Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53968

⸱

15 marca 2016

 ,  , 
1Department of Geobiology, Georg-August University of Göttingen

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom zestawu metod do wysokoprzepustowej dekapsulacji zarodków i larw Lymnaea stagnalis w ramach przygotowań do hybrydyzacji in situ całego wierzchowca oraz do późniejszych zabiegów przed i po hybrydyzacji.

Streszczenie

Hybrydyzacja in situ (WMISH) to technika, która pozwala na przestrzenne rozdzielenie cząsteczek kwasu nukleinowego (często mRNA) w obrębie "całego wierzchowca" przygotowania tkankowego lub etapu rozwoju (takiego jak zarodek lub larwa) będącego przedmiotem zainteresowania. WMISH jest niezwykle silny, ponieważ może znacząco przyczynić się do funkcjonalnej charakterystyki złożonych genomów metazoan, wyzwania, które staje się coraz bardziej wąskim gardłem w zalewie danych sekwencyjnych nowej generacji. Pomimo koncepcyjnej prostoty tej techniki, często potrzeba dużo czasu na optymalizację różnych parametrów nieodłącznie związanych z eksperymentami WMISH dla nowatorskich systemów modelowych; Subtelne różnice we właściwościach komórkowych i biochemicznych między typami tkanek i stadiami rozwojowymi oznaczają, że jedna metoda WMISH może nie być odpowiednia we wszystkich sytuacjach. Opracowaliśmy zestaw metod WMISH dla ponownie pojawiającego się modelu ślimaka Lymnaea stagnalis, które generują spójne i wyraźne sygnały WMISH dla szeregu genów i na wszystkich etapach rozwoju. Metody te obejmują przypisanie larw o nieznanym wieku chronologicznym do okna ontogenetycznego, skuteczne usuwanie zarodków i larw z ich torebek jajowych, zastosowanie odpowiedniego leczenia Proteinazą-K dla każdego okna ontogenetycznego oraz etapy hybrydyzacji, po hybrydyzacji i immunodetekcji. Metody te stanowią podstawę, na której uzyskany sygnał dla danego transkryptu RNA może być dalej udoskonalany za pomocą regulacji specyficznych dla sondy (przede wszystkim stężenia sondy i temperatury hybrydyzacji).

Wprowadzenie

to grupa zwierząt, która cieszy się zainteresowaniem wielu dyscyplin naukowych. Pomimo ich różnorodności morfologicznej1, bogactwa gatunkowego (ustępującego tylko stawonogom pod względem liczbygatunków 2) i znaczenia dla szerokiego zakresu zagadnień komercyjnych3, medycznych4 i naukowych5-8, istnieje stosunkowo niewiele gatunków, które mogą twierdzić, że są zarówno dobrze wyposażonymi modelami naukowymi, jak i łatwymi do utrzymania w środowisku laboratoryjnym. Jednym z, który jest często używany przez dyscypliny takie jak neurobiologia9, ekotoksykologia10, a ostatnio biologia ewolucyjna11,12, jest Lymnaea stagnalis, głównie ze względu na jego szerokie rozpowszechnienie i wyjątkową łatwość utrzymania. Pomimo jego popularności jako organizmu "modelowego" i długiej historii stosowania przez biologów rozwojowych13-19, zakres i moc narzędzi molekularnych dostępnych dla społeczności naukowej L. stagnalis pozostaje daleko w tyle za bardziej tradycyjnymi modelami zwierzęcymi (Drosophila, mysz, jeżowce, nicienie).

Nasze pragnienie rozwoju Lymnaea jako modelu molekularnego wynika z zainteresowania mechanizmami molekularnymi, które kierują tworzeniem się otoczek. To zmotywowało nas do udoskonalenia zestawu technik, które pozwoliłyby na wydajną, spójną i czułą wizualizację ekspresji genów podczas rozwoju Lymnaea. Hybrydyzacja in situ (WMISH) jest szeroko stosowana w przypadku różnych organizmów modelowych i jest stosowana od ponad 40 lat20. W różnych postaciach ISH może być stosowany do przestrzennej lokalizacji określonych loci na chromosomach, rRNA, mRNA i mikro-RNA.

