Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53964

⸱

2 marca 2016

 ,  , 
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Demonstrujemy procedurę dotchawniczego inokulacji Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Jest to bardzo przydatne narzędzie do badania szlaków sygnałowych regulujących stan zapalny dróg oddechowych w modelach mysich.

Streszczenie

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę skutecznego i bezpośredniego dostarczania Haemophilus influenzae do dolnych dróg oddechowych myszy. Przedstawiono procedurę przygotowania inokulum H. influenzae, dotchawniczego wkraplania H. influenzae do płuc, pobierania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), analizy komórek odpornościowych w BALF oraz izolacji RNA do analizy różnicowej ekspresji genów. Ta procedura może być stosowana do badania odpowiedzi zapalnej płuc na wszelkie bakterie, wirusy lub grzyby. Bezpośrednie wkraplanie tchawicy jest najczęściej preferowane w stosunku do procedur inhalacji donosowej lub aerozolowej, ponieważ skuteczniej dostarcza inokulum bakteryjne do dolnych dróg oddechowych z mniejszą niejednoznacznością.

Wprowadzenie

Stan zapalny jest podstawowym mechanizmem immunologicznym obrony przed czynnikami zakaźnymi. Wspomaga eliminację patogenów i naprawę uszkodzonej tkanki. Ułatwia również powrót do normalnego, zdrowego stanu1. Jednak rozregulowany stan zapalny często prowadzi do przewlekłych chorób zapalnych2. Zapalenie dróg oddechowych jest początkowym czynnikiem wyzwalającym różne choroby płuc, takie jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), astma i zwłóknienie płuc3.

Nietypowany (nieobudowany) Haemophilus influenzae (NTHi) jest związany z przewlekłymi chorobami zapalnymi górnych i dolnych płuc4,5. Jest to gatunek dominujący izolowany z dolnych dróg oddechowych u dzieci i dorosłych z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc4,6,7. Odpowiedź zapalna po zakażeniu NTHi charakteryzuje się zwiększeniem liczby cytokin prozapalnych (takich jak TNF i IL-1β) i jest wywoływana przez kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK) i czynnik jądrowy κB (NF-κB) poprzez receptory toll-podobne (TLR)8.

Modele mysie są bardzo użytecznymi narzędziami do analizy podstawowej patologii choroby zapalnej płuc ze względu na dostępność różnych linii z niedoborem genów. Do inokulacji żywych/atenuowanych bakterii i produktów bakteryjnych zastosowano kilka metod, w tym wkraplanie donosowe i inhalację w aerozolu9,10. Tutaj pokazujemy wkraplanie dotchawicze. Chociaż jest ono stosowane rzadziej, jest bardziej skuteczne i wysoce powtarzalne ze względu na bezpośrednie dostarczanie inokulum do dolnych dróg oddechowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Badawczego Baylor.

1. Hodowla nietypizowanych Haemophilus influenzae (NTHi) i przygotowanie inokulum

  1. Umieść NTHi na płycie z agarem czekoladowym i trzymaj płytkę do góry nogami w nawilżanym inkubatorze CO2 przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnego dnia posadź bakterie w bulionie z naparu do serca mózgu. Następnie dodaj 1 ml bulionu do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Wirować przy 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnego 1x PBS. Powtórz ten krok raz.
  3. Przenieść 100 μl ponownie zawieszonego roztworu do 900 μl 1x PBS i zmierzyć absorbancję rozcieńczonej kultury przy długości fali 600 nm w spektrofotometrze.
  4. Określić żywotność i jednostki tworzące kolonie (CFU) inokulum poprzez hodowlę seryjnych rozcieńczeń w stosunku 1:10 na płytkach agaru czekoladowego i inkubację przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Opierając się na żywotności i jtk określonych w poprzednim kroku, dostosować inokulum do końcowego stężenia 20 x 106 jtk/ml.

2. Wkraplanie dotchawicze (i.t)

  1. Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo (i.p) 0,1 ml/10 g masy ciała myszy roztworem 150 mg/ml ketaminy + 20 mg/ml ksylazyny. Zabieg należy wykonać w kapturze ze źródłem światła, aby utrzymać zwierzę w cieple.
  2. Ściśnij przestrzeń międzypalcową myszy, aby sprawdzić, czy mysz jest odpowiednio znieczulona.
  3. Umieść mysz na plecach. Ogol brzuszną część szyi i zdezynfekuj chlorheksydyną i 70% alkoholem etylowym.
  4. Podnieś skórę górnej brzusznej części szyi za pomocą kleszczy do zębów szczurów. Wykonaj małe nacięcie (0,5-1,0 cm) nad grasicą za pomocą skalpela i ostrożnie wypreparuj mięsień, aby odsłonić tchawicę.
    1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 27 g powoli wstrzyknąć 0,05 ml powietrza, następnie 0,05 ml NTHi uzyskanego z sekcji 1 lub soli fizjologicznej jako kontroli, a następnie kolejne 0,05 ml powietrza. Trzymaj zwierzę w pozycji pionowej przez około 1 minutę.
  5. Zamknij nacięcie klejem chirurgicznym. Trzymaj mysz w pozycji bocznej leżącej i ciepłej przez około 10 minut.

