Artykuł metodologiczny

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

DOI:

10.3791/53949

⸱

12 kwietnia 2016

 ,  ,  , 
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, Dental Institute, King's College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotna neurogeneza to dynamiczny i złożony proces podczas rozwoju embrionalnego, który tworzy początkowy układ ośrodkowego układu nerwowego. Podczas tego procesu część nerwowych komórek macierzystych ulega różnicowaniu i daje początek pierwszym populacjom zróżnicowanych neuronów pierwotnych w powstającym ośrodkowym układzie nerwowym. Kilka modelowych organizmów kręgowców wykorzystano do zbadania mechanizmów specyfikacji, wzorców i różnicowania losu komórek nerwowych. Wśród nich jest afrykańska żaba szponiasta, Xenopus, która zapewnia potężny system do badania mechanizmów molekularnych i komórkowych odpowiedzialnych za pierwotną neurogenezę ze względu na szybki i dostępny rozwój oraz łatwość manipulacji embriologicznych i molekularnych. W tym miejscu przedstawiamy wygodną i szybką metodę obserwacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym Xenopus. Za pomocą barwienia przeciwciałami i immunofluorescencji na skrawkach zarodków Xenopus jesteśmy w stanie obserwować lokalizacje nerwowych komórek macierzystych i zróżnicowanych neuronów pierwotnych podczas pierwotnej neurogenezy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U kręgowców rozwój ośrodkowego układu nerwowego składa się z kilku charakterystycznych, ale następujących po sobie etapów. Pierwszym krokiem jest indukcja neuronalna, kiedy naiwne komórki ektodermalne są skierowane na los neuronalny, a nie naskórkowy. Na tym etapie w Xenopus i innych systemach modelowych 1,2 zaangażowanych jest kilka powiązanych ze sobą mechanizmów regulacyjnych. Proces ten jest przede wszystkim koordynowany przez czynniki wydzielane przez leżącą poniżej mezodermę, takie jak chordyna, noggin i folistatyna 3-7. Po indukcji neuronalnej podzbiór neuronalnych komórek progenitorowych opuszcza cykl komórkowy i zaczyna różnicować się w procesie zwanym neurogenezą pierwotną. Nie wszystkie prekursory neuronalne różnicują się w tym czasie. Pozostałe nerwowe komórki prekursorowe nadal się namnażają, utrzymując w ten sposób pulę komórek macierzystych potrzebną do dalszego wzrostu ośrodkowego układu nerwowego przez cały okres rozwoju i do dorosłości.

Te proliferujące neuronalne komórki prekursorowe charakteryzują się ekspresją genu SRY (region determinujący płeć Y)-box 3 (sox3) 8-11. Druga populacja komórek, które opuszczają cykl komórkowy i zobowiązują się do zróżnicowanego losu, jest identyfikowana na podstawie ekspresji markerów genów różnicowania, tubuliny, beta 2B klasy IIb (tubb2b, N-tub) i czynnika transkrypcyjnego mieliny 1 (myt1) 12-14. Takie zróżnicowane komórki neuronalne ostatecznie dają początek różnym kategoriom neuronów, w tym między innymi neuronom ruchowym, między- i czuciowym umieszczonym w różnych obszarach cewy nerwowej 15-17.

Podczas gdy wiele wysiłku poświęcono na odkrycie mechanizmów regulacyjnych, które rządzą zdarzeniami determinującymi wzorce i losy w przedniej części neuroektodermy, mniej uwagi poświęcono badaniu zdarzeń neurogennych, które występują po początkowym etapie wzorcowania. Rzeczywiście, transdukcja sygnału, regulacje transkrypcyjne, a także modyfikacje potranslacyjne są zaangażowane w ten późniejszy etap, kontrolując zarówno czas, jak i specyfikację linii podczas neurogenezy 18-20. Dalsze badania nad tymi mechanizmami wymagają niezawodnej metody łatwej wizualizacji i rozróżniania różnych populacji komórek neuronalnych. Wyżej wymienione markery neuronalne, w tym Sox3, Myt1 i N-tub, mogą zapewnić środki do identyfikacji tych różnych populacji komórek, zapewniając w ten sposób niezbędne podstawy do ujawnienia mechanizmów leżących u podstaw różnicowania neuronów 21-23.

