Budowa modeli do nieniszczącego przewidywania zawartości składników w borówkach za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni w oparciu o pomiary HPLC

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj protokół do konstruowania i walidacji modeli do nieniszczącego przewidywania całkowitej zawartości cukru, całkowitej zawartości kwasu organicznego i całkowitej zawartości antocyjanów w poszczególnych jagodach za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni.

Streszczenie

Nieniszczące przewidywanie zawartości składników w produktach rolnych jest przydatne do wysyłki i sprzedaży produktów o gwarantowanej jakości. W tym przypadku spektroskopia w bliskiej podczerwieni służy do przewidywania nieniszczącej zawartości cukru całkowitego, całkowitej zawartości kwasu organicznego i całkowitej zawartości antocyjanów w każdej borówce. Oczekuje się, że technika ta umożliwi selekcję tylko pysznych borówek ze wszystkich zebranych. Widma absorpcyjne jagód w bliskiej podczerwieni są mierzone w trybie odbicia rozproszonego w miejscach nie na kielichu. Zawartość składników w borówce oznaczona za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej służy do konstruowania modeli do przewidywania zawartości składników na podstawie obserwowanych widm. Do konstruowania modeli używana jest częściowa regresja metodą najmniejszych kwadratów. Konieczne jest odpowiednie dobranie obróbki wstępnej dla obserwowanych widm oraz obszarów długości fal widm wykorzystywanych do analiz. Walidacje są konieczne, aby skonstruowane modele potwierdziły, że zawartość składników jest przewidywana z praktyczną dokładnością. W tym miejscu przedstawiamy protokół do konstruowania i walidacji modeli do nieniszczącego przewidywania zawartości składników w borówkach za pomocą spektroskopii w bliskiej podczerwieni.

Wprowadzenie

Spektroskopia bliskiej podczerwieni (NIR) jest szeroko stosowana jako technika nieniszcząca do analizy zawartości owoców i warzyw różnego rodzaju. ^1,2 Analizy nieniszczące za pomocą spektroskopii NIR umożliwiają wysyłkę tylko pysznych owoców i warzyw o gwarantowanych właściwościach. Spektroskopia NIR została już zastosowana do pomarańczy, jabłka, melona, wiśni, owoców kiwi, mango, papai, brzoskwini i tak dalej, aby poznać ich Brix, który odpowiada całkowitej zawartości cukru, kwasowości, TSC (całkowita zawartość ciał stałych) i tak dalej. Ostatnio informowaliśmy o zastosowaniu spektroskopii NIR do oceny jakości borówek. ³ Zmierzyliśmy nie tylko całkowitą zawartość cukru i całkowitą zawartość kwasów organicznych odpowiadającą kwasowości, ale także całkowitą zawartość antocyjanów. Antocyjany są składnikiem bioaktywnym, który, jak się uważa, poprawia zdrowie człowieka. Jest to wygodne dla konsumentów, jeśli mogą kupić pyszne jagody z gwarancją zawartości cukru, kwasowości i antocyjanów.

W widmach absorpcyjnych NIR owoców i warzyw obserwuje się tylko szerokie pasma absorpcyjne. Są to głównie opaski ze względu na włókno i wilgoć. Chociaż jednocześnie obserwowanych jest wiele słabych pasm spowodowanych różnymi składnikami niezniszczonego celu, obserwowane pasma w większości przypadków nie mogą być przypisane do określonych trybów drgań określonych składników celu. Dlatego tradycyjna technika określania zawartości określonego składnika za pomocą prawa Lamberta-Beera nie jest skuteczna w przypadku widm NIR. Zamiast tego modele kalibracyjne do przewidywania zawartości składników docelowych z obserwowanych widm są konstruowane przy użyciu chemometrii poprzez badanie korelacji między obserwowanymi widmami a zawartością składników odpowiadającą widmom. ^4,5 W tym miejscu przedstawiono protokół do konstruowania i walidacji modeli do przewidywania całkowitej zawartości cukru, całkowitej zawartości kwasów organicznych odpowiadającej kwasowości oraz całkowitej zawartości antocyjanów w borówkach z widm NIR.

