Procedura oceny skuteczności flokulantów do usuwania zdyspergowanych cząstek z ekstraktów roślinnych

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj procedura projektowania eksperymentów pozwala na ocenę różnych flokulantów pod kątem ich zdolności do agregowania rozproszonych cząstek w ekstraktach roślinnych, zmniejszając w ten sposób zmętnienie i koszty dalszego przetwarzania.

Streszczenie

Rośliny są ważne dla ludzi nie tylko dlatego, że dostarczają towarów takich jak żywność, pasza i surowce, ale coraz częściej dlatego, że mogą być wykorzystywane jako platformy produkcyjne dla produktów o wartości dodanej, takich jak biofarmaceutyki. W obu przypadkach płynne ekstrakty roślinne mogą wymagać klarowania w celu usunięcia cząstek stałych. Optymalne klarowanie zmniejsza koszty filtracji i wirowania poprzez zwiększenie wydajności i trwałości. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie naładowanych polimerów znanych jako flokulanty, które sieciują rozproszone cząstki, aby ułatwić separację ciała stałego od cieczy. Nie ma mechanistycznych modeli flokulacji dla złożonych mieszanin, takich jak ekstrakty roślinne, dlatego zamiast nich stosuje się modele empiryczne. W tym miejscu opisano procedurę projektowania eksperymentów, która umożliwia szybkie badanie przesiewowe różnych flokulantów, optymalizując klarowanie ekstraktów roślinnych i znacznie zmniejszając zmętnienie. Uzyskane modele predykcyjne pozwalają na identyfikację odpornych warunków procesowych i zestawów polimerów o uzupełniających się właściwościach, np. efektywnej flokulacji w ekstraktach o określonej przewodności. Wyniki przedstawione w odniesieniu do ekstraktów z liści tytoniu można łatwo dostosować do innych gatunków roślin lub tkanek, a tym samym ułatwią opracowanie bardziej opłacalnych procesów końcowych dla towarów i farmaceutyków pochodzenia roślinnego.

Wprowadzenie

Rośliny są powszechnie wykorzystywane do produkcji towarów spożywczych, takich jak soki owocowe, ale mogą być również rozwijane jako platformy do produkcji produktów biofarmaceutycznych o wyższej wartości ^1-3. W obu przypadkach dalsze przetwarzanie (DSP) często rozpoczyna się od ekstrakcji płynów z tkanek, takich jak liście lub owoce, a następnie klarowania ekstraktów zawierających cząstki ^4,5. W przypadku produkcji biofarmaceutyków koszty DSP mogą stanowić nawet 80% całkowitych kosztów produkcji ^6,7, co częściowo odzwierciedla wysokie obciążenie cząstkami obecnymi w ekstraktach przygotowanych metodami przełomowymi, takimi jak homogenizacja łopatkowa ^8,9. Chociaż racjonalny dobór warstw filtracyjnych w celu dopasowania do rozkładu wielkości cząstek w ekstrakcie może zwiększyć wydajność filtra i obniżyć koszty ^10,11, poprawa nigdy nie może przekroczyć pułapu pojemności bezwzględnej określonej przez liczbę cząstek, które muszą zostać zatrzymane na jednostkę powierzchni filtra w celu uzyskania klaracji.

Sufit może zostać podniesiony, jeśli mniej cząsteczek dotrze do powierzchni najdrobniejszych filtrów w ciągu filtracji, a można to osiągnąć, jeśli rozproszone cząstki zostaną zmieszane z polimerami znanymi jako flokulanty, które sprzyjają agregacji w celu utworzenia dużych kłaczków ¹². Takie kłaczki mogą być zatrzymywane dalej przed filtrami workowymi za pomocą grubszych i tańszych filtrów workowych, zmniejszając obciążenie cząstkami docierającymi do drobniejszych i droższych filtrów wgłębnych. Polimery muszą mieć profile bezpieczeństwa odpowiednie do ich zastosowań, np. w przypadku biofarmaceutyków muszą być zgodne z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) i zazwyczaj muszą mieć masę molową >100 kDa i mogą być neutralne lub naładowane ¹³. Podczas gdy flokulanty obojętne na ogół działają poprzez sieciowanie zdyspergowanych cząstek, powodując ich agregację i tworzenie kłaczków o średnicach >1 mm ¹¹, naładowane polimery neutralizują ładunek zdyspergowanych cząstek, zmniejszając ich rozpuszczalność, a tym samym powodując wytrącanie się ¹⁴.