Chociaż w innych organizmach modelowych wykazano różnicowe znakowanie populacji komórek neuronalnych, stosunkowo niewiele badań w pełni wykorzystało system Xenopus w tym zakresie. Wynika to głównie z braku kompatybilnych przeciwciał, które niezawodnie identyfikują różne populacje komórek nerwowych w cewie nerwowej. W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnicowania neuronów we wczesnych zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego, która zapewnia solidne i wygodne podejście do badania pierwotnej neurogenezy u Xenopus. Protokół ten powinien stanowić wystarczające wytyczne dla badaczy zainteresowanych wczesnym rozwojem ośrodkowego układu nerwowego Xenopus między stadium 26 a 45.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Centrum Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu w Manchesterze i były objęte licencją brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

1. Pobieranie i utrwalanie zarodków Xenopus

  1. Przygotuj odczynniki i materiały do eksperymentów.
    1. Przygotować 10x zmodyfikowane Dzwonki Marca (MMR) rozpuszczając 56,5 g NaCl w około 800 ml ultraczystej wody i dodając roztwory podstawowe 1 M KCl, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2 i 1 M HEPES pH 7,4, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES. Doprowadzić pH do 7,4 na 10 M NaOH, a następnie dostosować końcową objętość do 1 l.
    2. Wysterylizować 10-krotny roztwór MMR przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 20 minut w cyklu płynnym. Po użyciu rozcieńczyć ddH2O do 0,1x końcowego stężenia i dodać 20 mg/l gentamycyny, aby zahamować rozwój drobnoustrojów.
    3. Przygotować 10x TBS roztwór, mieszając 24 g Tris-HCl, 5,6 g Tris-base, 88 g NaCl i rozpuszczając w około 900 ml ultraczystej wody. Końcowy roztwór będzie miał wartość pH około 7,6. Dostosować za pomocą 10 M NaOH lub stężonego HCl, aby osiągnąć końcowe pH 7,6 i końcową objętość do 1 l.
    4. Po użyciu przygotuj 1x TBS, rozcieńczając 1 część 10x roztworu TBS z 9 częściami ultraczystej wody.
    5. Przygotuj 10x sól MEM, rozpuszczając 209,2 g MOPS w około 800 ml ultraczystej wody i dodając roztwory podstawowe 0,5 M EGTA i 1M MgSO4, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mM EGTA, 10 mM MgSO4. Doprowadzić pH do 7,4 na 10 M NaOH, a następnie dostosować końcową objętość do 1 l.
    6. Wysterylizować roztwór soli MEM przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 20 minut w cyklu płynnym (roztwór może zmienić kolor na żółty po kilku miesiącach przechowywania w temperaturze pokojowej lub po autoklawowaniu, ale ta zmiana koloru nie ma wpływu na jego użycie). Nie należy jednak stosować roztworu po długotrwałym przechowywaniu (ponad 6 miesięcy).
    7. Przygotuj 1x roztwór MEMFA, rozcieńczając 1 część soli MEM, 1 część 37% formaldehydu z 8 częściami wody ultraczystej (v/v, stabilna w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1-2 tygodnie).
    8. Przygotować 4% paraformaldehydu w TBS (do późniejszego barwienia z udziałem falloidyny), rozpuszczając 4 g proszku paraformaldehydu w 100 ml 1x TBS roztworu Podgrzej roztwór do 60 °C i dodaj kilka kropli 10 M NaOH, aby ułatwić rozpuszczenie. Podwielokrotność porcji w objętości 5-10 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C. Nie zamrażać ponownie po rozmrożeniu.
      UWAGA: Proszek paraformaldehydu jest drażniący i jest toksyczny w przypadku wdychania, dlatego etap ważenia powinien być wykonywany w dygestorium.
    9. Przed pobraniem próbki oznaczyć tyle szklanych fiolek o pojemności 4 ml zakrętkami.
    10. Przygotować 15% żelatyny/15% sacharozy, wlewając 20 ml 40% żelatyny rybnej (podgrzej w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 8 g sacharozy i napełnić probówkę do linii 50 ml 1x TBS.
    11. Umieść rurkę żelatynową na mieszalniku obrotowym lub łożu rolkowym, aby wymieszać przez noc w temperaturze pokojowej. Ten roztwór żelatyny jest stabilny w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień. Nie używać przeterminowanego roztworu i nie zamrażać-rozmrażać.
  2. Przygotować i utrwalić zarodki X. laevis lub X. tropicalis wyhodowane do pożądanych stadiów.
    1. Hodowla zapłodnionych zarodków X. laevis lub X. tropicalis w 0,1x MMR z gentamycyną aż do pożądanych etapów.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zarodki należy pobierać między etapami od 23 do 40. Późniejsze pobranie zarodków po 40 etapie jest możliwe, zwłaszcza gdy obserwuje się wzrost aksonów z rdzenia kręgowego, ale należy pamiętać, że może być wymagany dodatkowy czas penetracji żelatyny. Zarodki mogą być typu dzikiego, transgeniczne, zmutowane, leczone inhibitorami, wstrzykiwane Morpholino (MO) lub elektroporowane 23,24.
    2. Zbierz 20-50 zarodków w każdej szklanej fiolce o pojemności 4 ml, usuń jak najwięcej pożywki i zastąp MEMFA.
      UWAGA: Jeśli kolejne barwienie obejmuje falloidynę, użyj 4% paraformaldehydu zamiast MEMFA, ponieważ dostarczane na rynku roztwory formaldehydu zwykle zawierają do 10% metanolu jako stabilizatora, który będzie zakłócał barwienie falloidyną.
    3. Ustalić na noc w temperaturze 4 °C lub, w nagłych przypadkach, w temperaturze pokojowej na 2 godziny na mieszalniku obrotowym. Zarodki będą stabilne w roztworze utrwalającym przez co najmniej 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
    4. Po utrwaleniu myj zarodki 3 razy przez 20 minut przy użyciu 1x TBS z 0,05% Triton X-100. Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej TBS-Triton i dodaj 3 ml 15% żelatyny/15% sacharozy do każdej fiolki.
    5. Umieścić fiolki na łożu rolkowym na noc w temperaturze pokojowej. W przypadku zarodków starszych niż 40 stopień należy zastosować co najmniej 24 godziny czasu penetracji. Po penetracji należy natychmiast przejść do sekcji 2.2 następnego dnia.