Rysunek 1 pokazuje ogólny schemat blokowy do konstruowania wiarygodnych i solidnych modeli kalibracji. Pobiera się próbki w wystarczającej liczbie. Niektóre z nich służą do budowy modeli, podczas gdy inne służą do walidacji skonstruowanych modeli. Dla każdej z pobranych próbek mierzone jest widmo NIR, a następnie docelowe składniki są analizowane ilościowo tradycyjnymi metodami niszczącej analizy chemicznej. W tym przypadku wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest stosowana do analiz chemicznych cukrów, kwasów organicznych i antocyjanów. Regresja cząstkowa metodą najmniejszych kwadratów (PLS) służy do budowy modeli kalibracyjnych, w których badana jest korelacja między obserwowanymi widmami a zawartością składników wyznaczoną za pomocą analiz chemicznych. W celu skonstruowania solidnych modeli o najlepszych zdolnościach predykcyjnych badane są również wstępne obróbki obserwowanych widm oraz obszary długości fal wykorzystywane do przewidywania. Na koniec skonstruowane modele są weryfikowane w celu potwierdzenia ich wystarczającej zdolności przewidywania. W walidacji treści przewidywane z widma obserwowanego przez skonstruowany model (wartości przewidywane) są porównywane z zawartościami wyznaczonymi przez analizy chemiczne (wartości obserwowane). Jeżeli nie można znaleźć wystarczającej korelacji między wartościami przewidywanymi a obserwowanymi, model kalibracyjny powinien zostać ponownie skonstruowany do momentu uzyskania wystarczającej korelacji. Chociaż preferowane jest stosowanie różnych grup próbek do budowy i walidacji modelu, jak pokazano na tym rysunku (walidacja zewnętrzna), próbki z tej samej grupy są wykorzystywane zarówno do budowy, jak i walidacji (walidacji krzyżowej), gdy liczba próbek nie jest wystarczająco duża.

Rysunek 1. Schemat blokowy do budowy i walidacji modelu kalibracyjnego. Procedury oznaczone niebieską i zieloną linią odpowiadają odpowiednio budowie modelu kalibracyjnego i jego walidacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Pobieranie próbek

1. Zdecyduj, które odmiany zostaną uwzględnione w celu modelu kalibracyjnego.
2. Zebrać wystarczającą liczbę i różne rodzaje próbek borówek docelowych odmian.
   1. Najlepiej zebrać 100 jagód do budowy modelu kalibracyjnego i co najmniej 10 do walidacji zbudowanego modelu. W celu skonstruowania solidnych modeli należy zebrać próbki różnego typu, tj. o różnych kolorach, rozmiarach i w różnych warunkach dojrzewania.
3. Zważ każdą jagodę. Uwaga: Zmierzone masy są później wykorzystywane do obliczania procentowej zawartości składników każdej borówki.

2. Pomiary widm

1. Rozgrzej spektrofotometr wystarczająco (ponad 1 godzinę) przed pomiarami, aby uzyskać wiarygodne widma.
2. Ustaw spektrofotometr. Upewnij się, że warunki są stałe przez cały czas pomiarów. Przykład typowych warunków pomiarów znajduje się poniżej.
   1. Ustaw zakres wymiarów na 12 500-3 600 ^cm-1.
   2. Ustaw rozdzielczość spektralną na 16 ^cm-1.
   3. Ustaw akumulację na 32 razy.
3. Wybierz współczynnik odbicia rozproszonego jako tryb pomiaru.
4. Umieść standardowy odbłyśnik na okienku spektrofotometru w celu pomiarów odbicia rozproszonego. Za pomocą polecenia "tło jednokanałowe" zmierz widmo tła, które jest automatycznie wykorzystywane do obliczania względnych widm odbicia na podstawie widm próbek jagód zmierzonych później.
5. Umieść próbkę jagód na środku okienka spektrofotometru w celu pomiarów odbicia rozproszonego. Korzystając z polecenia "sample single channel", zmierz widma każdej borówki, najlepiej w kilku punktach owocu.
   Uwaga: Transformacja Kubelki-Munka^6,7 zostanie również przeprowadzona automatycznie dla obserwowanych widm próbki borówki, jeśli warunek akwizycji widmowej jest na to ustawiony. Transformacja Kubelki-Munka zmienia widma mierzone w trybie odbicia rozproszonego na widma równoważne widmom mierzonym w trybie transmisyjnym i jest potrzebna do analiz widm z dużą dokładnością. Do analiz wykorzystywane są widma w skali absorbancji.
6. Oblicz średnie widmo widm każdej próbki za pomocą programu do przetwarzania danych, takiego jak MS Excel, jeśli widma próbki borówki są mierzone w kilku punktach. Do analiz należy wykorzystać uśrednione widmo.

