Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Podsumowanie

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Streszczenie

Wykrywanie ekspresji genów w różnych typach komórek mózgu, np. neuronach, astrocytach, oligodendrocytach, prekursorach oligodendrocytów i mikrogleju, może być utrudnione przez brak specyficznych pierwszorzędowych lub drugorzędowych przeciwciał do barwienia immunologicznego. Tutaj opisujemy protokół wykrywania ekspresji trzech różnych genów w tej samej sekcji mózgu za pomocą podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z dwiema sondami specyficznymi dla genu, a następnie barwienia immunologicznego przeciwciałem o wysokiej specyficzności skierowanym przeciwko białku kodowanemu przez trzeci gen. Uważa się, że gen aspartoacyklazy (ASPA), którego mutacje mogą prowadzić do rzadkiej choroby istoty białej u ludzi - choroby Canavan - ulega ekspresji w oligodendrocytach i mikrogleju, ale nie w astrocytach i neuronach. Jednak dokładny wzorzec ekspresji ASPA w mózgu nie został jeszcze ustalony. Protokół ten pozwolił nam ustalić, że ASPA ulega ekspresji w podzbiorze dojrzałych oligodendrocytów i może być ogólnie stosowany w szerokim zakresie badań wzorców ekspresji genów.

Wprowadzenie

Komórki glejowe, które są najliczniejszymi komórkami w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), obejmują oligodendrocyty (komórki mielinizujące OUN), prekursory oligodendrocytów (OP, znane również jako "komórki NG2"), astrocyty i mikroglej. Rośnie zainteresowanie funkcjami komórek glejowych i ich potencjalną rolą w chorobach neurologicznych¹. Na przykład choroba Canavan (CD) jest dziedziczną chorobą neurodegeneracyjną rozpoczynającą się we wczesnym dzieciństwie z gąbczastą leukodystrofią i postępującą utratą neuronów, prowadzącą do śmierci zwykle przed 10 rokiem życia^2,3. Zidentyfikowano mutacje w genie aspartoacyklazy (ASPA), które prowadzą do drastycznego zmniejszenia aktywności ASPA⁴ w CD. ASPA jest enzymem katalizującym deacetylację N-acetyloasparaginianu (NAA), cząsteczki silnie skoncentrowanej w mózgu, wytwarzającej octan i asparaginian ^5-7. Wielu pacjentów z CD wykazuje wyższy poziom NAA z powodu braku aktywności ASPA. Niektóre badania spekulują, że octan pochodzący z NAA może być głównym źródłem kwasów tłuszczowych / lipidów w mózgu podczas rozwoju, a CD może wynikać ze zmniejszonej syntezy mieliny podczas rozwoju spowodowanej niepowodzeniem w rozkładzie NAA^3,5,6.

ASPA znajduje się głównie w nerkach, wątrobie i istocie białej mózgu, a biorąc pod uwagę ważną rolę ASPA w CD, ekspresja komórkowa tego enzymu w mózgu została zbadana przez kilka laboratoriów. Przyglądając się aktywności enzymatycznej ASPA w mózgu, wcześniejsze badania wykazały, że wzrost aktywności ASPA podczas rozwoju mózgu przebiega równolegle z przebiegiem czasowym mielinizacji ^8-10. Na poziomie komórkowym testy aktywności enzymatycznej, a także analizy hybrydyzacji in situ (ISH) i immunohistochemii (IHC) sugerują, że ASPA ulega ekspresji głównie w oligodendrocytach w mózgu, ale nie w neuronach lub astrocytach^11-16. Kilka badań wykazało, że ASPA może być również wyrażana w mikrogleju w OUN^12,14. Dotychczasowe dane dotyczące wyrażania ASPA w PO są ograniczone. Zgodnie z niedawnym badaniem, w którym transkryptomy różnych typów komórek w korze mózgowej myszy, w tym neuronów, astrocytów, OP, nowo powstałych oligodendrocytów, oligodendrocytów mielinizujących, mikrogleju, komórek śródbłonka i perycytów analizowano za pomocą sekwencjonowania RNA¹⁷, ASPA ulega ekspresji wyłącznie w oligodendrocytach, w szczególności w oligodendrocytach mielinujących (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Pomimo tych badań nad ASPA wzorca ekspresji w mózgu, pozostaje szereg niewiadomych.