2. Dopasowywanie i kriosekcja zarodków Xenopus

  1. Przygotuj odczynniki i materiały do eksperymentów.
    1. Weź jedno pudełko dodatnio naładowanych szkiełek, najlepiej nieotwartych.
      UWAGA: Po otwarciu szkiełka należy przechowywać w suchym stanie (np. w suchym pudełku) i zużyć w ciągu 1 miesiąca, aby zapewnić utrzymanie ładunku elektrostatycznego na szkiełkach. Nie używaj przeterminowanych szkiełek, ponieważ próbki odpadną podczas barwienia immunologicznego.
    2. Wstępnie schłodzić komorę kriostatu do temperatury -30 °C. Ustawić parametry przyrządu na -35 °C dla mikrotomu i grubości przekroju 12 μm. Zamontuj grubą szklaną płytkę pokrywową na scenie i pozwól kriostatowi zrównoważyć się przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem sekcji.
    3. Przygotuj pędzle malarskie do przesuwania pasków sekcji, trzymaj w komorze kriostatu.
    4. Przygotuj ołówki do pisania na szkiełkach, umieść je w temperaturze pokojowej.
    5. Podczas kriosekcji nosić rękawiczki. Nie używaj gołymi rękami.
  2. Montaż zarodków Xenopus
    1. Ostrożnie odessać 5-10 zarodków ze szklanej fiolki za pomocą plastikowej lub szklanej pipety, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza. Przenieś zarodki do komory montażowej i obserwuj pod stereoskopem. Napełnij komorę montażową roztworem żelatyny, aby zapewnić sztywność bloku sekcji.
    2. Ułóż zarodki zgodnie z rysunkiem 1 za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Zaznacz orientację głów, rysując strzałkę na krawędzi komory za pomocą markera kompatybilnego z kriogeniką. W przypadku wielu grup zarodków należy również zapisać opis każdej grupy na brzegu odpowiedniej komory.
    3. Ostrożnie umieść komorę poziomo w piankowym pudełku wypełnionym do połowy suchym lodem i zamknij pokrywę. Obserwuj, jak komora montażowa zamarza w ciągu 5-10 minut. Każdą komorę należy przetwarzać kolejno (tj. umieścić poprzednią komorę na suchym lodzie przed przejściem do następnej), ponieważ pozostawi to wystarczająco dużo czasu na zamarznięcie każdej komory i zapobiegnie przepełnieniu pojemnika na suchy lód.
      UWAGA: Zamrożone komory montażowe nie muszą stać poziomo i można je układać w stosy wewnątrz pudełka.
    4. Kontynuować kriosekcję lub, jeśli to konieczne, przechowywać zamrożone próbki w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1-2 tygodnie bez utraty immunogenności.
  3. Kriosekcja zamontowanych zarodków Xenopus
    1. Wyjmij zamrożony blok próbki z komory, naciskając dno komory za pomocą patyczka (takiego jak ołówek).
    2. Dodać kilka kropli pożywki do zamrażania tkanek (glikol polietylenowy i pożywkę zawierającą alkohol poliwinylowy) na krążek do przechowywania próbki i zamontować blok próbki tak, aby przedni koniec zarodków był skierowany do góry (ryc. 2). Pozostawić zamontowany blok w komorze kriostatu na około 1 minutę lub do momentu, gdy podłoże do zamrażania tkanek stanie się nieprzezroczyste.
    3. Natychmiast zainstaluj krążek do przytrzymywania próbki na mikrotomie dolną stroną bloku próbki skierowaną do góry. Odetnij część bloku próbki za pomocą ostrza, gdy blok próbki jest jeszcze stosunkowo "miękki", aby zmniejszyć długość każdej sekcji (w razie potrzeby). Pozostawić krążek do przytrzymania próbki na mikrotomie przez co najmniej 5 minut, aby umożliwić osiągnięcie równowagi temperatury.
    4. Stopniowo przycinaj blok próbki w dół, aż główki kijanek będą widoczne przez półprzezroczystą żelatynę. Aby zwiększyć prędkość przycinania, na tym etapie należy zastosować wyższe (grubsze) ustawienie grubości przekroju (np. 20-25 μM) (np. włączając opcję "trim"), ale nie za grube, ponieważ blok próbki może spaść z krążka trzymającego próbkę. Obserwuj wydajność kriostatu, taką jak ostrość i kąt ostrza na tym etapie, aby zapewnić wygenerowanie długiego paska kolejnych sekcji.
    5. Gdy główki kijanek staną się widoczne, dostosuj ustawienia kriostatu z powrotem do normalnych (np. 10-12 μM) i wyczyść zarówno mikrotom, jak i stolik za pomocą pędzla. Delikatnie wykonaj 2-3 sekcje jako próbę, używając ustawienia pokrętła ręcznego (nie używaj ustawienia zmotoryzowanego), aby upewnić się, że gotowe plastry mogą tworzyć paski, nie zachodzące na siebie ani nie przyklejające się do ostrza.
    6. Kontynuuj przycinanie, aż główki kijanek będą prawie odsłonięte (może to wymagać pewnego doświadczenia, ale jest osiągalne). Zetrzyj wszelkie pozostałe sekcje na scenie, a rozpocznie się zbieranie fragmentów próbki.
    7. Zrób około 10-15 sekcji i pozwól im uformować długi pasek.
    8. Odwróć grubą szklaną płytkę pokrywową na bok i delikatnie zdejmij pasek z ostrza za pomocą pędzla z cienką końcówką i ułóż go na stoliku długą osią równoległą do ostrza.
    9. Wybrać jedno dodatnio naładowane szkiełko w temperaturze pokojowej, oznaczyć je ołówkiem (który nie zostanie zmyty podczas kolejnych zabiegów barwienia), docisnąć szybko, ale stanowczo do paska stroną z etykietą skierowaną w dół i wyjąć szkiełko z komory kriostatu. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, pasek powinien natychmiast przykleić się do dodatnio naładowanego suwaka (Rysunek 3A).
    10. Powtórz ten krok, aby na każdym slajdzie znajdowało się 20-30 plasterków ułożonych równolegle (Rysunek 3B). Jest to wystarczające do pokrycia całego obszaru mózgu zarodków X. tropicalis oraz większości obszarów przodomózgowia i śródmózgowia zarodków X. laevis.
    11. Szkiełka należy suszyć na powietrzu przez 10 minut, a następnie natychmiast je przechowywać w pojemniku na szkiełka w temperaturze -80 °C przez co najmniej 3-6 miesięcy bez utraty immunogenności.