Jednym z wyzwań, które musieliśmy rozwiązać przed udoskonaleniem metody WMISH dla L. stagnalis, była kwestia delikatnego i skutecznego pobierania zarodków i larw w różnym stadium z kapsułek jajowych, w których są zdeponowane. Ekstrakcja ta, czyli "dekapsulacja", musi być przeprowadzona w sposób skuteczny w celu zebrania odpowiedniego materiału do danego doświadczenia in situ, przy jednoczesnym zachowaniu integralności morfologicznej i komórkowej. Podczas gdy inne organizmy modelowe również przechodzą rozwój w kapsułkach, w naszych rękach żadna z metod opisanych dla tych gatunków nie mogła być z powodzeniem zastosowana u L. stagnalis.

Ogólne cele tej metody to: ekstrakcja zarodków i larw L. stagnalis z ich kapsułek w sposób wysokoprzepustowy, zastosowanie zabiegów pre-hybrydyzacyjnych, które optymalizują sygnał WMISH, przygotowanie zarodków i larw z zadowalającymi sygnałami WMISH do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Poniższe kroki opisują naszą metodę przeprowadzania eksperymentu in situ na stadiach embrionalnych i larwalnych L. stagnalis. W przypadku gdy dany etap wiąże się z użyciem niebezpiecznej substancji chemicznej, jest to oznaczone słowem "UWAGA" i należy przyjąć wszystkie odpowiednie procedury bezpieczeństwa. Linki do reprezentatywnych kart charakterystyki substancji chemicznych stwarzających zagrożenie znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Receptury dla wszystkich odczynników znajdują się w pliku uzupełniającym 2.

1. Montaż aparatury do dekapsulacji

  1. W tym celu należy podłączyć jednorazową strzykawkę o pojemności 20 ml do silikonowej rurki (o średnicy wewnętrznej 1 mm i średnicy zewnętrznej 3 mm) za pomocą końcówki P1 000 przyciętej na odpowiednią długość, jak pokazano na rysunku 2A.
  2. Przyklej standardowy szkiełko mikroskopowe do odwróconej dużej szalki Petriego. Przyklej taśmą silikonową rurkę bezpośrednio przylegającą do szkiełka mikroskopowego, jak pokazano na rysunku 2C i 2D.
  3. Oprzyj wyciągniętą szklaną igłę na szkiełku mikroskopu i delikatnie włóż ją do silikonowej rurki, aż końcówka igły wystaje około 20% w poprzek wewnętrznej średnicy rurki (patrz Rysunek 2C i 2D). Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, przyklej ją do szalki Petriego.
  4. Pozwól, aby wolny koniec rurki silikonowej spoczywał na innej szalce Petriego, która będzie zbierać zdekapsulowany materiał.