3. Obróbka wstępna do pomiarów HPLC cukrów i kwasów organicznych⁸

Uwaga: Ekstrahuj cukry i kwasy organiczne z każdej jagody, które są rozpuszczalne w wodzie, z ultraczystą wodą w następujący sposób. Cała borówka jest wykorzystywana do analiz.

1. Przechowywać jagody w zamrażarce w temperaturze poniżej -30 °C w stanie gotowym do analiz chemicznych, jeśli nie zostaną przeanalizowane bezpośrednio po pomiarach spektralnych.
2. Pokrój jagodę na kilka kawałków, aby można ją było łatwo homogenizować w kolejnych krokach. Pokrój jagodę bez rozmrażania, gdy jest zamrożona.
3. Kawałki przełożyć do zlewki o pojemności 50 ml.
4. Dodać do zlewki ok. 10 ml wody ultraczystej (wody destylowanej, której przewodność elektryczna jest mniejsza niż 0,1 μS/cm).
5. Podgrzej pokrojoną borówkę w ultraczystej wodzie w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund, aby dezaktywować enzymy, które mogą rozkładać cukry podczas analiz.
6. Do zlewki dodać ok. 10 ml ultraczystej wody.
7. Homogenizuj mieszaninę przez 5 minut przy 12 000 obr./min za pomocą homogenizatora wyposażonego w standardowy wał i generator.
8. Odwirować homogenizowaną mieszaninę przez 10 minut przy 3 000 obr./min (2 000 × g).
9. Zebrać filtrat przez filtrację próżniową odwirowanej próbki za pomocą filtra bibułowego 5B.
10. Powtórzyć kroki 3.6-3.9 dwukrotnie na pozostałości filtracyjnej, aby zebrać wszystkie cukry i kwasy organiczne i połączyć wszystkie filtraty.
11. Zmierzyć pH filtratu i dostosować je do 7 za pomocą rozcieńczonego kwasu solnego (0,1 i 0,01 mola ^L-1) i rozcieńczonych wodnych roztworów wodorotlenku sodu (0,1 i 0,01 mola ^L-1).
12. Rozcieńczyć filtrat do 50 ml ultraczystą wodą.
13. Podzielić próbkę na dwie części: jedną do analizy cukrów, a drugą do analizy kwasów organicznych.
14. Przepuść pierwszy roztwór próbki przez kolumny (dwie C18, CM i QMA) połączone szeregowo, aby wykluczyć pigmenty, kationy i aniony. Wyrzucić pierwszy 1 ml roztworu próbki z kolumn. Następnie użyć roztworu próbki z kolumn do analizy cukrów metodą HPLC.
15. Przepuścić drugi roztwór próbki przez kolumny (dwie C18 i CM) połączone szeregowo w celu wykluczenia pigmentów i kationów. Wyrzucić pierwszy 1 ml roztworu próbki z kolumn. Następnie użyć roztworu próbki z kolumn do analizy kwasów organicznych za pomocą HPLC.
16. Odwirować każdy roztwór z etapów 3.14 i 3.15 przy 6.600 obr./min (5.800 × g) przez 10 minut w mikroprobówce wyposażonej w filtr 0,45 μm z miniwirówką przed analizą metodą HPLC.

4. Pomiary cukrów metodą HPLC

Uwaga: W tym badaniu, suma zawartości sacharozy, glukozy i fruktozy w każdej borówce jest uważana za całkowitą zawartość cukru. W związku z tym najpierw uzyskuje się krzywą roboczą dla każdego z trzech cukrów, a następnie uzyskuje się sumę zawartości cukrów w każdej borówce. Standardowe zawartości wynoszą 0,3-0,4% wagowych (sacharoza), 3,8-4,8% wagowych (glukoza) i 4,2-5,3% wagowych (fruktoza). ⁹