3. Barwienie immunologiczne wyciętych zarodków Xenopus

  1. Przygotuj odczynniki i materiały do eksperymentów.
    1. Przygotuj 0,05% TBS-Triton X-100, dodając Triton X-100 do 1x TBS, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,05%. Roztwór ten jest stabilny w temperaturze pokojowej przez 3-4 dni. Nie używaj przeterminowanego roztworu.
    2. Przygotować 5% inaktywowanej termicznie surowicy koziej lub 5% BSA w TBST jako bufor blokujący. Po pierwsze, dezaktywuj termicznie surowicę kozioło-jagnięcą, umieszczając około 20-30 ml surowicy w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 30-60 minut. Porcję rozlać do 1,5 ml probówek wirówkowych i zamrozić w temperaturze -20 °C. Po użyciu nie jest wymagana ponowna inaktywacja.
    3. Rozcieńczyć inaktywowaną termicznie surowicę lub BSA w TBST, aby osiągnąć końcowe stężenie 5% przed użyciem.
    4. Przygotować odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe w zależności od rozcieńczeń w buforze blokującym (np. anty-Sox3 1:500 10,25/1:250 anty-Myt1 26/antyacetylowana tubulina). Na każde szkiełko należy użyć około 100 μl roztworu przeciwciał.
    5. Przygotować odpowiednie przeciwciała fluorescencyjne (np. przeciwciała przeciwko myszy/czerwonej fluorescencji królika) w buforze blokującym (zwykle 1:500).
    6. (opcjonalnie) Dodaj falloidynę sprzężoną z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (1:500) do wtórnej mieszanki przeciwciał, aby ujawnić sieć aktyny.
    7. (opcjonalnie) Dodaj DAPI (0,5 μg/ml stężenie końcowe) do wtórnej mieszanki przeciwciał, aby uwidocznić lokalizację jądrową.
    8. Wyjmij środek montażowy zapobiegający blaknięciu z zamrażarki i rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.
  2. Barwienie immunologiczne
    1. Wyjmij zamrożone szkiełka z temperatury -80 °C i umieść je na kawałku ręcznika papierowego w okapie wentylacyjnym na co najmniej 1 godzinę, aby wyeliminować wszelkie skondensowane kropelki wody, a następnie upiecz wysuszone szkiełka na bloku grzewczym o temperaturze 85-90 °C z plastrami skierowanymi do góry przez 15 minut, aby aktywować mechanizm przylegania. Na koniec pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej (co najmniej 10 min).
    2. Napełnij słoik do barwienia czystym acetonem i inkubuj szkiełka w acetonie przez 10 minut, aby usunąć żelatynę rybną. Jeśli ma być leczonych wiele szkiełek, ułóż je na stojaku do barwienia. Szkiełka poddane obróbce suszyć na powietrzu przez 15 minut w okapie wentylacyjnym. Nie używaj ponownie acetonu.
    3. Ostrożnie narysuj pierścień wokół próbek na szkiełku za pomocą pisaka PAP, nie dotykając próbek. Upewnij się, że pierścień jest samozamykający, w przeciwnym razie roztwór przeciwciał wypłynie podczas barwienia. Całkowicie wysuszyć pierścień pióra PAP.
    4. Napełnij kolejny słoik do barwienia 1x TBS bez Triton X-100. Włóż wysuszone szkiełka do słoika do barwienia i pozwól na ponowne nawodnienie przez co najmniej 1 godzinę. W międzyczasie przygotuj bufor blokujący, rozcieńczając inaktywowaną termicznie surowicę kozią lub BSA do 5% stężenia końcowego przy użyciu 1x TBS z 0,05% Triton X-100.
    5. Zrób mokre pudełko, umieszczając 1-2 6-dołkowe płytki w pudełku na żywność z zatrzaskiem i napełnij studzienki do połowy ultraczystą wodą. Wyjmij nawodnione szkiełka podstawowe ze słoika do barwienia i umieść je poziomo na płytkach 6-dołkowych (bez pokrywki płytki).
    6. Ostrożnie dodać 300-600 μl buforu blokującego do pierścienia PAP. Zamknij mokre pudełko, blokując pokrywę na miejscu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