Flokulację można poprawić, dostosowując parametry takie jak pH buforu lub przewodność, a także typ lub stężenie polimeru, aby dopasować je do właściwości ekstraktu ^15,16. W przypadku ekstraktów tytoniowych poddanych wstępnej obróbce 0,5-5,0 g polietyleniminy ^L-1 (PEI) odnotowano ponad 2-krotny wzrost pojemności filtra wgłębnego w procesie pilotażowym o pojemności 100 litrów. Koszt tego polimeru wynosi mniej niż 10 € ^kg-1, więc jego wprowadzenie do procesu przyniosło oszczędności w wysokości około 6 000 € w przypadku filtrów i materiałów eksploatacyjnych na partię ¹⁶ lub nawet więcej w połączeniu z pomocami filtracyjnymi na bazie celulozy ¹⁷. Mimo to modele predykcyjne są potrzebne do oceny a priori korzyści ekonomicznych flokulantów, ponieważ ich włączenie może wymagać kroków wstrzymania ^{15-30 minut 16,18}, co skutkuje dalszymi kosztami inwestycyjnymi zbiorników magazynowych. Jednak obecnie nie ma dostępnych modeli mechanistycznych, które mogłyby przewidzieć wynik takich eksperymentów ze względu na złożoną naturę flokulacji. W związku z tym opracowano bardziej odpowiednie podejście oparte na projektowaniu eksperymentów (DoE) ¹⁹, jak opisano w tym artykule. Niedawno opublikowano protokół dotyczący ogólnej procedury DoE ²⁰ .

Małe urządzenia są teraz dostępne do wysokoprzepustowego badania przesiewowego warunków flokulacji ²¹. Jednak urządzenia te mogą nie symulować realistycznie warunków podczas flokulacji ekstraktów roślinnych, ponieważ wymiary naczynia reakcyjnego (~7 mm dla studzienek na płytce 96-dołkowej) i cząstek lub kłaczków mogą być oddalone od siebie o mniej niż rząd wielkości. Może to mieć wpływ na wzorce mieszania, a tym samym na moc predykcyjną modelu. Co więcej, ograniczenie procesów obejmujących wytrącanie się może być trudne ze względu na nieliniowe zmiany w zachowaniu mieszania i stabilności osadu ²². W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono system badań przesiewowych na skalę laboratoryjną o przepustowości 50–75 próbek dziennie, dający wyniki, które można skalować od początkowej objętości reakcyjnej 20 ml do procesu pilotażowego o pojemności 100 litrów ¹⁶. W połączeniu z podejściem DoE pozwala to na wykorzystanie modeli predykcyjnych do optymalizacji procesów i dokumentacji w ramach koncepcji jakości według projektu.

Metoda opisana poniżej może być również dostosowana do biofarmaceutyków produkowanych w procesach opartych na hodowlach komórkowych, gdzie flokulanty są również rozważane jako narzędzie oszczędzające koszty ²³. Można go również wykorzystać do modelowania wytrącania się białek docelowych z surowego ekstraktu w ramach strategii oczyszczania, jak wykazano w przypadku β-glukuronidazy wytwarzanej w rzepaku, kukurydzy i soi ^24,25. Szczegółowy opis właściwości flokulantów można znaleźć w innym miejscu ^16,26 i ważne jest, aby zapewnić, że stężenia polimerów w produkcie końcowym są albo nietoksyczne, albo niższe od szkodliwych poziomów ¹¹.