Różne techniki mogą być używane do badania wzorców ekspresji genów. IHC jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania funkcjonalnego produktu (tj. białka) ekspresji genu w skrawkach tkanki. Pomimo dużej użyteczności, technika ta ma ograniczenia, ponieważ jej zastosowanie i swoistość zależą od dostępności i swoistości potrzebnego przeciwciała. Dla porównania, ISH ma tę zaletę, że jest w stanie ujawnić ekspresję dowolnego genu na poziomie mRNA. Jednak użycie kilku sond w tym samym czasie w celu zlokalizowania ekspresji genu w określonych typach komórek może być technicznie trudne. W artykule opisano protokół łączący hybrydyzację in situ RNA z podwójną fluorescencją z immunoznakowaniem fluorescencyjnym białka. Użyliśmy tego zestawu technik do zbadania wzorca ekspresji Aspa w mózgu myszy. Metoda ta pozwala na precyzyjne badanie ekspresji genów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protokół

Oświadczenie etyczne:
Hodowla myszy i obchodzenie się z nimi są zgodne z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i wytycznymi komisji etycznej UCL, zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. i jej przepisami zmieniającymi z 2012 r.

UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być wykonane z wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), aby zniszczyć wszelkie pozostałości RNazy. W przypadku obróbki DEPC dodaj DEPC (1 ml na litr), energicznie wstrząsaj, aż wszystkie kuleczki DEPC znikną, a następnie autoklaw w celu degradacji DEPC.

1. Synteza sondy RNA

1. UWAGA: Podczas obchodzenia się z formamidem należy nosić środki ochrony osobistej (PPE) i używać szafy bezpieczeństwa. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny: woda dejonizowana uzdatniona DEPC z 50% (v/v) dejonizowanym formamidem, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂HPO₄, 0,01 mg / ml tRNA drożdży, 1× roztworu Denhardta i 10% w/v siarczanu dekstranu.
2. Wybierz klon DNA, który zawiera sekwencję cDNA interesującego genu w plazmidzie z promotorami polimerazy RNA. W tym przykładzie użyj klonu pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (akces GenbankBC024934), z promotorami polimerazy RNA T7 i Sp6 dla Aspa (rysunek uzupełniający 1).
3. Przygotuj zlinearyzowane plazmidowe DNA jako matrycę.
   1. Wyhoduj klon DNA, wyekstrahuj plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na małą skalę zgodnie z protokołem producenta i sekwencjonuj za pomocą uniwersalnych starterów T7 i Sp6.
   2. Trawić 1,020 μg plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, który przecina koniec 5' nici zmysłowej cDNA. W tym przykładzie użyj 100 jednostek SalI do trawienia plazmidu pCMV-SPORT6-Aspa. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 ^oC.
   3. Uruchom małą porcję na żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy plazmid jest w pełni zlinearyzowany.
4. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą fenol-chloroformu.
   1. Dodać 1:10 objętości 3 M octanu sodu, jedną objętość 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - zrównoważonego fenolu i jedną objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (IAA) (24:1).
   2. Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C, RT) i ekstrahować górną fazę wodną.
   3. Dodać jedną objętość chloroformu/IAA, odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę i ekstrahować górną fazę wodną.
   4. Powtórz krok 1.4.3.
   5. Dodać 2 objętości etanolu i pozostawić w temperaturze -20^oC na 1 godzinę lub O/N.
   6. Wirować w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.
   7. Przemyć osad 70% zimnym etanolem i ponownie zawiesić na poziomie około 1 μg cDNA na 2,5 μl w TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
5. Zsyntetyzować dwie sondy, jedną znakowaną digoksygeniną (DIG), a drugą izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).
   1. Wybierz odpowiednią polimerazę RNA, aby utworzyć sondę antysensowną (komplementarną do docelowego mRNA). W tym przykładzie użyj polimerazy RNA T7 do wykonania sondy Aspa.
   2. Przygotować reakcję transkrypcji in vitro: dodać 1 μg zlinearyzowanego DNA, 4,0 μl 5 x bufor transkrypcyjny, 6,0 μl 100 mM DTT, 2,0 μl 10 μl mieszaniny znakowanej DIG lub FITC RNA zawierającej dNTP, 1 μl inhibitora RNazy i 20 - 40 jednostek polimerazy RNA; uzupełnić końcową objętość do 20 μl wodą uzdatnioną DEPC.
   3. Inkubować w temperaturze 37 ^oC przez 1,5 godziny.
6. Uruchom 1 μl reakcji transkrypcji na 1,0% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy reakcja zadziałała. Żel powinien pokazywać szablon liniowy i jasny pasek sondy.
7. Uzupełnić objętość do 100 μl buforem hybrydyzacyjnym i przechowywać 10 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