    7. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe w buforze blokującym. Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć 100-150 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał na szkiełko. Jeśli przetwarzanych jest wiele slajdów, proporcjonalnie zwiększ głośność.
    8. Po zablokowaniu ostrożnie usunąć bufor blokujący ze szkiełek przez aspirację i szybko dodać roztwór przeciwciała pierwotnego, aby zapobiec wysuszeniu, a następnie zamknąć mokre pudełko i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Następnego dnia należy usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała ze szkiełek przez aspirację. Umyj szkiełka, wkładając je do słoików do barwienia wypełnionych 1x TBS z 0,05% Triton X-100, 3 razy po 15 minut każdy. W międzyczasie rozcieńczyć odpowiednie fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe z buforem blokującym (z lub bez DAPI lub falloidyny).
    10. Ostrożnie dodać 100-150 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych na szkiełka. Umieść szkiełka w mokrym pudełku i uszczelnij pokrywę. Inkubuj szkiełka przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
    11. Umyj szkiełka w słoikach do barwienia wypełnionych 1x TBS z 0,05% Triton X-100, 3 razy po 15 minut każdy. Po ostatnim praniu rozmrozić środek montażowy zapobiegający blaknięciu w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przez 10 minut, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 °C. Przed użyciem schłodzić medium montażowe do temperatury pokojowej.
    12. Dodać około 20 μl (jedna kropla) podłoża mocującego na szkiełko podstawowe i nałożyć na próbki duże szkiełko nakrywkowe (o wymiarach co najmniej 22 mm x 64 mm). Obserwuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego w ciągu 6 godzin od montażu.
      1. Jeśli obrazowanie nie może być wykonane tego samego dnia, uszczelnij szkiełka za pomocą lakieru do paznokci i umieść je w mokrym pudełku w temperaturze 4 °C na noc.
        UWAGA: Podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu po kilku dniach stopniowo utlenia się (i brązowieje), dlatego zaleca się wykonanie zdjęć tak szybko, jak to możliwe.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki pokazują przekroje zarodków Xenopus stadium 30 na różnych poziomach, a mianowicie przodomózgowia, śródmózgowia, tyłomózgowia i rdzenia kręgowego, zabarwionych różnymi przeciwciałami (Rysunek 4). Jak wspomniano, populacja neuronalnych komórek progenitorowych znakowanych Sox3 znajduje się w pobliżu światła cewy nerwowej, podczas gdy zróżnicowane neurony pierwotne znakowane MyT1 migrują na zewnątrz i lokalizują się w pobliżu warstwy brzeżnej (blaszki podstawnej) cewy nerwowej. Anty-acetylotubulina znakuje aksony w zróżnicowanych neuronach, które można zaobserwować w całej cewie nerwowej.

Side-specific gene knockdown or overexpression jest szeroko stosowaną metodą w neurobiologii do oceny, czy modulacja ekspresji określonego genu (genów) zakłóca wzrost i różnicowanie komórek neuronalnych. W takich przypadkach do jednego z dwóch blastomerów w stadium 23 wstrzykuje się Morpholinos (MOs), jak i konstrukty DNA niosące gen(y) sterowane promotorem. Alternatywnie można je wstrzyknąć do komory mózgu, a następnie poddać elektroporacji, co spowoduje knockdown lub nadmierną ekspresję pożądanego genu (genów) 27. W obu przypadkach skutki będą ograniczone do jednej strony zarodka, co sprawi, że przeciwna strona zarodka będzie nieleczoną kontrolą wewnętrzną.

