Artykuł metodologiczny

Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna

DOI:

10.3791/53984

⸱

11 maja 2016

 ,  , 
1Department of Urology, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikropreparacji prostaty i chirurgicznej kastracji u myszy laboratoryjnej. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki uzyskane przez te protokoły. Na koniec omawiamy zalety i wykorzystanie tych protokołów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele myszy są szeroko wykorzystywane do badania raka prostaty i innych chorób. Mysz jest doskonałym modelem do badania prostaty i była używana jako substytut dla odkryć w rozwoju i chorobie prostaty u ludzi. Mikrorozwarstwienie prostaty umożliwia spójne badanie anatomii prostaty, histologii i cech komórkowych specyficznych dla płata prostaty przy braku zanieczyszczenia innych tkanek. Testosteron wpływa na rozwój i choroby prostaty. Terapia deprywacji androgenów jest powszechnym sposobem leczenia pacjentów z rakiem prostaty, ale wiele guzów prostaty staje się opornych na kastrację. Chirurgiczna kastracja modeli mysich pozwala na badanie odporności na kastrację i innych aspektów biologii hormonalnej prostaty. Procedura ta może być połączona z ponownym wprowadzeniem testosteronu lub hormonalną regeneracją prostaty, co jest potężną metodą badania linii komórek macierzystych w prostacie. Mikrorozwarstwienie prostaty i kastracja chirurgiczna otwierają wiele możliwości solidnych i spójnych badań nad rozwojem i chorobami prostaty. W manuskrypcie opisano protokoły mikrorozwarstwienia gruczołu krokowego i kastracji chirurgicznej u myszy laboratoryjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prostata jest najczęstszym miejscem raka u mężczyzn w USA. Każdego roku u prawie 220 000 mężczyzn zostanie zdiagnozowany rak prostaty, a około 27 000 mężczyzn zapadnie na tę chorobę 1. Mężczyźni mają 1 na 7 ryzyko zdiagnozowania raka prostaty w ciągu całego życia w USA 1. Łagodny przerost gruczołu krokowego (BPH), nienowotworowe powiększenie gruczołu krokowego związane z wiekiem, jest również powszechnym schorzeniem, dotykającym ponad 80% mężczyzn w wieku powyżej 80 lat 2. W związku z tym prostata jest przedmiotem wielu badań.

Modele mysie były szeroko wykorzystywane do badania chorób prostaty 3. Ogólnie rzecz biorąc, prostata myszy jest doskonałym przedstawicielem gruczołu ludzkiego 4, ale istnieją podobieństwa i różnice między anatomią i fizjologią prostaty myszy i człowieka 5. U obu gatunków prostata znajduje się u podstawy pęcherza moczowego, otaczając cewkę moczową. Ludzki gruczoł krokowy to pojedynczy płat, podzielony na cztery strefy: centralny, przejściowy, obwodowy i przedni zrąb włóknisto-mięśniowy. Natomiast prostata myszy składa się z trzech sparowanych płatów w różnych miejscach wokół cewki moczowej: przedniej, brzusznej i grzbietowo-bocznej. Na poziomie komórkowym główna różnica polega na tym, że stosunek komórek podstawnych do komórek świetlnych u człowieka wynosi około 1:1, ale u myszy 6 wynosi 1:4. Mysie zrąb jest również inny u myszy w porównaniu z ludźmi – ludzie mają bardziej rozbudowane mięśnie gładkie, podczas gdy warstwa mięśniowa jest znacznie cieńsza u mysiej prostaty. Właściwa identyfikacja, sekcja i postępowanie z prostatą myszy są niezbędne do badań nad prostatą u myszy.