1. Dokładnie odmierz około 200 mg sacharozy i rozpuść ją w 50 ml ultraczystej wody, aby przygotować wzorcowy roztwór. Rozcieńczyć 5 ml roztworu do 50 ml ultraczystą wodą w celu przygotowania drugiego roztworu wzorcowego. Przygotować w podobny sposób trzeci roztwór wzorcowy z drugiego roztworu wzorcowego.
2. Przygotuj wzorcowe roztwory glukozy i fruktozy, podobnie.
3. Ułóż system HPLC w następujący sposób:
   1. Użyć kolumny do przenikania żelu w piecu kolumnowym w temperaturze 40 °C.
   2. Jako eluat należy użyć odgazowanej ultraczystej wody o natężeniu przepływu 0,1 ml/min.
   3. Użyj detektora indeksu refrakcji.
4. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów wzorcowych, wstrzykując podwielokrotność 20 μl dla każdego pomiaru. Uwaga: W tym przypadku rozwiązanie PAC jest używane jako oprogramowanie do pomiaru.
5. Uzyskaj intensywność obszaru pasma cukru na chromatogramie każdego roztworu wzorcowego, klikając "ponowna analiza" prawym przyciskiem myszy.
6. Wykreślić natężenie powierzchni w stosunku do odpowiednich stężeń, aby uzyskać krzywą roboczą dla każdego cukru za pomocą regresji liniowej, gdzie równanie reprezentujące stosunek między intensywnością powierzchni a stężeniem otrzymuje się dla każdego cukru.
7. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów próbek, wstrzykując 20 μl podwielokrotności dla każdego pomiaru.
8. Na chromatogramie każdego roztworu próbki należy obliczyć natężenia obszarowe pasm cukrów, jak opisano wcześniej w kroku 4.5.
9. Obliczyć stężenia cukrów w roztworach, stosując równania odpowiadające krzywym roboczym otrzymanym w kroku 4.6.
10. Ilość każdego cukru w każdej borówce należy obliczyć na podstawie stężeń roztworu próbki otrzymanego w poprzednim etapie oraz całkowitej objętości roztworu próbki (50 ml, patrz krok 3.12).
11. Uzyskaj całkowitą zawartość cukru w każdym owocu, sumując zawartość trzech cukrów.
12. Obliczyć procentową zawartość całkowitego cukru w każdej borówce, używając masy zmierzonej w kroku 1.3.

5. Pomiary kwasów organicznych metodą HPLC

Uwaga: W tym badaniu, suma zawartości kwasu cytrynowego, chinowego, jabłkowego i bursztynowego jest uważana za całkowitą zawartość kwasu organicznego. Dlatego najpierw uzyskuje się krzywą roboczą dla każdego z czterech kwasów organicznych, a następnie mierzy się zawartość kwasów organicznych w każdej borówce. Standardowe zawartości są podawane jako 0,42-0,62% wag. (kwas cytrynowy), 0-0,15% wag. (kwas chinowy), 0,08-0,23% wag. (kwas jabłkowy) i 0,06-0,25% wag. (kwas bursztynowy). ⁹

1. Dokładnie odmierz około 5 mg kwasu cytrynowego i rozpuść go w 50 ml ultraczystej wody, aby przygotować roztwór wzorcowy. Rozcieńczyć 5 ml roztworu do 50 ml ultraczystą wodą w celu przygotowania drugiego roztworu wzorcowego. Przygotować w podobny sposób trzeci roztwór wzorcowy z drugiego roztworu wzorcowego.
2. Przygotuj roztwory wzorcowe kwasu chinowego, kwasu jabłkowego i kwasu bursztynowego, podobnie.
3. Ułóż system HPLC w następujący sposób:
   1. Użyć dwóch kolumn anionowymiennych połączonych szeregowo w piecu kolumnowym w temperaturze 40 °C.
   2. Jako eluat należy użyć odgazowanego 0,1% wodnego roztworu kwasu fosforowego o natężeniu przepływu 0,02 ml/min.
   3. Użyj detektora światła ultrafioletowego ustawionego na 210 nm.
4. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów wzorcowych, wstrzykując 20 μl podwielokrotności roztworu wzorcowego do każdego pomiaru.
5. Uzyskaj intensywność obszaru pasma kwasu organicznego na chromatogramie każdego roztworu wzorcowego, klikając "ponowna analiza" prawym przyciskiem myszy.
6. Wykreślić natężenia powierzchni w stosunku do odpowiednich stężeń, aby uzyskać krzywą roboczą dla każdego kwasu organicznego za pomocą regresji liniowej, gdzie równanie reprezentujące zależność między intensywnością obszaru a stężeniem uzyskuje się dla każdego kwasu organicznego.
7. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów próbek, wstrzykując 20 μl podwielokrotności próbki do każdego pomiaru.
8. Na chromatogramie każdego roztworu próbki należy uzyskać natężenia obszarowe pasm kwasów organicznych, jak opisano wcześniej w kroku 5.5.
9. Obliczyć stężenia kwasów organicznych w roztworach, stosując równania odpowiadające krzywym roboczym otrzymanym w kroku 5.6.
10. Ilość każdego kwasu organicznego w każdej borówce należy obliczyć na podstawie stężeń roztworu próbki otrzymanego w poprzednim etapie oraz całkowitej objętości roztworu próbki (50 ml, patrz krok 3.12).
11. Uzyskaj całkowitą ilość kwasu organicznego w każdej borówce, sumując zawartość czterech kwasów organicznych.
12. Uzyskaj procentową zawartość całkowitego kwasu organicznego w każdej borówce, używając masy zmierzonej w kroku 1.3.