Po fiksacji, sekcji i barwieniu immunologicznym, wpływ knockdownu/nadekspresji genów jest określany ilościowo poprzez liczenie i porównywanie liczby komórek w różnych populacjach po obu stronach zarodka. Gromadząc te dane z kilku zarodków, można przeprowadzić analizę statystyczną. W naszych reprezentatywnych wynikach nie stwierdzono żadnych zaburzeń w zarodkach. Przykłady zaburzeń genów i ich wpływu na różne populacje komórek neuronalnych można znaleźć w piśmiennictwie 20,23.

figure-results-1
Rysunek 1: Ułożenie i orientacja zarodka w formie przekroju. (A) Rysunek przedstawiający zespół montażowy, zwróć uwagę, że taca została opisana datą, etapem i orientacją zarodków. (B) Obraz przedstawiający naturalny wygląd zespołu montażowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Orientacja i położenie bloku żelatyny na krążku do przechowywania próbki. (A) Rysunek przedstawiający zespół bloku przekroju, należy zauważyć, że zarodki znajdują się w pozycji "głowa do góry", a blok żelatyny jest mocno przymocowany do krążka przytrzymującego próbkę za pomocą pożywki do zamrażania tkanek u podstawy (patrz rysunek 2B). (B) Obraz przedstawiający naturalny wygląd zespołu bloku sekcji, zwróć uwagę na nagromadzenie pożywki do zamrażania tkanek między blokiem żelatyny a krążkiem do przechowywania próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Cięcie ciągłe. (A) Model studzienki sekcyjnej. Krążek do trzymania próbki powinien być obrócony i przymocowany do pozycji, w której zarodek jest skierowany do góry. Po kilku (6-10) sekcjach długi pasek płytek o przekroju ciągłym jest delikatnie oddzielany od ostrza (niebieski) za pomocą cienkiej szczotki, a następnie obracany o 90° na płycie mocującej. Następnie dodatnio naładowana prowadnica o temperaturze pokojowej jest mocno dociskana do paska sekcji skierowanego w dół i natychmiast podnoszona do zebranych gotowych pasków. (B) Zwykle każdy slajd może pomieścić 2 równoległe linie pasków, jak pokazano. Pamiętaj, aby dokonać szczegółowego zapisu na etykiecie slajdu za pomocą ołówka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Przekrój kijanek X. laevis stadium 30 i barwienie w tkance nerwowej, 20X. (A) Schematy wskazujące względne położenie (przodomózgowie, śródmózgowie, tyłomózgowie i rdzeń kręgowy) płaszczyzn przekroju na kijankach Xenopus. (B) Odpowiednie przekroje poprzeczne zabarwione anty-Sox3 (czerwony), anty-acetylowaną tubuliną (zielony) i DAPI (niebieski), pokazujące względne lokalizacje pul nerwowych komórek macierzystych, a także neurofilamentów w cewie nerwowej. (C) Odpowiednie przekroje poprzeczne zabarwione anty-MyT1 (czerwony) i DAPI (niebieski), pokazujące względne lokalizacje zróżnicowanych neuronów pierwotnych w cewie nerwowej. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy wygodną i skuteczną metodę wizualizacji pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus . Metoda ta pozwala na ocenę różnych typów komórek nerwowych, w tym neuronalnych komórek macierzystych i zróżnicowanych neuronów pierwotnych przy użyciu markerów specyficznych dla typu komórki.

Protokół jest ogólnie solidny i ma bardzo wysoki poziom odtwarzalności. W przypadku zarodków, które znajdują się w fazie przed wykluciem (tj. do stadium 28), zalecamy ręczne usunięcie błony witeliny przed utrwaleniem, ponieważ pozwala to na pełne rozwinięcie zarodków przed utrwaleniem. Jest to szczególnie ważne przy pobieraniu zarodków na stosunkowo wczesnych etapach (przed wykluciem), ponieważ wygięte zarodki są niezwykle trudne do ułożenia w pożądanej orientacji wewnątrz komory montażowej. Nie doświadczyliśmy utraty immunogenności po utrwaleniu MEMFA lub PFA, dlatego dodatkowy etap pobierania antygenu nie jest konieczny w przypadku tego protokołu. Ponadto tę procedurę barwienia immunologicznego można przeprowadzić w próbkach z hybrydyzacji chromogenicznej/fluorescencyjnej in situ. W takim scenariuszu zaleca się pominięcie etapu leczenia proteazą K podczas protokołu hybrydyzacji in situ. Po reakcji chromogenicznej/fluorescencyjnej substratu próbki można przemyć TBS i zanurzyć w roztworze żelatyny rybnej w podobny sposób, jak w przypadku próbek utrwalonych MEMFA/PFA. Fiolki z próbkami można chronić przed światłem, owijając je folią aluminiową, jeśli fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zostanie później zobrazowana wraz z barwieniem immunofluorescencyjnym.