2. Pobieranie próbek, utrwalanie i dekapsulacja

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w RT, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Ostrożnie zbieraj sznurki jaj ze ścian akwarium. Aby to zrobić, użyj płaskiego kawałka elastycznego plastiku jako szpatułki, aby zeskrobać sznurek do jajek z podłoża i użyj plastikowego sitka do herbaty, aby wyłowić pływający sznurek do jajek z wody. Przygotować i posortować materiał pod mikroskopem, korzystając z przewodnika dostarczonego na rysunku 1.
  2. Umieść sznurek do jajek na ręczniku papierowym i wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż masy jajowej za pomocą szczypiec do pióra. Rozwałkuj kapsułki jajowe ze sznurka do jajek i usuń jak najwięcej galaretki z każdej kapsułki, popychając je wokół ręcznika papierowego za pomocą szczypiec do piórka.
  3. Za pomocą szczypiec do piórek przenieś kapsułki jajowe na szalkę Petriego zawierającą 5 ml wody z kranu. Kontynuuj zbieranie do tego naczynia pozbawionych galaretki jaj o pożądanych stadiach rozwojowych. Zbierz wystarczającą ilość kapsułek ze wszystkich etapów rozwoju do planowanego eksperymentu WMISH, a następnie przejdź do następnego kroku.
  4. Podczas pracy z bardziej rozwiniętymi larwami (5 dni po pierwszym rozszczepieniu (dpfc) i starsze) należy je znieczulić przed utrwaleniem.
    UWAGA: Zapobiegnie to kurczeniu się mięśni, co bardzo utrudnia interpretację wzorów barwienia in situ.
    1. Rozluźnić larwy (gdy są jeszcze w kapsułkach) w 2% w/v roztworze MgCl2•6H2O przez 30 minut przed utrwaleniem.
    2. Ocenić stopień relaksacji po 30 minutach, zanurzając kilka larw jeszcze w kapsułkach jajowych w roztworze utrwalającym i monitorując ich reakcję pod mikroskopem. Nie w pełni zrelaksowane larwy chowają się w swoich skorupach, podczas gdy w pełni zrelaksowane larwy nie reagują. Gdy te larwy zostaną zrelaksowane, przejdź do następnego kroku.
  5. Przenieść kapsułki jajowe za pomocą plastikowej pipety o szerokim otworze do zamykanej probówki, która zapewnia 10-krotność objętości kapsułek jajowych (np. 1 ml osadzonych kapsułek wymagałoby probówki o pojemności 10+ ml).
  6. Odessać jak najwięcej płynu z probówki i zastąpić objętością roztworu utrwalającego, która jest 10 razy większa niż objętość osadzonych kapsułek jajowych. Delikatnie obracać kapsułki jajowe w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez odpowiedni czas dla każdego etapu rozwoju (patrz ryc. 1).
  7. Przerwać obracanie i pozostawić kapsułki do zatonięcia, a następnie zassać roztwór utrwalający do odpowiedniego pojemnika na odpady.
  8. Umyć kapsułki jajowe, zastępując roztwór utrwalający roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 0,1% Tween-20 (PBTw) i obracając w temperaturze RT przez 5 minut. Odessać PBTw i powtórzyć dwukrotnie.
  9. Usunąć zarodki i larwy z ich kapsułek za pomocą przyrządu (szczegółowe informacje patrz sekcja 1) pokazanego na rysunku 2. Pobrać kapsułki do strzykawki o pojemności 20 ml, założyć rurkę, a następnie wyprowadzić kapsułki przez rurkę i przez szklaną igłę do naczynia zbiorczego.
    UWAGA: Zwykle większość (>90%) wszystkich kapsułek powinna wymagać tylko jednego przejścia przez urządzenie. W wielu przypadkach błona torebki jest uszkodzona, ale zarodki i larwy pozostają wewnątrz pękniętej torebki. Ponownie przetworzyć ten materiał, po prostu wciągając go do strzykawki i ponownie usuwając.
  10. Zebrać zdekapsulowane zarodki i larwy do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety (P20 dla larw w wieku 0-3 dni i P200 dla starszych larw z odciętym końcem końcówki).
    UWAGA: Na tym etapie można zrobić przerwę (do kilku miesięcy) w protokole. Jeśli jest to wymagane, zdekapsuowany materiał należy zebrać do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania (przejdź do następnego kroku). W przeciwnym razie należy niezwłocznie przejść do Protokołu 3.
  11. Pozwolić, aby zarodki i larwy opadły na dno probówki i zassać supernatant. Zastąp 33% etanolem (EtOH) w PBTw i odstaw na 5 - 10 minut. Powtórz z 66% EtOH w PBTw i 100% EtOH. Przemyć larwy dwukrotnie w 100% EtOH w temperaturze pokojowej schodu. Przechowywać materiał w temperaturze -20 °C w 100% EtOH.
  12. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, ponownie uwodnić próbki, usuwając 100% EtOH i zastępując go 66% EtOH w PBTw, odstaw na 5 - 10 minut. Powtórz z 33% EtOH w PBTw, pozostaw na 5 - 10 minut. Na koniec umyj 3 razy 5-minutowe płukanie PBTw, aby upewnić się, że cały EtOH został usunięty.

3. Proteinaza-K, herbata i post-fiksacja

UWAGA: Uważamy, że wykonywanie następujących kroków w małych koszach z siatkową podłogą jest najbardziej efektywną i delikatną metodą szybkiej wymiany rozwiązań krytycznych czasowo. Chociaż mogą one być wykonane w domu, używamy koszy (średniej wielkości), które są kompatybilne z robotem do obsługi cieczy Intavis InSituPro-Vsi (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Takie kosze można szybko i łatwo przenosić między studzienkami 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych (TCD) w celu wymiany roztworów lub roztwór można zassać ze studzienki za pomocą pipety. Alternatywnie, wszystkie wymiany roztworów mogą być przeprowadzane bez tych koszyczków, po prostu odsysając supernatant z larw. W takim przypadku delikatny ruch wirowy skoncentruje wszystkie zarodki i larwy na środku naczynia, umożliwiając usunięcie supernatantu z krawędzi studzienki. Poniżej założono, że użytkownik korzysta z koszyków do wymiany rozwiązań.