6. Obróbka wstępna do pomiarów antocyjanów metodą HPLC

1. Przechowuj jagody w zamrażarce w temperaturze poniżej -80 °C, aby były gotowe do analiz chemicznych, jeśli nie są analizowane bezpośrednio po pomiarach spektralnych.
2. Każdy zamrożony owoc suszyć liofilizatorem próżniowym przez 12 godzin.
3. Ekstrahować antocyjany z suszonej borówki w 1% roztworze metanolu kwasu trifluorooctowego [masa borówki (g)/objętość roztworu (ml) = 1/10], pozostawiając mieszaninę w lodówce w temperaturze 4 °C na 12 godzin.
4. Odwirować ekstrakt przez 15 minut w mikroprobówce o pojemności 2 ml za pomocą ultrawirówki w temperaturze -8 °C i prędkości 15 000 obr./min (21 900 × g).
5. Przefiltrować ekstrakt przez filtr 0,45 μm, aby uzyskać próbkę do pomiarów HPLC.

7. Pomiary antocyjanów metodą HPLC

Uwaga: Około 13 rodzajów antocyjanów jest zawartych w jagodach. Ponieważ trudno jest uzyskać krzywe robocze dla wszystkich antocyjanów, uzyskuje się krzywą roboczą tylko dla chlorku cyjanidyno-3-O-glukozydu, jednego z najpopularniejszych antocyjanów w borówkach. Krzywą roboczą stosuje się do przybliżonych kwantyfikacji innych antocyjanów.

1. Odmierz dokładnie około 1,5 mg chlorku cyjanidyno-3-O-glukozydu i rozpuść go w 10 ml 1% roztworu metanolu kwasu trifluorooctowego, aby przygotować roztwór wzorcowy. Rozcieńczyć 5 ml roztworu do 10 ml 1% roztworem metanolu kwasu trifluorooctowego w celu przygotowania drugiego roztworu wzorcowego. Podobnie przygotuj kolejno trzeci i czwarty roztwór wzorcowy.
2. Ułóż system HPLC w następujący sposób:
   1. Użyć kolumny C18 z odwróconymi fazami w piecu kolumnowym w temperaturze 40 °C.
   2. Metodę gradientową zastosować stosując eluaty 0,1% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego (elucja A) i 0,5% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu (elucja B) o natężeniu przepływu 0,1 ml/min, gdzie stosunek elucji B wzrasta od 8% do 15% w ciągu 0-50 min po wstrzyknięciu oraz od 15% do 75% w ciągu 50-60 min po wstrzyknięciu.
   3. Użyj detektora fotodiodowego monitorującego przy długości fali 520 nm.
3. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów wzorcowych, wstrzykując 10 μl podwielokrotności dla każdego pomiaru. "Roztwór LC" jest używany jako oprogramowanie do pomiaru.
4. Uzyskaj intensywność obszaru pasma chlorku cyjanidyno-3-O-glukozydu na chromatogramie każdego roztworu wzorcowego, klikając "ponowna analiza" prawym przyciskiem myszy.
5. Wykreślić natężenie powierzchni w stosunku do odpowiednich stężeń, aby uzyskać krzywą roboczą chlorku cyjanidyno-3-O-glukozydu za pomocą regresji liniowej, gdzie równanie reprezentujące zależność między intensywnością obszaru a stężeniem otrzymuje się dla chlorku cyjanidyno-3-O-glukozydu.
6. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów próbek, wstrzykując 10 μl podwielokrotności dla każdego pomiaru.
7. Na chromatogramie każdego roztworu próbki należy obliczyć natężenie powierzchni pasma każdego antocyjanu, jak opisano wcześniej w kroku 7.4.
8. Obliczyć stężenia antocyjanów w roztworach, stosując równanie odpowiadające krzywej roboczej otrzymanej w kroku 7.5.
9. Otrzymać ilości każdego antocyjanu w każdej borówce na podstawie stężenia uzyskanego w poprzednim etapie oraz całkowitą objętość roztworu próbki użytego w kroku 6.3.
10. Uzyskaj całkowitą ilość antocyjanów w każdej jagodzie, sumując zawartość trzynastu antocyjanów.
11. Uzyskaj procentową zawartość całkowitych antocyjanów w każdej borówce, używając masy zmierzonej w kroku 1.3.