Protokół

1. Opracowanie odpowiedniej strategii eksperymentalnej

1. Zidentyfikuj parametry środowiskowe i procesowe istotne dla procedury flokulacji, która ma zostać opracowana lub zoptymalizowana, t.j. czynniki mające najsilniejszy wpływ na flokulację. Zazwyczaj istnieje kilka takich parametrów, dlatego ze względu na brak modeli mechanistycznych niezbędne jest zastosowanie podejścia DoE, zgodnie z niedawnym opisem ²⁰.
   1. Wybierz parametry (czynniki) w oparciu o dane literaturowe ¹², wcześniejszą wiedzę oraz doświadczenie z danym układem. Typowe czynniki obejmują pH buforu, przewodność buforu, czas i temperaturę inkubacji, a także rodzaj i stężenie polimeru ^15,16,27.
   2. Wykorzystaj te same źródła (patrz 1.1) do zdefiniowania istotnych zakresów dla każdego czynnika numerycznego oraz poziomów dla czynników kategorycznych.
   3. Zdefiniuj wyniki eksperymentalne (response), które będą monitorowane i wykorzystane do oceny wydajności flokulacji. W zależności od układu może to być mętność filtratu lub nadsączu, prędkość sedymentacji, wielkość agregatów lub wydajność następującego po nich filtra ^16,23,28-30.
   4. Upewnij się, że analizy wykorzystywane do pomiaru odpowiedzi są ilościowe, odporne oraz powtarzalne/odtwarzalne, aby uzyskane wysokiej jakości dane mogły zostać uzupełnione o eksperymenty przeprowadzone później lub przez innego operatora.
2. Wybierz typ DoE odpowiedni dla liczby badanych czynników oraz stopnia wiedzy zgromadzonej uprzednio na temat układu. Skorzystaj z dostępnej literatury, aby zidentyfikować odpowiedni typ DoE ²⁰.
   1. Wybierz schemat przesiewowy (screening design), jeśli dostępnych jest mało informacji o badanym układzie flokulacji, należy przesiać dużą liczbę parametrów lub niewiele wiadomo o istotnych zakresach parametrów. Typowymi schematami przesiewowymi są pełne i ułamkowe plany czynnikowe. Uwzględnij w schemacie punkty centralne, jeśli oczekuje się nieliniowego wpływu parametrów, np. nasycenia powyżej określonego progu ¹⁹.
   2. Wybierz metodologię powierzchni odpowiedzi (RSM), np. centralny plan kompozytowy (CCD) ³¹ lub plan optymalny ^32,33, jeśli precyzyjnej charakterystyki wymaga tylko kilka czynników o dobrze znanych zakresach.
3. Skonfiguruj DoE za pomocą odpowiedniego oprogramowania, upewniając się, że spełnione są a priori kryteria jakości, takie jak ułamek przestrzeni projektu ²⁰.

2. Przygotowanie eksperymentów flokulacyjnych

Rysunek 1: Schemat flokulacji ekstraktu roślinnego: skala procesowa (lewa) i skala laboratoryjna (prawa). Po ekstrakcji białek za pomocą buforów wodnych, rozproszone cząsteczki szczątków komórkowych są agregowane poprzez dodanie flokulantów. Agregaty są następnie usuwane za pomocą kaskady filtrów workowych i filtrów wgłębnych, a pojemność tych filtrów wraz z mętnością filtratu mogą być wykorzystane do bezpośredniego pomiaru wydajności flokulacji.