2. Perfuzja, utrwalenie i pobieranie tkanek

1. UWAGA: Podczas pracy z paraformaldehydem (PFA), zarówno stałym, jak i wodnym, należy nosić środki ochrony osobistej i używać szafki bezpieczeństwa. Przygotować roztwór formaldehydu, rozpuszczając 4% (m/v) PFA w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą ciepła (55 °C). Przefiltruj roztwór formaldehydu za pomocą bibuły filtracyjnej.
2. Przygotować roztwór sacharozy, rozpuszczając 20% (m/v) sacharozę w wodzie destylowanej i dodając 0,1% (v/v) roztwór DEPC. Pozostaw O/N w RT z luźną pokrywką, a następnie autoklaw.
3. Znieczulenie końcowe myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitonu (50 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, a brak odruchu wycofania wskazuje na głębokie znieczulenie.
4. Gdy mysz znajdzie się w głębokim znieczuleniu, wykonaj nacięcie pod klatką piersiową i przetnij klatkę piersiową po obu stronach, podnieś ją, aby odsłonić serce.
5. Wbić igłę 25 G do lewej komory serca. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca.
6. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia za pomocą 20 ml PBS, a następnie 40 ml roztworu formaldehydu. W przypadku myszy P30 i starszych należy stosować szybkość perfuzji 12 ml / min, ale w przypadku młodszych zwierząt należy stosować niższą szybkość (7 - 10 ml / min).
7. Przeanalizuj mózg.
   1. Odetnij głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi, wykonując nacięcie z tyłu od uszu. Wykonaj ogonowe nacięcie linii środkowej w skórze i pracuj rostralnie, aby usunąć skórę z czaszki.
   2. Zaczynając od części ogonowej, przeciąć górną część czaszki wzdłuż linii środkowej i między oczami nożyczkami do tęczówki. Usuń płytkę kostną ciemieniową i czołową, przechylając za każdym razem jedną stronę płytki kostnej i odłamując ją pęsetą.
   3. Delikatnie przechyl mózg do góry od przedniej części za pomocą pęsety i przetnij nerwy wzrokowe i inne nerwy czaszkowe. Delikatnie wyjmij mózg z czaszki.
8. Umieść mózg w koronalnej macierzy mózgu myszy. Pokrój mózg na 3 kawałki o średnicy około 4 mm za pomocą żyletki z piór.
9. Przenieść plastry do 4% roztworu PFA i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.
10. Przenieść wycinki mózgu do 20% roztworu sacharozy poddanego działaniu DEPC i inkubować O/N w temperaturze 4 °C
11. Umieść każdy plasterek mózgu w suchej krioformie, otocz pożywką o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamroź na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Kriosekcja

1. Wytnij 15 μm skrawki zamrożonej tkanki w kriostacie i zbierz skrawki na szkiełka mikroskopowe. W razie potrzeby zwilż sekcje PBS poddanym działaniu DEPC i spłaszcz je drobnym pędzlem.
2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na około 1 godzinę, aby upewnić się, że chusteczka przylega do szkiełka.