3. Kolekcja BALF

  1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy 24 godziny po zakażeniu.
  2. Otwórz jamę brzuszną myszy anatomicznymi nożyczkami i przetnij aortę brzuszną, aby krwawić. Odsłoń brzuszną część płuca.
  3. Odsłoń tchawicę i zaintubuj ją cewnikiem o rozmiarze 20. Wkroplić 0,8 ml buforu BALF (1x PBS, 0,1% dekstrozy, 10 U/ml heparyny) i zebrać płukanie przez delikatne zasysanie. Powtórz tę procedurę trzy razy.
  4. Policz całkowitą liczbę komórek w 100 μl zawiesiny BALF za pomocą hemocytometru pod 10-krotnym powiększeniem z barwieniem błękitem trypanowym.
  5. Przygotuj szkiełka do zmodyfikowanego barwienia Giemsa. Porcjować 100 μl BALF do odpowiednich studzienek cytospiny i odwirować przy 500 x g przez 5 min. Suszyć szkiełka przez 10 minut i barwić komórki modyfikowaną barwierą Giemsa zgodnie z protokołami producenta.
  6. Użyj pozostałych komórek do późniejszej analizy, takiej jak sortowanie komórek aktywowane florescencją (FACS), mikroskopia konfokalna, ekspresja genów i western blot11-13.

4. Przygotowanie do badania histopatologicznego

  1. W celu analizy histopatologicznej należy zainfekować myszy NTHi zgodnie z opisem w kroku 2.4. Po 24 godzinach od zakażenia należy złożyć zwierzęta w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Rozetnij klatkę piersiową anatomicznymi nożyczkami, aby odsłonić płuca i tchawicę, jak wspomniano wcześniej. Następnie włóż cewnik o rozmiarze 20 do tchawicy.
  2. Napełnij płuca 2% ciepłym roztworem agarozy przygotowanym w 4% formalinie. Gdy płuca są całkowicie napompowane, umieść lód na płucach, aby zestalić roztwór agarozy.
  3. Następnie ostrożnie wyjmij zatyczkę piersiową i umieść ją w 50 ml roztworu 4% formaliny w 1x PBS, aż zostanie przetworzona na sekcje hematoksyliny i eozyny (H&E).

5. Komórki barwiące FACS w BALF

  1. Umieść 1 x 105 komórek z płynu BALF w 96-dołkowej płytce z mikromiareczkowaniem w kształcie litery V.
  2. Umyj komórki 300 μl zimnego 1x PBS i wiruj w temperaturze 4.000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Wybarwić komórki roztworem do barwienia komórek w 100 μl 1x PBS (rozcieńczenie 1:1,000) i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Umyć komórki 300 μl zimnej wody 1x PBS o stężeniu 4.000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Przechowywać komórki w 100 μl buforu płuczącego FACS [Bufor do przemywania (1x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% azydku sodu] zawierającego 1:100 rozcieńczony blok Fc przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odwirować komórki przy 4 000 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
  7. Zabarwić komórki za pomocą 100 μl koktajlu barwiącego powierzchnię (rozcieńczenie 1:100) w buforze płuczącym FACS przez 30 minut w temperaturze 4°C.
  8. Przemyć komórki trzykrotnie 300 μl buforu płuczącego FACS o stężeniu 4 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  9. Utrwal komórki w 100 μl 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyć komórki dwukrotnie 300 μl 1x PBS przy 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl buforu płuczącego FACS.
  11. Wykonaj jednokolorowe kontrole barwienia za pomocą kulek cytometrii przepływowej.
    1. Dodaj jedną kroplę kulek do 96-dołkowej płytki mikrolitrowej z dnem w kształcie litery V i przemyj 200 μl 1x PBS.
    2. Dodać 1 μl przeciwciała barwiącego do 100 μl 1x PBS i kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Umyj koraliki dwukrotnie za pomocą 300 μl 1x PBS.
  12. Analizuj pojedynczo barwione kontrole i komórki za pomocą cytometrii przepływowej14.

6. Homogenizacja tkanki płucnej w celu wyizolowania RNA

  1. Po zakażeniu należy pobrać mały fragment płuca (20-40 mg) i przechowywać go przez noc w odczynniku stabilizującym RNA w temperaturze 4 °C. Następnie przechowuj go w temperaturze -80 °C do następnego kroku.
  2. Umyj tkanki płuc w zimnym 1x PBS, aby pozbyć się odczynnika stabilizującego RNA.
  3. Umieścić tkankę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor do lizy (1 ml buforu do lizy + 10 μl β-merkaptoetanolu).
  4. Pokrój tkankę na małe kawałki za pomocą spiczastych nożyczek i homogenizuj za pomocą tłuczka do granulek z silnikiem akumulatorowym przez 20-40 sekund.
  5. Trzymaj lizat na lodzie przez 5 minut i przejdź do kroku 7.1.