Poziom hormonów drastycznie wpływa na rozwój i homeostazę gruczołu krokowego zarówno u ludzi, jak i u myszy. Podczas gdy estrogen wydaje się odgrywać rolę w rozwoju prostaty 7, najważniejszym hormonem w prostacie jest testosteron. Testosteron jest niezbędny do rozwoju i utrzymania gruczołów. Po fizycznej lub chemicznej kastracji około 90% komórek świetlnych w dorosłej prostacie ulega apoptozie, a gruczoł kurczy się. Jeśli testosteron zostanie ponownie wprowadzony do organizmu w warunkach kastracji, prostata jest w stanie zregenerować się do pełnej wydajności. Testosteron wydaje się również napędzać raka prostaty, dlatego terapia deprywacji androgenów jest powszechnie stosowaną strategią terapeutyczną. Jednak wiele nowotworów prostaty staje się opornych na niedobór androgenów. Ponadto mężczyźni poddawani terapii deprywacji androgenów w leczeniu raka prostaty przechodzą cykle stanów kastrowanych i regeneracyjnych. U myszy kastracja chirurgiczna, wraz z hormonalną regeneracją prostaty poprzez ponowne wprowadzenie testosteronu, jest ważnym narzędziem do badania odporności na kastrację i wpływu cyklu testosteronu na prostatę.

W tym artykule omówimy i zademonstrujemy właściwe techniki, za pomocą których można zlokalizować i przeprowadzić mikrosekcję prostaty myszy, a także chirurgicznie wykastrować mysz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten spełnia i jest zgodny z wytycznymi określonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Mikropreparacja prostaty myszy

  1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla lub alternatywną zatwierdzoną metodę zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.
  2. Przypnij mysz w pozycji leżącej do deski sekcyjnej, wbijając szpilkę przez każdą z czterech łap.
  3. Spryskaj brzuch 70% etanolem.
  4. Przytrzymaj skórę dolnej części brzucha kleszczami i nożyczkami przeciąć skórę i otrzewną około 1 cm przed otworem prącia, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów.
  5. Odetnij skórę i otrzewną od podbrzusza, po obu stronach brzucha do klatki piersiowej, odsłaniając jamę otrzewnej.
  6. Zidentyfikuj pęcherz moczowy i drogi moczowo-płciowe i odsłoń je, delikatnie przesuwając tłuszcz i inne narządy na bok.
  7. Za pomocą kleszczy chwyć nasieniowody u podstawy w pobliżu cewki moczowej i oderwij je.
  8. Powtórz z przeciwległymi nasieniowodami.
  9. Za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć pęcherz i pociągnij go do góry, jednocześnie używając nożyczek, aby przeciąć cewkę moczową poniżej pęcherza moczowego i brzuszną prostatę (około 1 cm poniżej podstawy pęcherza).
    Uwaga: Gdy pęcherz jest podciągany do góry, całe drogi moczowo-płciowe (zawierające pęcherz moczowy, część cewki moczowej, wszystkie płaty prostaty i pęcherzyki nasienne) pojawią się wraz z nim. Może pojawić się pewien opór.
  10. Umieścić drogi moczowo-płciowe (UGT) na szalce Petriego o średnicy 60-100 mm zawierającej około 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  11. Pozostałą część protokołu należy wykonać pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj dwóch cienkich kleszczyków, po jednym w każdej ręce. Trzymaj kleszcze "jak ołówek" i oprzyj przedramiona na blacie stołu, aby je ustabilizować.
  12. Użyj cienkich kleszczy, aby ustawić UGT tak, aby pęcherz znajdował się na górze, cewka moczowa była skierowana w dół, a pęcherzyki nasienne były umieszczone po obu stronach pęcherza.
  13. Chwyć cewkę moczową jednym kleszkiem i ostrożnie odciągnij tłuszcz drugimi kleszczami, nie odrywając tkanki prostaty. Uwaga: Tłuszcz będzie wyglądał na "błyszczący" w stosunku do otaczającej tkanki.
  14. Po usunięciu tłuszczu użyj kleszczy, aby rozerwać tkankę łączną między dwoma brzusznymi płatami prostaty i rozdzielić je.
  15. Aby usunąć jeden z płatów brzusznych, użyj jednego kleszczyka, aby chwycić pojedynczy płat brzuszny w pobliżu czubka, a drugi kleszcz użyj kleszczy, aby chwycić ten płat u podstawy jak najbliżej cewki moczowej. Nadal chwytając podstawę płata, użyj innych kleszczy, aby chwycić cewkę moczową. Odciągnij płat od cewki moczowej zdecydowanym, płynnym ruchem. Upewnij się, że żadna tkanka prostaty nie pozostaje przyczepiona do cewki moczowej. Umieść płat w odpowiednim podłożu, w zależności od następnego kroku doświadczalnego.
    1. Aby utrwalić i zatopić parafinę próbkę do analizy histologicznej, umieść płat w 10% neutralnie buforowanej formalinie (NBF) 8.
    2. Umieść płat w podłożu zamrażającym, takim jak OCT, w celu kriokonserwacji i podziału na sekcje 8.
    3. Umieścić płat w zimnym PBS w celu izolacji pojedynczej komórki do hodowli lub cytometrii przepływowej 9.
  16. Powtórz krok 1.15 z drugim płatem brzusznym.
  17. Aby usunąć jeden z przednich płatów, użyj kleszczy, aby delikatnie odciągnąć płat od pęcherzyka nasiennego, uważając, aby nie przebić pęcherzyka nasiennego. Gdy płat jest niezależny od pęcherzyka nasiennego, usuń go w taki sam sposób, jak płat brzuszny w kroku 1.15.
  18. Powtórz krok 1.17 z drugim płatem przednim.
  19. Odwróć pozostały układ moczowo-płciowy tak, aby widoczna była gruczoł krokowy na grzbiecie serca.
  20. Aby usunąć jeden z płatów grzbietowo-bocznych, użyj kleszczy, aby rozerwać tkankę łączną między dwoma płatami grzbietowo-bocznymi, a także tkankę łączną między płatami a tylną częścią pęcherzyków nasiennych. Usuń płat w podobny sposób, jak płat brzuszny w kroku 1.15.
  21. Powtórz krok 1.20 z drugim płatem grzbietowo-bocznym.

