarka
Szklarnian.a.n.a.Douprawy roślin
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Rockwool
block HEPESCarl Roth GmbH9105.3Komponent medialny
K700P 60DPall5302305Głęboka warstwa filtracyjna
KS50P 60DPallB12486Głęboka warstwa filtracyjna
MiraclothLabomedic475855-1RTkanina filtracyjna
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-metr / konduktometr
Osram zimna biel 36 WOsram4930440Źródło światła
FitotronIlka Zelln.d.Douprawy roślin
Polymin PBASF79002360Środek flokulacyjny
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110Urządzenie do homogenizacji z niestandardowym narzędziem ostrzowym
Białko ATechnologie życia10-1006Białko wiążące przeciwciało
Chlorek soduCarl Roth GmbHP029.2Składnik medialny
Synergia HTBioTekSIAFRTCzytnik płytek fluorescencyjnych
TRISCarl Roth GmbH4855.3Komponent medialny
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Komponent medialny
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Obudowa filtra
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600Pomiar rozkładu wielkości cząstek DLS

Bibliografia

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wydajność flokulantaklarowanie ekstraktu roślinnegoplanowanie eksperymentówpomiar mętnościprzesiewanie polimerówproces flokulacjifiltracja wgłębnaekstrakt z liści tytoniuoptymalizacja procesuseparacja ciało stałe-ciecz
Procedura oceny skuteczności flokulantów do usuwania zdyspergowanych cząstek z ekstraktów roślinnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.