7. Izolacja RNA z płuc

  1. Odwirować lizat przy stężeniu 18 000 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipetowania i ostrożnie przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 1 objętość 70% etanolu do lizatu. Natychmiast wymieszać pipetując i odczekać 2-4 minuty.
  3. Przenieść do 700 μl lizatu do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  4. Odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund i odrzucić przepływ.
  5. Dodać 350 μl rygorystycznego buforu do przemywania i odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund. Wyrzucić przepływ.
  6. Dodać 80 μl DNazy I bezpośrednio do membrany kolumny wirującej i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  7. Dodać 350 μl rygorystycznego buforu do płukania do kolumny wirowej i odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund. Odrzucić przepływ.
  8. Dodać 500 μl buforu płuczącego RNA i odwirować przy 9 600 x g przez 15 sekund. Odrzucić przepływ.
  9. Dodać 500 μl buforu płuczącego RNA i wirować w temperaturze 9 600 x g przez 2 min. Wyrzucić przepływ.
  10. Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odwirować przy 9 600 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.
  11. Dodać 30-50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny wirowej i wirować przy 9 600 x g przez 1 min. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
  12. Wykonaj analizę RNAseq14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Instylacja wewnątrzkrtaniowa doprowadziła do znacznego zwiększenia liczby leukocytów w płyku z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) (Rycina 1A, lewy panel) niż w przypadku instalacji z solą fizjologiczną. Analiza różnicowego obliczenia leukocytów wyraźnie wykazała zwiększoną infiltrację neutrofili (Rysunek 1, prawy panel). Analiza FACS komórek w płycie BALF dodatkowo potwierdziła zwiększoną liczbę neutrofili (Rycina 1B). Ana...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy unikalną i minimalnie inwazyjną procedurę inokulacji płuc płuc bakteryjnym patogenem płuc. Pokazujemy, że ta procedura może być wykorzystana do badania funkcji różnych genów przy użyciu myszy, które mają niedobór genów zapalnych szlaków sygnałowych. Procedura ta może być również stosowana do badania reakcji zapalnych na wirusowe i grzybicze infekcje płuc. Zalety tej procedury w porównaniu z innymi metodami, takimi jak inhalacja donosowa lub aerozolowa, to: (1) w tej procedurze patogenne inokulum j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy doktorowi Carsonowi Harrodowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy również panu Minghui Zeng oraz doktorom Mahesh Kathania i Prashant Khare za ich wkład. Praca ta była wspierana przez granty American Cancer Society (grant Research Scholar, 122713-RSG-12-260-01-LIB) oraz Sammons Cancer Center (grant Pilot Project) dla K. Venuprasad.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czekoladowy talerz agarowyFisher ScientificCAS50-99-7
Dekstroza bezwodnaThemo ScientificR01300
HeparinHospira, IncRL-3010
Szybkie rozwiązanieDeft SigmaGS500-500ML
Igła strzykawkowa 20/26G BD(REF305115/175)
Strzykawka ImlBDREF 309602
Cewnik 20GABDREF
Nożyczki preparacyjne, proste, długość 10 cmkentscientificINS600393
Kleszcze do irysów, ząbkowane, o długości 10 cmkentscientificINS650915
Pęseta #5 Stal nierdzewna, długość 11 cmKentscientific
10% FormalinaFisher ScientificCAS 67-56-1
Agarozapeqlab35-1020
5ml polistyrenowe probówki okrągłodenneBDREF 352058
1,5 ml Probówki do mikrowirówekLight LabsA-7001-R
Reasy Mini  zestaw Qiagen74104
Silnik do granulek pestile (homoginizator tkankowy)SigmaZ359971-1EA
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania V dółThermo2605
1X PBSGibco10010-023
OneCompeBeads eBioscience01-1111-42
CD45.2-APCeBioscience17-0454-81Rozcieńczenie robocze 1:100
Ly-6G-eFlor 450eBioscience48-5931-82Rozcieńczenie robocze 1:100
BSAHyCloneSH30574.03
Bufor do lizy RBC (10X)Biolegend420301
Żywy/martwy zestaw do naprawy aqua dead cellInvitrogenL-34957
EDTA (0,5M)lifetechnologies15575-020
CD16/ CD32 FcBlockBD553142
Rurki Facs polistyren okrągłodenny rurkaBD352052
FormaldehydPolyscience4018
381433 INS600095

Bibliografia

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376(2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446(2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22(2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

p ukanie oskrzelowo p cherzykoweizolacja RNAcytometria przep ywowamikroskopia konfokalnakomora licznikowaekspresja gen w
Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania zapalenia dróg oddechowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.