1. Opracowanie ogólnego schematu przebiegu eksperymentu (Rysunek 1).
   1. Należy użyć urządzenia do ekstrakcji, które zapewnia rozkład wielkości cząstek taki sam, jakiego oczekuje się (lub który już zaobserwowano) w końcowej skali zastosowania, np. specjalistycznego homogenizatora. Jeśli to możliwe, należy zaprojektować model w mniejszej skali dla ekstraktora, zgodnie z opisem dla homogenizacji liści tytoniu ¹⁰.
   2. Należy określić objętości ekstraktu używane podczas eksperymentów z flokulacją (w tym przypadku 20 ml). Należy wybrać objętość, która pozwoli na obecność reprezentatywnej liczby cząstek w naczyniu reakcyjnym, np. eksperymenty z flokulacją w alikwotach 20 ml dały powtarzalne i skalowalne wyniki dla ekstraktów tytoniowych zawierających ~7% [w/v] substancji stałych ³⁴ i cząstek o wielkości od ~0,5 µm do ~3 mm ¹⁶.
   3. Należy zaprojektować wszystkie operacje monitorowania i operacje po flokulacji w taki sposób, aby były reprezentatywne dla końcowej skali zastosowania, np. wybrać filtry o takich samych właściwościach zatrzymywania cząstek, jak te stosowane w skali produkcyjnej.
2. Uprawa roślin, z których będą pozyskiwane ekstrakty.
   1. Należy zastosować tę samą linię roślin, w tym przypadku Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, oraz warunki uprawy, które będą stosowane podczas produkcji, zgodnie z wcześniejszym opisem ³³.
   2. W przypadku przetwarzania innych surowców należy je przygotować tak, aby były reprezentatywne dla końcowej skali zastosowania, np. użyć autentycznych buforów, uwzględnić wszelkie etapy rozcieńczania podczas procesu i trzymać się przewidywanego pH oraz przewodności, w tym przypadku pH 7,5 i przewodności 30 mS cm^-1.
3. Przygotowanie akcesoriów do filtracji, urządzeń do monitorowania mętności i naczyń do pobierania próbek.
   1. Należy dociąć materiały filtracyjne do wymaganych rozmiarów, w tym przypadku 15 x 15 cm², jeśli nie są to moduły gotowe do użycia. Należy upewnić się, że wszystkie urządzenia do monitorowania i analizy są sprawne, oraz opisać wszystkie probówki na próbki.
   2. Mimo że są to proste zadania, należy przygotować te elementy z odpowiednim wyprzedzeniem, aby nie powodowały one przerw podczas właściwych eksperymentów z flokulacją. Należy unikać opóźnień, ponieważ mogą one wpłynąć na wyniki, biorąc pod uwagę, że flokulacja jest procesem zależnym od czasu.
4. Przygotowanie roztworów stokowych flokulanta. UWAGA: Podczas pracy z flokulantami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, np. rękawiczki. Materiały mogą być niebezpieczne (etykiety ostrzegawcze zgodnie z normami europejskimi UE 67/548/CEE, 1999/45/CE obejmują N, Xi lub Xn). Należy unikać wdychania pyłu i zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów. Należy pracować pod wyciągiem.
   1. Należy wybrać stężenie stokowe dla każdego flokulanta, w tym przypadku 80,0 g L^-1 dla dwóch użytych flokulantów PEI. Należy wybrać stężenia jak najwyższe, aby uniknąć rozcieńczenia próbki podczas dodawania flokulanta, co zmniejszyłoby stężenie cząstek, a tym samym wpłynęło na wydajność flokulacji.
   2. Należy uwzględnić wszelkie wstępne rozcieńczenia wynikające z formulacji polimeru producenta, np. jeśli polimer jest już dostarczany jako 50% [w/v] roztwór wodny. Do tej pory za najodpowiedniejsze uznano roztwory stokowe flokulanta o stężeniu 4–8% [w/v].
   3. Mając na uwadze powyższe punkty, należy upewnić się, że stężenie flokulanta nie spowoduje powstania bardzo lepki roztworu, który utrudniałby pipetowanie, co mogłoby prowadzić do błędów w korygowaniu końcowego stężenia flokulanta.
   4. Jeśli to możliwe, należy zastosować to samo stężenie stokowe dla wszystkich flokulantów, ponieważ ułatwi to opracowanie schematu pipetowania (2.5), zmniejszając tym samym prawdopodobieństwo błędów.