  1. Za pomocą pipety przenieść zarodki i larwy do kosza umieszczonego w 12-dołkowym TCD z 2 ml PBTw.
    UWAGA: Liczba zarodków i/lub larw, które można dodać, zależy od badanego etapu rozwoju, jednak ogólną zasadą jest, aby co najmniej 25% powierzchni podłogi było wolne od zarodków/larw (tj. nie należy przepełniać kosza).
  2. Przygotować sąsiedni studzienka z 2 ml odpowiedniego roztworu proteinazy-K (patrz rysunek 1) i kolejne 2 studzienki z 2 ml 0,2% glicyny każda. Przenieś każdy kosz do studzienki zawierającej odpowiednie stężenie Proteinazy-K i natychmiast rozpocznij odmierzanie czasu.
  3. Po 10 minutach przenieś każdy kosz do studzienki zawierającej 0,2% glicyny i inkubuj przez 5 minut. Następnie przenieś każdy kosz do drugiego dołka z 0,2% glicyną i inkubuj przez 5 minut. Wypłucz glicynę za pomocą 3 razy 5 minut wymiany 3 ml PBTw.
  4. Usunąć roztwór PBTw i potraktować próbki świeżo przygotowanym roztworem trietanoloaminy (TEA) przez 5 minut UWAGA! Nie agitować. Zastąp 3 ml świeżo przygotowanego roztworu herbaty na 5 minut. Nie agitować. Odessać większość roztworu herbaty z próbek. Dodać świeżo przygotowaną trietanoloaminę z roztworem bezwodnika octowego (TEAAA) i inkubować przez 5 minut. UWAGA! Nie agitować.
  5. OPCJONALNIE - Podczas gdy powyższy krok jest inkubacją, przygotuj kolejną świeżą partię roztworu TEAAA i powtórz powyższy krok.
    UWAGA: To drugie leczenie TEAAA jest opcjonalne, ale może pomóc w całkowitym wyeliminowaniu całego tła z sondami podatnymi na generowanie tła.
  6. Usunąć roztwór TEAAA, odsysając go ze studzienki i zastąpić 3 ml PBTw. Nie agitować. Usuń PBTw i nałóż 3 ml 3,7% formaldehydu w PBTw. Delikatnie obracaj od czasu do czasu podczas 30-minutowej inkubacji.
  7. Usunąć utrwalacz poprzez zassanie go ze studzienki i zastąpić go 3 ml PBTw. Przenieść materiał do probówki o pojemności 1,5 ml. Zastąp PBTw buforem hybrydyzacyjnym i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej - UWAGA.
  8. Umieść probówki w gorącym bloku w temperaturze pokojowej i ustaw temperaturę na żądaną temperaturę hybrydyzacji.
    UWAGA: Temperatura hybrydyzacji jest specyficzna dla sondy i będzie musiała zostać empirycznie zoptymalizowana, jednak uważamy, że 55 °C jest dobrą temperaturą do wstępnego przetestowania. Pozwól, aby blok osiągnął temperaturę hybrydyzacji i pozwól próbkom na wstępną hybrydyzację przez około 15 minut (tj. czas potrzebny na przygotowanie rybosond, dłużej nie jest konieczne). Przygotować odpowiednie objętości (zwykle 100 μl) rozcieńczonych rybosond. Zazwyczaj testujemy stężenia sondy 100 i 500 ng/ml jako początkowy zakres. Przygotowujemy rybosondy zgodnie z 12.
  9. Usunąć bufor hybrydyzacyjny z próbek i dodać sondę w buforze hybrydyzacyjnym do próbek. Nałożyć 100 μl (lub odpowiednią objętość, aby utworzyć fazę powyżej buforu hybrydyzacyjnego) oleju mineralnego.
    UWAGA: Olej mineralny zapobiega nadmiernej kondensacji, która powstanie podczas długiego etapu hybrydyzacji. Rozległa kondensacja znacząco zmieni zarówno skład chemiczny roztworu hybrydyzacyjnego, jak i stężenie sondy.
  10. Denaturacja sondy i docelowego RNA poprzez podgrzewanie próbek do temperatury 75 °C przez 10 minut, a następnie zmniejszenie ciepła do pożądanej temperatury hybrydyzacji. Pozwól, aby hybrydyzacja postępowała przez co najmniej 12 godzin (O/N) lub dłużej (24 - 48 godzin).
  11. Podczas hybrydyzacji wyjmij pojedynczą rurkę z bloku grzewczego, szybko obróć ją między kciukiem a palcem wskazującym, aby zawiesić larwy bez naruszania fazy olejowej, i umieść ją w bloku grzewczym. Powtarzaj to raz na około 6-12 godzin.