W niektórych przypadkach zarodki mogą nadmiernie się kurczyć po penetracji żelatyny. Jest to najprawdopodobniej spowodowane albo niewystarczającą fiksacją, albo niewystarczającą ekstrakcją TBS-Triton. Upewnij się, że zarodki zostały utrwalone w PFA/MEMFA przez co najmniej 2-3 godziny lub najlepiej przez noc w temperaturze 4 °C. Jeśli problem będzie się powtarzał, wydłuż czas prania TBS-Triton do 3 przez 1 godzinę.

Podczas kriosekcji sztywność bloku próbki może się różnić, ponieważ różne partie żelatyny rybnej mają różne właściwości. Problem ten można częściowo skompensować, regulując temperaturę mikrotomu. Niższa temperatura spowoduje powstanie "twardszego" bloku próbki, jednak w zbyt niskiej temperaturze blok próbki stanie się ostry i trudny do pokrojenia. Pewne dostrojenie lub praktyka (przy użyciu próbnych bloków próbek bez zarodków) przed każdym cięciem może być korzystne przed użyciem na szczególnie cennych próbkach.

Często spotykanym problemem podczas cięcia jest to, że cienkie sekcje czasami mają tendencję do przyklejania się do grubej szklanej płyty, zamiast pozostawać płasko na stalowej scenie. Może to być szczególnie uciążliwe, ponieważ stale przerywa ciągły proces cięcia. Takie przypadki są zwykle spowodowane jedną z dwóch przyczyn: komora sekcyjnej i (zwłaszcza) gruba płyta szklana nie są wystarczająco zimne lub nadmierny ładunek elektrostatyczny na maszynie i operatorze, zwłaszcza przy suchej pogodzie. Ten pierwszy problem można rozwiązać, obniżając temperaturę komory sekcyjnej i pozostawiając szklaną płytkę w środku na dodatkowy czas (ewentualnie na noc); a to ostatnie poprzez odpowiednie uziemienie kriostatu. Podłączenie metalowej powierzchni kriostatu do metalowego kranu lub podobnego systemu rur wodnych wykonanych z metalu może być alternatywnym sposobem uwalniania ładunków elektrostatycznych. Po każdym użyciu grubą szklaną płytkę należy dobrze umyć niekorozyjnym detergentem (takim jak płyn do mycia naczyń), spłukać ultraczystą wodą, spryskać czystym etanolem i zawinąć w ręcznik, aby chronić powierzchnię i krawędzie przed uszkodzeniem.

Przeciwciała wymienione w protokole są na ogół swoiste i rzadko spotykamy się z niespecyficzną adsorpcją lub wysokim sygnałem tła. Należy zauważyć, że w przypadku stosowania inaktywowanej termicznie surowicy koziej/jagnięcej jako środka blokującego, należy unikać nadmiernej inaktywacji termicznej (co objawia się tworzeniem się puszystego osadu w surowicy), ponieważ ten środek strącający jest wysoce atrakcyjny dla przeciwciał drugorzędowych i może przyczyniać się do źródła wysokiego tła.

Możliwe, a czasem pożądane jest wykonanie podwójnego barwienia w celu jednoczesnej wizualizacji różnych populacji komórek neuronalnych. Takie podwójne barwienie jest możliwe i generalnie daje zadowalające rezultaty przy następujących kombinacjach: Sox3/N-tub lub Myt1/N-tub. Jednak podwójne barwienie Sox3 i Myt1 jest skomplikowane ze względu na fakt, że oba przeciwciała pochodzą od królika. Przetestowaliśmy kilka zestawów do bezpośredniego znakowania przeciwciał, jednak nie zaobserwowano zadowalających wyników (niski poziom sygnału do szumu), prawdopodobnie z powodu braku wzmocnienia sygnału z przeciwciał drugorzędowych. Jednym z możliwych podejść do obejścia tego problemu byłoby wyhodowanie linii transgenicznych w Xenopus, jak omówiono poniżej.

Jednym z głównych ograniczeń tego protokołu jest to, że chociaż protokół ten może wystarczająco rozróżnić dwie główne pule komórek neuronalnych, a mianowicie pulę neuronalnych komórek macierzystych eksprymujących Sox3 i zróżnicowane neurony eksprymujące Myt1, brakuje mu zdolności do ujawnienia różnych subpopulacji zróżnicowanych neuronów. Takie subpopulacje, które obejmują między innymi pierwotne neurony ruchowe, interneurony i neurony czuciowe, zwykle charakteryzują się genami markerowymi o zróżnicowanej ekspresji 28-30. Jak wspomniano powyżej, ostatnie postępy w rozwoju wielokolorowej hybrydyzacji in situ w połączeniu z metodą wykrywania immunofluorescencji opartą na przeciwciałach w zarodkach Xenopus mogą wypełnić lukę w ujawnieniu tych subpopulacji zróżnicowanych neuronów do potencjalnych badań 31. Alternatywnie, jak wykazano na modelu mysim, pożądane byłoby również wyhodowanie bardziej wszechstronnego zestawu przeciwciał specyficznych dla typu komórki w celu rozróżnienia takich różnych populacji komórek w Xenopus.