   5. Należy dostosować pH i przewodność każdego roztworu stokowego flokulanta tak, aby odpowiadały warunkom ekstraktów, w tym przypadku pH 4−10 i przewodności 15−55 mS cm^-1. Należy przygotować oddzielne roztwory stokowe dla pojedynczego flokulanta, jeśli dla danego polimeru testowany jest więcej niż jeden zestaw warunków pH i/lub przewodności.
   6. Roztwory stokowe flokulanta należy przygotować na świeżo, nie wcześniej niż 48 h przed użyciem. Chociaż flokulację można indukować za pomocą roztworów polimerowych przechowywanych przez ponad 4 tygodnie, wydajność może spaść z powodu hydrolizy polimeru przy wysokich lub niskich wartościach pH. Więcej szczegółów znajduje się w dokumentacji producenta.
   7. Należy upewnić się, że parametry wybrane dla DoE mogą być precyzyjnie dostosowane dla każdej próbki podczas eksperymentu, np. zapewnić dostępność łaźni grzejnych/chłodzących do regulacji temperatur inkubacji, w tym przypadku 4 °C, 20 °C i 37 °C. Jeśli mieszanie podczas flokulacji jest częścią eksperymentu, należy upewnić się, że urządzenie do mieszania jest reprezentatywne dla końcowej skali zastosowania pod względem parametrów krytycznych, takich jak moc wejściowa.
5. Przekształcenie harmonogramu DoE w schemat pipetowania.
   1. Różne stężenia flokulanta do przetestowania należy przeliczyć na objętości roztworu stokowego, które zostaną dodane do próbek ekstraktu: końcowe stężenia flokulanta należy podzielić przez stężenie stokowe i pomnożyć przez objętość próbki użytej w eksperymentach z flokulacją. Należy określić największą wynikową objętość końcową, np. jeśli 20 ml próbki zostanie zmieszane z maksymalnie 2 ml roztworu stokowego flokulanta, wyniesie ona 22 ml.
   2. Należy obliczyć objętości buforu wymagane do utrzymania tej samej objętości końcowej we wszystkich alikwotach flokulacji na podstawie największej objętości dodawanego roztworu stokowego flokulanta, np. jeśli do próbki należy dodać 0,75 ml roztworu stokowego flokulanta, to wymagane jest 1,25 ml buforu, aby utrzymać końcową objętość próbki 22 ml (2.5.1).
   3. Należy zsumować objętości roztworu stokowego flokulanta dla każdego polimeru i warunku flokulacji, aby obliczyć całkowite objętości roztworu stokowego wymagane do DoE.
6. Zbiór liści tytoniu i przygotowanie ekstraktu.
   1. Należy usunąć sześć górnych liści (lub taką liczbę, jaką wskazują instrukcje procesowe) z roślin tytoniu w odpowiednim wieku, np. 6-tygodniowych, i przenieść je do odpowiedniego urządzenia do ekstrakcji, takiego jak homogenizator lub prasa śrubowa.
   2. Należy dodać trzy objętości buforu ekstrakcyjnego na gram biomasy, np. 300 ml na 100 g i mieszać przez 8 min.
   3. W przypadku testowania różnych wartości pH i/lub przewodności należy przygotować oddzielne ekstrakty z odpowiednimi buforami. W tym przypadku wiąże się to z homogenizacją materiału roślinnego przez 3 x 30 s w blenderze lub sokowirówce ³⁴.
   4. Alternatywnie ekstrakt można przygotować w sposób reprezentatywny dla badanego procesu.
7. Aliquotowanie ekstraktu i dodawanie buforu.
   1. Ekstrakt należy mieszać ręcznie i dokładnie przez całą procedurę, aby zapewnić homogeniczność próbek i równomierny rozkład cząstek.
   2. Ekstrakt należy precyzyjnie rozdzielić między wcześniej opisane probówki reakcyjne poprzez zlewanie, w tym przypadku po 20 ml do każdego naczynia. Probówki 50 ml z podstawką ułatwiają obsługę i są idealne dla próbek 20 ml.
   3. Przy użyciu odpowiedniej pipety należy dodać objętość każdego buforu ekstrakcyjnego wymaganą do utrzymania stałej objętości końcowej dla każdej poszczególnej probówki reakcyjnej.