4. Gorące pranie i immunodetekcja

UWAGA: Chociaż używamy robota do obsługi płynów do następujących kroków, można je również łatwo wykonać ręcznie. W takim przypadku zarodki i larwy powinny być trzymane w probówkach o pojemności 1,5 ml, w których zostały zhybrydyzowane. Wszystkie kolejne wymiany roztworów są zasysane i dodawane za pomocą pipety P1 000. W przypadku wykonywania ręcznego każdy z poniższych kroków powinien zawierać 1 ml każdego roztworu.

  1. Podgrzać odpowiednie objętości (po 3 ml na każdą próbkę) roztworów 4x, 2x i 1x do temperatury hybrydyzacji.
  2. Przemyć wszystkie próbki trzykrotnie w 4-krotnym buforze do przemywania przez 15 minut każda w temperaturze hybrydyzacji. Przemyć wszystkie próbki trzykrotnie w 2x buforze do przemywania przez 15 minut każda w temperaturze hybrydyzacji. Przemyć wszystkie próbki trzy razy w 1x buforze do przemywania przez 15 minut każda w temperaturze hybrydyzacji.
  3. Przemyć wszystkie próbki raz 1x buforem chlorku sodu i cytrynianu sodu + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) w temperaturze hybrydyzacji. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
  4. Umyj wszystkie próbki dwukrotnie w 1x SSC + 0,1% Tween przez 15 minut Zastąp ten 1x roztwór SSC buforem kwasu maleinowego (MAB) i pozostaw na 10 minut Powtórz mycie MAB. Zastąp MAB roztworem blokowym i inkubuj przez 1,5 godziny.
  5. Zamianę roztworu blokowego na roztwór przeciwciała (rozcieńczenie przeciwciała w roztworze blokowym w stosunku 1:10 000) i inkubować przez 12 godzin (O/N) w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