8. Budowa modeli kalibracyjnych do przewidywania zawartości składników

Uwaga: Regresja ^PLS,4,5, która jest rodzajem techniki regresji wielorakiej wykorzystującej warianty utajone, jest używana do budowy modeli kalibracyjnych dla każdego składnika z obserwowanych widm i zawartości składnika określanej przez analizy chemiczne. Regresja PLS jest wykonywana albo za pomocą programów komercyjnych, albo za pomocą programów domowych. Patrz referencje^5,10, aby zapoznać się ze szczegółowymi procesami budowy modeli.

1. Zbadaj, które zabiegi wstępne dla obserwowanych widm są najskuteczniejsze w celu uzyskania dokładnego i solidnego przewidywania.
   1. Skonstruuj modele kalibracyjne, stosując jedną lub dwie z następujących metod obróbki wstępnej: MSC (Multiplikatywna Korekcja Rozproszenia), ^1,2,5 SNV (Standardowa Normalna Zmienność),^1,2,5 MMN (Normalizacja Min-Max), COE (Eliminacja Stałego Przesunięcia) oraz pierwsze lub drugie obliczenie pochodnej metodą SG (Savitzky-Golay). ^1,2,5 Przewiduj zawartość składników w zbiorze walidacyjnym na podstawie ich widm za pomocą skonstruowanych modeli.
      Uwaga: W MMN widmo jest znormalizowane tak, że wartości minimalne i maksymalne wynoszą odpowiednio 0 i 1. W COE rzędna widma jest przesunięta tak, że wartość minimalna wynosi zero.
   2. Obliczyć współczynnik determinacji, R² i resztkowe odchylenie predykcyjne, RPD, między obserwowanymi i przewidywanymi wartościami zestawu walidacyjnego, aby zbadać, które zabiegi wstępne dla obserwowanych widm są najbardziej skuteczne. Wybierz kombinację obróbki wstępnej, która daje większy R² i RPD.
2. Zbadaj, które regiony liczby falowej są efektywne dla dokładnego i niezawodnego przewidywania, stosując na przykład technikę PLS z ruchomymi oknami¹¹ w celu przeszukania efektywnych regionów.
   Uwaga: Procedura odpowiada usuwaniu obszarów liczby falowej, w których widma nie zawierają żadnych efektywnych informacji dla przewidywań lub zawierają informacje, które zakłócają przewidywania.

9. Walidacja skonstruowanych modeli kalibracyjnych

Uwaga: Zobacz odnośniki^5,10, aby zapoznać się ze szczegółowymi procesami walidacji skonstruowanych modeli.

1. Przewiduj zawartość składników w zbiorze walidacyjnym na podstawie ich widm za pomocą skonstruowanych modeli kalibracyjnych z najlepszą kombinacją obróbki wstępnej i dla regionów liczby falowej skutecznych dla prognozy. ^5,10
2. Obliczyć R² i RPD między obserwowanymi i przewidywanymi wartościami zestawu walidacyjnego. ^5,10
3. Zbadaj, czy spełnione są ogólne kryteria praktycznego działania modeli kalibracyjnych12,13 R² > 0,85 i RPD > 2,5. Rozważ rekonstrukcję modelu, jeśli kryteria nie są spełnione.