3. Flokulacja ekstraktów roślinnych przy użyciu różnych polimerów

1. Do próbek należy kolejno pipetować wymaganą objętość roztworu stokowego flokulanta, w tym przypadku 0,1−2,0 ml, zgodnie z randomizowaną kolejnością serii określoną przez DoE. Każdą próbkę należy dokładnie wymieszać natychmiast po dodaniu flokulanta poprzez intensywne wstrząsanie ręczne przez dokładnie 20 s.
   1. W razie potrzeby należy dostosować czas wstrząsania dla innych surowców, aby zapewnić dokładne wymieszanie, jednak należy ściśle przestrzegać stałego czasu mieszania dla wszystkich próbek. Należy pamiętać, że przedłużone mieszanie może spowodować nieodwracalne rozbicie kłaczków, a niespójnie przykładana siła podczas wstrząsania może zafałszować wyniki flokulacji.
2. Opcjonalnie: zmodyfikować opisaną powyżej procedurę w celu jednoczesnego zastosowania dwóch lub więcej flokulantów.
   1. Opcja 1: zamiast pojedynczego polimeru dodać mieszaninę dwóch lub więcej flokulantów, w tym przypadku PEI i chitosan. Należy zastosować kombinacje flokulantów zdefiniowane w DoE. Stosunek oraz bezwzględne stężenia polimerów należy uwzględnić jako oddzielne parametry podczas konfiguracji DoE (1.1).
   2. Opcja 2: dodać dwa lub więcej polimerów sekwencyjnie do ekstraktu.
      1. Jako dodatkowe czynniki podczas konfiguracji DoE należy przyjąć poszczególne stężenia polimerów, ich typ oraz czas inkubacji pomiędzy kolejnymi dodatkami do ekstraktu.
      2. To podejście można również wykorzystać do sprawdzenia, czy wielokrotne dodawanie pojedynczego polimeru może poprawić flokulację. Należy zastosować dodawanie stopniowe, aby zasymulować powolne dodawanie flokulanta, np. w czterech krokach, gdzie w każdym dodaje się 0,25 ml roztworu stokowego flokulanta o stężeniu 80 g L^-1 do objętości 20 ml w ciągu 4 min, co może naśladować dodawanie flokulanta z szybkością przepływu 0,25 ml min^-1.
      3. We wszystkich przypadkach należy określić nową maksymalną końcową objętość próbki dla tej konfiguracji, dodając maksymalne objętości wszystkich flokulantów do objętości próbki (tutaj nadal 22 ml), i w razie potrzeby przeliczyć wymagane objętości roztworów stokowych flokulantów oraz buforów do korekty objętości.
3. Próbki należy inkubować przez czas określony w DoE, zazwyczaj od 3 do 30 min, aby umożliwić tworzenie kłaczków. Należy upewnić się, że wszystkie pozostałe warunki inkubacji, np. temperatura, są ustawione zgodnie z DoE.
4. Należy obserwować i dokumentować tworzenie kłaczków. Postęp flokulacji należy rejestrować zgodnie z wymaganiami, np. jako mm osiadania kłaczków na minutę, mierząc wysokość osadzonych ciał stałych. W razie potrzeby proces flokulacji można przedłużyć, na przykład na całą noc.
5. Przefiltrować ekstrakt po flokulacji.
   1. Należy użyć materiałów filtrujących przygotowanych wcześniej (2.3), aby sklarować ekstrakt po odpowiednim czasie inkubacji poprzez zlewanie próbek z flokulantem przez materiał filtrujący do czystego naczynia lub probówki reakcyjnej.
      1. Przed filtracją nie należy resuspenderować osadzonych kłaczków; ekstrakt należy nanosić na filtr z szybkością ~300 ml min^-1, co odpowiada 3−4 s dla próbki 20 ml.
      2. Należy potwierdzić skuteczność etapu filtracji, jeśli w eksperymentach laboratoryjnych zastosowano inny materiał niż w końcowym procesie pod kątem zatrzymywania cząstek, np. poprzez pomiar rozkładu wielkości cząstek w obu typach próbek ¹¹.
   2. Filtrat należy przeanalizować pod kątem mętności i/lub rozkładu wielkości cząstek zgodnie z wymaganiami, używając odpowiednich urządzeń, np. turbidymetru.
   3. Opcjonalnie: powtórzyć analizę po wydłużonym czasie inkubacji, np. 12−24 h, aby zbadać tworzenie lub ponowne tworzenie niestabilnych kłaczków.
6. Przeanalizować próbki pod kątem zdefiniowanych wcześniej odpowiedzi (1.1.3).
   1. Należy pobrać próbki z filtratów i przeanalizować je pod kątem dodatkowych parametrów odpowiedzi, np. stężeń różnych białek docelowych lub cennych produktów.
   2. Opcjonalnie: przeanalizować retentat (głównie ciała stałe) pod kątem tych samych parametrów, aby zamknąć bilans masowy procesu. W szczególności należy określić wpływ flokulantów na odzysk cieczy, porównując masę ciał stałych pozostałych po potraktowaniu lub niepotraktowaniu próbek flokulantem.
7. Potwierdzić jakość danych i przenieść wyniki do oprogramowania DoE.
   1. Należy zwrócić uwagę na wartości ekstremalne w zebranych danych odpowiedzi, np. niespodziewanie wysokie wartości.
   2. Należy upewnić się, że wszystkie dane odpowiedzi są prawidłowo przypisane do odpowiadających im warunków eksperymentalnych.
   3. Wyniki należy przenieść do oprogramowania DoE, upewniając się, że standardowa i zrandomizowana kolejność serii nie zostały pomylone.