5. Rozwój i montaż kolorów

  1. Odessać roztwór przeciwciała i przemyć 15 razy PBTw przez 10 minut każdy. Zastąp PBTw 1x alkalicznym buforem fosfatazy (AP) i inkubuj przez 10 minut.
  2. Podczas gdy powyższy etap inkubacji postępuje, przygotuj roztwór barwiący AP (patrz Plik Uzupełniający 2) - UWAGA. Przenieś materiał do studzienki TCD i zastąp 1x roztwór AP roztworem barwiącym AP. Zanotuj teraz czas, aby można było zarejestrować czas, w którym zachodzi reakcja barwna. Monitoruj rozwój wzoru barwienia, aż stosunek sygnału do tła będzie optymalny.
  3. Aby zatrzymać rozwój koloru, usuń 1x roztwór barwiący AP (wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady) i nałóż 2 ml PBTw i zanotuj teraz czas. Płukać jeszcze dwa razy PBTw przez 5 minut każdy. Użyj jednego z tych płukanek, aby przenieść materiał do probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Usunąć PBTw i nałożyć 1 ml 3,7% formaldehydu w PBTw i mieszać lub obracać przez co najmniej 30 minut w temperaturze suchej (można to również zrobić O/N).
  5. Wypłukać utrwalacz 3 praniami PBT (odpadowy utrwalacz wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady). Umyć próbki 3 razy w temperaturze 50 °C w wodzie dejonizowanej.
    UWAGA: Te płukania eliminują wytrącanie się soli, które mogą stać się widoczne podczas etapów oczyszczania i wizualizacji.
  6. Zdecyduj, czy próbki powinny być zamontowane w benzoesanie benzylu: alkohol benzylowy (BB:BA, znany również jako klarowny Murraya) czy w glicerolu.
    UWAGA: Preferujemy silniejszy środek usuwający BB:BA, ponieważ zarodki L. stagnalis są nieco nieprzezroczyste. Próbki, które mają być zamontowane w BB:BA, będą musiały najpierw zostać odwodnione za pomocą serii etanolu. Próbki, które mają być zamontowane w 60% glicerolu, można je natychmiast zamontować.
  7. Przenieść próbki do roztworu montażowego (BB:BA lub 60% glicerolu) za pomocą pipety.
    UWAGA: W przypadku montażu w BB:BA należy to zrobić w szklanej studzience (BB:BA stopi plastik poliwęglanowy).
  8. Pozostawić próbki do opróżnienia przez 5 - 10 minut, a następnie zamontować je na szkiełku podstawowym za pomocą odpowiedniej liczby szkiełek nakrywkowych ułożonych w stos jako przekładki (1 szkiełko nakrywkowe dla próbek <1 dpfc, 2 szkiełka nakrywkowe dla próbek >1 dpfc).
    UWAGA: Całe mocowania mogą być teraz obrazowane za pomocą mikroskopu złożonego z optyką DIC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wzory barwienia WMISH przedstawione na Rysunku 3 zostały uzyskane przy użyciu opisanej powyżej techniki i odzwierciedlają różnorodne przestrzenne wzory ekspresji genów zaangażowanych w szereg procesów molekularnych – od tworzenia muszli (Novel gene 1, 2, 3 oraz 4), przez sygnalizację międzykomórkową (Dpp), aż po regulację transkrypcji (Brachyury) na różnych etapach rozwoju. Chociaż nie określiliśmy ilościowo poziomów eks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda pozwala na efektywną wizualizację transkryptów RNA o przypuszczalnie różnych poziomach ekspresji we wszystkich stadiach rozwojowych Lymnaea stagnalis. Aby usunąć zarodki i larwy z ich kapsułek, przetestowaliśmy różne metody leczenia chemicznego, wstrząsu osmotycznego i fizykalnego opisane w przypadku innych organizmów modelowych rozwijających się w kapsułkach. Jednak w naszych rękach metoda, którą tutaj opisujemy, jest jedyną techniką o wysokiej przepustowości, która usuwa twardą błonę toreb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez fundusze dla DJJ poprzez projekt DFG #JA2108/2-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze do wagi piórkowejEhlert & Partner#4181119
Rurki silikonoweGlasgerä tebau OCHS GmbH760070
Szklane naczynia włosowateHilgenberg1403547
12-dołkowe naczynia do hodowli tkankowychCarl RothCE55.1
37% FormaldehydCarl RothP733.1UWAGA - Może powodować raka. Działa toksycznie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Toksyczny: niebezpieczeństwo wystąpienia bardzo poważnych, nieodwracalnych skutków poprzez wdychanie, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.
Kwas etylenodiaminotetraoctowyCarl RothCN06.3UWAGA - DZIAŁA DRAŻNIĄCO NA OCZY. MOŻE POWODOWAĆ PODRAŻNIENIE DRÓG ODDECHOWYCH I SKÓRY. Unikaj wdychania pyłu. Unikać kontaktu z oczami, skórą i odzieżą. Stosować tylko przy odpowiedniej wentylacji
Chlorek magnezuCarl Roth2189.1
Tween-20Carl Roth9127.1UWAGA - Może być szkodliwy w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Może działać szkodliwie w przypadku połknięcia.
Chlorek soduCarl Roth3957.1
Ficoll typ 400Carl RothCN90.1
poliwinylopirolidon K30 (MW 40)Carl Roth4607.1UWAGA - Może być szkodliwy w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Może działać szkodliwie w przypadku połknięcia.
Bez nukleaz Surowica bydlęca AlbuminaCarl Roth8895.1
Nasienie łososiaCarl Roth5434.2
HeparynaCarl Roth7692.1UWAGA - DZIAŁANIA NIEPOŻĄDANE OBEJMUJĄ KRWOTOK, MIEJSCOWE PODRAŻNIENIE. MOŻLIWA REAKCJA ALERGICZNA W PRZYPADKU WDYCHANIA, SPOŻYCIA/KONTAKTU. DRAŻNIĄCE OCZY/SKÓRĘ/DROGI ODDECHOWE. MOŻLIWE NADWRAŻLIWOŚĆ. W CZASIE CIĄŻY DONOSZONO O ZWIĘKSZENIU RYZYKA URODZENIA MARTWEGO DZIECKA
Proteinaza-KCarl Roth7528.1
GlicynaCarl Roth3790.2
Dejonizowany formamidCarl RothP040.1UWAGA - Działa drażniąco na oczy i skórę. Może działać szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Higroskopijny.
Standardowy formamidCarl Roth6749.3UWAGA - Działa drażniąco na oczy i skórę. Może działać szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Higroskopijny.