Wyniki

Rysunek 2 pokazuje jako przykład zestaw widm absorpcyjnych NIR borówek, gdzie widma 70 jagód są pokazane jednocześnie. Ponieważ w widmach NIR nie obserwuje się pasm definitywnie przypisywanych cukrom, kwasom organicznym lub antocyjanom, tradycyjne prawo Lamberta-Beera nie ma zastosowania do ilościowego określania zawartości składników. W związku z tym konieczna jest budowa modeli do przewidywania zawartości składników.

Dyskusja

Kilka dodatkowych uwag do protokołu jest opisanych tutaj. Po pierwsze, w kroku 1.1 wspomina się o tym, aby zdecydować, jakie odmiany wchodzą w skład celu. Chociaż możliwe jest skonstruowanie modeli obejmujących borówkę z wielu odmian lub bez wyszczególnienia odmian, dokładność prognoz za pomocą modeli jest czasami znacznie niższa niż w przypadku modeli dla pojedynczej odmiany i dla ograniczonej liczby odmian. Należy również zauważyć, że modele kalibracyjne powinny być konstruowane dla borówek amerykańskich z każdego zakł...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr FT-NIR	Bruker Optics GmbH	MPA
Wysokowydajna chromatografia cieczowa	Shimadzu Corporation	228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31	Do analizy
		223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31	Detektor indeksu refrakcji
Wysokowydajna chromatografia cieczowa	Shimadzu Corporation	228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31	Do analizy
		228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31	Detektor ultrafioletowy
Wysokowydajna chromatografia cieczowa	Shimadzu Corporation	228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31	Do analizy
		228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31	Detektor
		228-45009-31
pH-metr	Mettler-Toledo	30019028	S220, Automatyczna kompensacja temperatury
Urządzenia do uzdatniania wody ultraczystej	ORGANO Corporation	ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0	PURELAB ultra;
Zamrażarki biomedyczne PURELLIT	SANYO	2-6780-01	MDF-U338
Zamrażarka niskotemperaturowa	Panasonic healthcare Co., Ltd.	KM-DU73Y1-80	&stopni; C
Liofilizator próżniowy	IWAKI GLASS Co., Ltd	119770	DRC-3L; FRD-82M
Homoginizator	Microtec Co., Ltd.	Ultrawirówka Physcotron
	Hitachi Koki Co., Ltd	S204567	CF15RXII
Miniwirówka	LMS CO., LTD.	KN3136572	MCF-2360
Wirówka	Kokusan Co., Ltd	2-5534-01	H-103N
	Advantec	1521070	5B, równoznaczny z Whatman 40
Sep-Pak C18 kolumna	Waters Corporation Milford	WAT020515
Sep-Pak CM	kolumna Waters Corporation Milford	WAT020550
Filtr odśrodkowy	Merck Millipore Corporation	R2SA18503	PVDF, 0.45 μ m
Mikroprobówka	As One Corporation	1-1600-02	PP, 2 ml
Filtr strzykawkowy	GE Healthcare CO., LTD.	6788-1304	PP, 0,45 μ m
Sacharoza	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	194-00011	Glukoza klasy odczynnikowej
	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	049-31165	Odczynnik
fruktozowy	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	123-02762	Kwas
cytrynowy	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	036-05522
Kwas jabłkowy klasy odczynnikowej	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	355-17971	Odczynnik
kwasu bursztynowego	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	190-04332
Kwas chinowy	odczynnikowej Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company	10176328	Odczynnikowy
kwas fosforowy	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	162-20492
Kwas trifluorooctowy	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	208-02746	Metanol odczynnikowy
	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	131-01826	Acetonitryl klasy odczynnikowej
	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	015-08633	Klasa HPLC
Klasa cyjanidyna-3-O-chlorek glukozydu	Wako Pure Chemical Industries,Ltd	306-37661	Oprogramowanie klasy HPLC
do analiz	Bruker Optics GmbH	OPUS wersja 6.5
Softoware do wstępne przetwarzanie	Microsoft	Excel oparte na Visual Basic for Applications Oprogramowanie
do budowy modeli		Freemat 4.0	http://freemat.sourceforge.net/