4. Ocena DoE

1. Wykorzystaj wbudowane narzędzia analizy danych oprogramowania DoE do opracowania modelu predykcyjnego zgodnie z wcześniejszym opisem ²⁰.
   1. W razie potrzeby wybierz odpowiedni tryb transformacji danych, aby ułatwić budowę modelu; w tym przypadku transformację logarytmiczną₁₀Stosunek większy niż 10 dla największego kontra najmniejsza wartość odpowiedzi wskazuje, że może być wymagana transformacja danych. Należy zidentyfikować najodpowiedniejszą transformację, korzystając z odpowiednich narzędzi statystycznych, np. wykres pudełkowo-wąsowy (Box-Cox plot) ³⁵.
   2. Wybierz model bazowy, który (i) jest zgodny z wybranym planowaniem eksperymentów (DoE) (1.2) oraz (ii) jest spójny z dotychczasową wiedzą na temat badanego układu, w oparciu o narzędzia analizy wariancji (ANOVA) oprogramowania DoE, np. wielomian drugiego stopnia często lepiej dopasowuje się do obserwowanego efektu czasu inkubacji niż wielomian pierwszego stopnia.
   3. Usuń nieistotne czynniki modelu, np. p >0,05, lub iteracyjnie poprzez odznaczanie interakcji czynników, co redukuje złożoność modelu i zwiększa jego moc predykcyjną.
   4. Potwierdź jakość modelu poprzez porównanie R², skorygowany R²² or przewidywana wartość R² wraz z wykresem prawdopodobieństwa rozkładu normalnego reszt studentizowanych, wykresem reszt w funkcji kolejności pomiarów, wykresem wartości przewidywanych względem rzeczywistych oraz wykresem Boxa-Coxa ³⁶Wszystkie R² wartości powinny mieścić się w zakresie 0,2.
   5. Należy upewnić się, że końcowy model jest zgodny z podstawowymi założeniami fizyki i termodynamiki, np. Nie przewiduje się wystąpienia ujemnych stężeń.
2. Należy wykorzystać model do przewidzenia warunków najkorzystniejszych dla badanego układu, w tym przypadku niskiej mętności.
   1. Wybierz najważniejsze odpowiedzi oraz ich preferowane stany, np. minimalna mętność. Połącz te wybory poprzez maksymalizację funkcji pożądalności lub podobnych narzędzi, które są wbudowanymi funkcjami wielu pakietów oprogramowania do planowania eksperymentów (DoE) ³⁶.
   2. W zależności od zamierzonego zastosowania modelu, należy przeprowadzić serie potwierdzające w celu weryfikacji optymalnych warunków i/lub ogólnej mocy predykcyjnej modelu, np. Jeżeli warunki przewidywane jako najkorzystniejsze nie wchodziły w skład początkowego planu DoE, należy wybrać je do przeprowadzenia w ramach eksperymentów uzupełniających.