4. Hybrydyzacja

1. Przygotować bufor do przemywania o temperaturze 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x solony cytrynian sodu), 50% (v/v) formamid i 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Przygotować bufor MABT: 100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Rozcieńczyć dwie sondy (znakowaną DIG i FITC) w stosunku 1:1000 w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do temperatury 65 °C i dobrze wymieszać.
4. Nałożyć około 300 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej na każde szkiełko nakrywkowe z szkiełkami nakrywkowymi wypieczonymi w piekarniku (200 ^oC) i inkubować O/N w temperaturze 65 °C w wilgotnej komorze.
5. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego wstępnie podgrzany bufor do mycia. Myć szkiełka przez 30 minut dwa razy w temperaturze 65 °C z buforem do płukania.
6. Myć szkiełka przez 10 minut trzykrotnie za pomocą MABT w RT.

5. Wizualizacja sondy FITC

1. Przygotować bufor blokujący ISH: MABT z 2% odczynnikiem blokującym i 10% inaktywowaną termicznie surowicą owczą.
2. Opcjonalnie: za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj kółka wokół odcinków tkanki na szkiełku, aby zmniejszyć wymaganą objętość roztworów przeciwciał.
3. Inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z buforem blokującym ISH w wilgotnej komorze.
4. Inkubować szkiełka O/N w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-FITC sprzężonym z peroksydazą chrzanową (POD) rozcieńczonym w stosunku 1/500 (v/v) w buforze blokującym ISH.
5. Umieść szkiełka w słoiku Coplin zawierającym PBS z 0,1% (v/v) Tween-20 (PBST). Umyj 3 razy przez 10 minut w PBST i za każdym razem zastąp świeżym PBST.
6. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować tyramid fluorescencyjny, rozcieńczając go 100 razy w rozcieńczalniku Amplifikacja. W tym przykładzie użyj FITC-tyramide.
7. Dodaj to do slajdów i pozostaw na 10 minut w RT.
8. Umieść szkiełka w słoiku Coplin i umyj 3 razy w PBST przez 10 minut.

6. Wizualizacja sondy DIG

1. Przygotować 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.
2. Inkubować szkiełka z buforem blokującym ISH przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Inkubować szkiełka O/N w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-DIG sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (AP) rozcieńczonym w stosunku 1/1,500 (v/v) w buforze blokującym ISH.
4. Myć MABT przez 10 minut trzy razy.
5. Umyć dwukrotnie 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować roztwór Fast Red, rozpuszczając tabletki w 0,1 M Tris pH 8,2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μM.
7. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C z roztworem Fast Red w wilgotnej komorze. Ponieważ czas optymalnego rozwoju jest różny, należy regularnie sprawdzać szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować tworzenie się osadu. W tym przykładzie przerwij reakcję po 2-3 godzinach.
8. Myć PBST przez 10 minut trzy razy.

7. Immunohistochemia

1. Przygotować bufor blokujący IHC: 10% (v/v) surowicy (innego gatunku niż pierwotne przeciwciało gospodarza) w PBST.
2. Inkubować szkiełka z buforem blokującym IHC przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze
.
3. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe: rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w odpowiednim rozcieńczeniu w PBST 5% surowicą (innego gatunku niż przeciwciało pierwszorzędowe gospodarza). W tym przykładzie należy użyć króliczego przeciwciała anty-Olig2 w rozcieńczeniu 1/400 (v/v).
4. Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C O/N.
5. Myć PBST przez 10 minut trzy razy.
6. Przygotować przeciwciało drugorzędowe: rozcieńczyć sprzężone z fluoroforem przeciwciało drugorzędowe w odpowiednim rozcieńczeniu w PBST 5% (v/v) surowicy (innego gatunku niż pierwszorzędowe przeciwciało gospodarza) i 0,1% (v/v) Hoechst 33258. W tym przykładzie należy użyć przeciwciała drugorzędowego Alexa647 przeciwko królikowi w rozcieńczeniu 1/1,000 (v/v).
7. Inkubować w drugorzędowym roztworze przeciwciała w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
8. Myć PBST przez 10 minut trzy razy.