Warto również wspomnieć, że jako dodatek do tej metody, najnowsze postępy w obrazowaniu optycznym i analizie obrazu, takie jak mikroskopia wielofotonowa, rekonstrukcja 3D i segmentacja, mogą być również stosowane po wstępnych ocenach w celu uzyskania bardziej kompleksowych obserwacji oocytów Xenopus , a także wczesnych zarodków, szczególnie w warunkach żywych 32,33. Dlatego, aby śledzić proliferację, różnicowanie i ruch komórek neuronalnych u żywych zwierząt, pożądane byłoby ustanowienie jednej lub więcej linii transgenicznych, które zawierają białka fluorescencyjne napędzane przez promotor specyficzny dla typu komórki, aby umożliwić obserwację na żywo takich populacji komórek we wczesnych zarodkach Xenopus . Ustanowienie linii X. laevis z neurospecyficznym promotorem β-tubuliny napędzającym tauGFP i jego zastosowaniami dostarczyło dobrego przykładu 23,34. Z pełnymi sekwencjami promotorowymi zarówno sox3 , jak i myt1 scharakteryzowanymi u kręgowców 35-37, powinno być stosunkowo łatwo ustalić dodatkowe linie transgeniczne w Xenopus , które powinny w znacznym stopniu przyczynić się zarówno do społeczności Xenopus , jak i bardziej ogólnej dziedziny pierwotnych badań neurogenezy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy prof. Michaelowi Klymkowsky'emu z University of Colorado w Boulder i prof. Nancy Papalopulu z University of Manchester za uprzejme dostarczenie przeciwciał anty-Sox3 i anty-Myt1, odpowiednio. Dziękujemy członkom laboratorium Papalopulu za ich wnikliwe sugestie dotyczące opracowywania tego protokołu. Praca ta była wspierana przez dwa stypendia Fundacji Uzdrawiania dla SZ i JL, dwa granty projektowe od Fundacji Uzdrawiania odpowiednio dla SZ/EA i JL/EA, jeden grant programowy od Wellcome Trust dla EA (WT082450MA) oraz jeden grant Institutional Strategic Support od Wellcome Trust [097820/Z/11/Z].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
gentamycyna Sigma-AldrichG1397
Tris-HCl Sigma-AldrichT3253
Tris-baseSigma-AldrichT1503
NaCl Sigma-AldrichS7653
KClSigma-Aldrich746436
MgSO4Sigma-Aldrich746452
CaCl2Sigma-Aldrich793639
HEPESSigma-AldrichH3375
MOPSSigma-AldrichRDD003
EGTASigma-AldrichE3889
37% formaldehydu Sigma-AldrichF8775
Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnychSigma-AldrichG7765
SacharozaSigma-AldrichS7903
Forma bazowa jednorazowa 15 mm x 15 mm x 5 mm SimportVWREMB-200-015A
Forma bazowa jednorazowa 7 mm x 7 mm x 5 mm SimportProwadnice VWREMB-200-010K
Superfrost PlusThermoFisher12-550-15
Medium do zamrażania tkanek (OCT)Leica 
KriostatLeica CM3050
Rękawice
do suchego lodu
Triton X-100 Sigma-AldrichX100
  85-90 &stopni; C Blok
DługopisPAP Sigma-AldrichZ377821
Aceton, klasa
Słoik do barwienia ze stojakami na suwaki
Pudełko na żywność z zatrzaskiem o odpowiedniej wielkości (może pomieścić w środku 1-2 płytki 6-dołkowe)
rurka antyacetylowanaSigma-AldrichT7451
Anty-mysie IgG (H+L), F(ab')2  Fragment (Alexa Fluor®   488 Sprzężony)Sygnalizacja komórkowa4408
Anty-królicza IgG (H + L), F (ab') 2  Fragment (Alexa Fluor®   555 sprzężony)Sygnalizacja komórkowa4413
Alexa Fluor® 647 Sygnalizacja komórkowa falloidyny8940
Sygnalizacja komórkowaDAPI4083
ProLong Gold AntifadeMountant Life TechnologiesP36930
14020108926grzewczyanalityczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
  2. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
  3. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
  4. Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
  5. Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
  6. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
  7. Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
  8. Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
  9. Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
  10. Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
  11. Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
  12. Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
  13. Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
  14. Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
  15. Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
  16. Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
  17. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  18. Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
  19. Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
  20. Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
  21. Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
  22. Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
  23. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469(2013).
  25. Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
  26. Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
  27. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107(2007).
  28. Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
  29. Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
  30. Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
  31. Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
  32. Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
  33. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  34. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
  35. Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
  36. Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
  37. Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kriosekcjonowanieneuralne kom rki macierzystezr nicowane neuronyprzeciwcia o anty Sox 3przeciwcia o anty acetylowana tubulinaprzeciwcia o anty MyT1barwienie DAPI

Powiązane artykuły