TrietanoloaminaCarl Roth6300.1UWAGA - Unikać wdychania pary lub mgły. Unikać kontaktu z oczami. Unikać długotrwałego lub powtarzającego się kontaktu ze skórą. Po użyciu dokładnie umyć.
Bezwodnik octowyCarl Roth4483.1UWAGA - POWODUJE POWAŻNE OPARZENIA SKÓRY I OCZU. GWAŁTOWNIE WCHODZI W REAKCJĘ Z WODĄ. DZIAŁA SZKODLIWIE PO POŁKNIĘCIU. PARA DRAŻNIĄCA OCZY I DROGI ODDECHOWE
Kwas maleinowyCarl RothK304.2UWAGA - Bardzo niebezpieczny w przypadku kontaktu z oczami (drażniący), po spożyciu, . Stwarza zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), wdychania (działanie drażniące na płuca). Lekko niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą (permeator). Działa żrąco na oczy i skórę.
Benzoesan benzyluSigmaB6630-250MLUWAGA - Może być szkodliwy w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Działa szkodliwie po połknięciu.
Alkohol benzylowySigma10,800-6UWAGA - Działa szkodliwie w przypadku połknięcia. Działa szkodliwie w przypadku wdychania. Działa drażniąco na oczy.
GlycerolCarl Roth3783.1
Proszek blokującyRoche11096176001
Fragmenty Anti DIG Fab AP sprzężoneRoche11093274910
Tris-HCl CarlRoth9090.3
4-nitro niebieski chlorek tetrazolu w dimetyloformamidzie Carl Roth4421.3UWAGA - Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na oczy.
5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanCarl RothA155.3UWAGA - Potencjalnie szkodliwy w przypadku spożycia. Nie dopuścić do kontaktu ze skórą, oczami ani na ubraniem. Potencjalne działanie drażniące na skórę i oczy.
N-acetylocysteinaCarl Roth4126.1
DitiothreitolCarl Roth6908.1UWAGA - Może powodować podrażnienie oczu i skóry. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych. Właściwości toksykologiczne tego materiału nie zostały w pełni zbadane.
TergitolSigmaNP40SUWAGA - Może działać szkodliwie w przypadku wdychania. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może być szkodliwy, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Może powodować podrażnienie skóry. Może powodować podrażnienie oczu. Może działać szkodliwie w przypadku połknięcia.
Dodecylosiarczan soduCarl RothCN30.3UWAGA - Działa szkodliwie po połknięciu. Działa toksycznie w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na skórę. Powoduje poważne uszkodzenie oczu. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.
Chlorek potasuCarl Roth6781.1
Di-sodowy wodorofosforan dwuwodny (Na2HPO4• 2H2O)Carl Roth4984.1
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Carl Roth3904.1
Cytrynian trisodu dwuwodny (C6H5Na3O7• 2H2O)Carl Roth3580.1UWAGA - Może powodować podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych. Właściwości toksykologiczne tego materiału nie zostały w pełni zbadane.
Olej mineralny Carl RothHP50.2
InSituPro-VSI Intaviswww.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc

Bibliografia

  1. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
  2. Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
  3. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
  4. World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
  5. Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
  6. Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
  7. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
  8. Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
  9. Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
  10. Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
  11. Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
  12. Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19(2015).
  13. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
  14. Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
  15. Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
  16. Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
  17. Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
  18. Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
  19. Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29(1973).
  20. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
  21. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
  22. Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
  23. Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
  24. Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
  25. Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160(2007).
  26. Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
  27. Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
  28. Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
  29. Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15(2013).
  30. Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
  31. Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
  32. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43(2011).
  33. Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
  34. Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
  35. Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
  36. Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745(2011).
  37. Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941(2014).
  38. Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
  39. Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie larw embrionalnychusuwanie kapsu ek jajowychtraktowanie proteinaz Kklasyfikacja stadi w rozwojowychhybrydyzacja sond riboprobewizualizacja ekspresji gen wtechniki biologii rozwojumodelowy system mi czak w
Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.