8. Montaż

1. Częściowo wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej i zamontować za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia, a następnie zobrazuj w mikroskopie konfokalnym pod obiektywami 10X, 20X i 63X przy użyciu 4 różnych kanałów o następujących długościach fal wzbudzenia: 570 nm dla Fast Red, 488 nm dla FITC, 647 nm dla immunoznakowania Olig2 i 350 nm dla Hoechst.

Wyniki

Ten artykuł opisuje metodę podwójnej fluorescencji ISH, a następnie znakowania immunologicznego w sekcjach mózgu myszy. Krótki opis tego protokołu przedstawiono na rysunku 1. Pierwszym krokiem była synteza sond specyficznych dla Aspa i Mbp (zasadowego białka mielinowego). Aby sprawdzić, czy sondy zostały zsyntetyzowane, niewielką porcję każdej reakcji przeprowadzono na żelu agarozowym. Można dostrzec słabą matrycę liniową i dużą ilość sondy RNA (...

Dyskusja

Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku dla podwójnej hybrydyzacji RNA in situ , a następnie barwienia immunologicznego. Użyliśmy tego protokołu, aby potwierdzić, że Aspa ulega ekspresji w dojrzałych oligodendrocytach w kilku obszarach mózgu.

Ta wieloetapowa procedura ma wiele potencjalnych pułapek, które mogą wpływać na wrażliwość i należy ich unikać. Po pierwsze, wszystkie roztwory i magazynujące dla reakcji transkrypcji muszą być wolne od RNazy. Po drugie, wybór matr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
QIAprep Miniprep	Qiagen	27104
Dejonizowany formamid	Sigma	F9037	do buforu blokującego ISH
Chlorek sodu	Sigma	S3014
Trizma Base	Sigma	T1503
Kwas solny	VWR International	20252.290
Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny	Sigma	S8282
Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny	Sigma	30435
Drożdże tRNA	Roche	10109495001
50x roztwór Denhardta	Life Technologies	750018
Siarczan dekstranu	Sigma	D8906
Aspa klon cDNA	Źródło: Bioscience	IRAVp968C0654D
SalI	New England Biolabs	R0138
Octan sodu	Sigma	S2889
Zrównoważony fenol	Sigma	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Alkohol izoamylowy	Aldrich	496200
Etanol	VWR International	20821.321
T7 RNA polimeraza	Promega	P4074
Bufor transkrypcyjny	Promega	P118B
100 mM DTT	Promega	P117B
UTP-DIG NTP mix	Roche	11277073910
Rnasin	Promega	N251B
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Bibuła filtracyjna	Fisher	005479470
Sacharoza	Sigma	59378
pirowęglan dietylu	Sigma	D5758
Pentobarbitone	Animalcare Ltd	BN43054
Nożyczki preparacyjne	World Precision Instruments	15922
Igła o rozmiarze 25	Terumo	300600
Pompa perystaltyczna	Cole-Parmer Instrument Co., Ltd	WZ-07522-30
Nożyczki do przysłony	Weiss	103227
pęseta nr 2	World Precision Instruments	500230
Coronal Brain Matrix	World Precision Instruments	RBMS-200C
Żyletka	Personna Medical	PERS60-0138
OCT medium	Tissue tek	4583
Kriostat/mikrotom	Bright
Superfrost plus szkiełka	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cytrynian sodu	Sigma	S4641	do 65 & stopni; C bufor do płukania
Formamid	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Szkiełka nakrywkowe	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Odczynnik blokujący	Roche	11096176001
Inaktywowana termicznie surowica	owcza Sigma	S2263
Długopis hydrofobowy	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	1:500
α-FITC POD-przeciwciało sprzężone	Roche	11426346910
TSA&handel; Plus System fluoresceiny	Perkin Elmer	NEL741001KT	1:1,500
α-DIG AP-sprzężone	z	11093274910
Szybkie czerwone tabletki	Roche	11496549001.22
µ Filtr M	Millex	SLGP033RS
α-Olig2 Mrówkojad królika	Millipore	AB9610
Alexa Fluor® 647-sprzężone &alfa;-królicze przeciwciało	Technologie życia	A-31573	1:1,000
bisBenzimide H 33258	sigma	B2883
Medium montażowe	Dako	S3023
Leica SP2 konfokalne mikroskop	Leica