5. Udoskonalenie modelu i weryfikacja mocy predykcyjnej

1. Zawęź początkową przestrzeń projektową do najbardziej pożądanych warunków operacyjnych, np. niskiej mętności w zakresie 0−1,000 nephelometric turbidity units (NTU), w oparciu o przewidywania modelu (4.2).
2. Skonfiguruj nowy plan eksperymentów (DoE) w obrębie tych zakresów, uwzględniając tylko te czynniki, które zostały zidentyfikowane jako istotne lub odpowiednie (4.1.2)).
   UWAGA: Czynnik może być istotny w ramach analizy modelu, ale nieistotny dla procesu, tj. jego wpływ na odpowiedź wynosi <1% w porównaniu z wpływem innych czynników.
3. Powtarzaj kroki 1-5.2 do momentu, aż jakość przewidywań modelu będzie zgodna z wymaganiami, np. gdy odchylenie standardowe modelu wskazane przez oprogramowanie będzie wystarczające dla planowanego zastosowania. W razie potrzeby zmodyfikuj strategię eksperymentalną dla tych iteracji, np. stosując tylko jeden flokulant w procesie udoskonalania.
4. Przenieś i potwierdź wyniki z modelu w skali zredukowanej do skali pilotażowej lub końcowej skali produkcyjnej.

Wyniki

Flokulacja ekstraktu z tytoniu z różnymi polimerami

Opisana powyżej metoda została z sukcesem wykorzystana do opracowania procesu flokulacji ekstraktów tytoniowych podczas produkcji przeciwciała monoklonalnego (przeciwciała 2G12 neutralizującego HIV) oraz białka fluorescencyjnego (DsRed) (Rysunek 1) ¹⁶, a następnie przeniesiona na inne białka, w tym lektyny, kandydatów na szczepionki przeciw malarii o...

Dyskusja

Najważniejszym aspektem do rozważenia podczas przygotowywania DoE w celu charakterystyki flokulacji cząstek jest to, że projekt musi w zasadzie umożliwiać wykrycie i opisanie przewidywanych lub możliwych efektów ^36,38, np. wpływu pH, rodzaju polimeru oraz stężenia polimeru ¹⁶. Dlatego przed rozpoczęciem właściwych eksperymentów ważne jest określenie frakcji przestrzeni projektowej (FDS). FDS jest ułamkiem wielowymiarowej przestrzeni eksperymentalnej (obejmującej czynniki projektu, np.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przenośny mętnościomierz 2100P	Hach	4650000	Zmętnienie
Przeciwciało 2G12	Polymun	AB002	Przeciwciało referencyjne
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	Urządzenie SPR
BP-410	Furh	2632410001	Filtr workowy
Catiofast VSH	BASF	79002360	Środek
flokulacyjnyWirówka 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Wirówka
Probówka wirówkowa 15 ml	Labomedic	2017106	Probówka reakcyjna
Probówka wirówkowa 50 ml wolnostojąca	Labomedic	1110504	Probówka reakcyjna
Chitozan	Carl Roth GmbH	5375.1	Środek flokulacyjny
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE	software
Fosforan disodowy	Carl Roth GmbH	4984.3	Komponent Media
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Nawóz
Forma -86C Zamrażarka ULT	ThermoFisher	88400	Zamrażarka
Szklarnia	n.a.n.a.Do		uprawy roślin
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm	Grodan	102446	Rockwool
block HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Komponent medialny
K700P 60D	Pall	5302305	Głęboka warstwa filtracyjna
KS50P 60D	Pall	B12486	Głęboka warstwa filtracyjna
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Tkanina filtracyjna
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH-metr / konduktometr
Osram zimna biel 36 W	Osram	4930440	Źródło światła
Fitotron	Ilka Zell	n.d.Do	uprawy roślin
Polymin P	BASF	79002360	Środek flokulacyjny
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Urządzenie do homogenizacji z niestandardowym narzędziem ostrzowym
Białko A	Technologie życia	10-1006	Białko wiążące przeciwciało
Chlorek sodu	Carl Roth GmbH	P029.2	Składnik medialny
Synergia HT	BioTek	SIAFRT	Czytnik płytek fluorescencyjnych
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Komponent medialny
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Komponent medialny
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Obudowa filtra
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Pomiar rozkładu wielkości cząstek DLS