2. Kastracja chirurgiczna

Uwaga: Jest to operacja przetrwania, więc aseptyka, znieczulenie i leczenie bólu są ważne dla etycznego i pomyślnego zakończenia tego protokołu. Przestrzegaj wszystkich wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt w instytucjach. Podczas zabiegu chirurgicznego należy używać zewnętrznego źródła ciepła, takiego jak recyrkulacyjny koc wodny, aby zapobiec hipotermii. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne przed użyciem w chirurgii.

  1. Na czystej, sterylnej powierzchni znieczulić mysz za pomocą odpowiednich środków (np. 2% wziewnego izofluranu) i ustawić mysz w pozycji leżącej. Uwaga: Można również zastosować alternatywne metody znieczulenia, takie jak ketamina, w zależności od zatwierdzonego protokołu na zwierzętach.
  2. Sprawdź refleks myszy, ściskając palce u stóp. Jeśli mysz nie reaguje, przejdź do następnego kroku. Jeśli zareaguje, odczekaj 1-3 minuty i sprawdź ponownie. Ogol obszar operacyjny maszynką do golenia za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
  3. Aseptyczne przygotowanie brzucha myszy za pomocą naprzemiennych peelingów z 70% etanolu i jodu lub procedur zalecanych przez instytucjonalny personel weterynaryjny lub IACUC.
  4. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj pionowe nacięcie skóry o długości 1 cm w linii środkowej dolnej części brzucha, około 1,5 cm przed penisem.
  5. Wykonaj małe nacięcie (<1 cm) przez otrzewną, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów.
  6. Za pomocą sterylnych kleszczy chwyć przeciętą krawędź otrzewnej i delikatnie ją podnieś, aby móc zobaczyć jamę otrzewnej pod spodem.
  7. Za pomocą innych sterylnych kleszczy sięgnij do jamy otrzewnej i chwyć lewą lub prawą poduszkę tłuszczową jądra, bocznie do pęcherza. Przeciągnij poduszkę tłuszczową przez otwór w otrzewnej i skórze, aż jądro również wyjdzie. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych innych tkanek ani narządów podczas tego kroku.
  8. Za pomocą długopisu kauteryzacyjnego przetnij poduszeczkę tłuszczową, która trzyma jądro. Powoli przeciąć tętnicę jądra za pomocą pióra kauterycznego Uwaga: Jeśli tętnica jądra zostanie przecięta zbyt szybko, może wystąpić zbyt duże krwawienie i mysz może wymagać eutanazji.
  9. Po przecięciu poduszeczki tłuszczowej i tętnicy usuń jądro i poduszkę tłuszczową.
  10. Powtórz kroki 2.6-2.9 z drugim jądrem. Uwaga: Alternatywną metodą usunięcia jąder jest chirurgiczne podwiązanie tętnicy jądra, a następnie przecięcie naczynia nożyczkami.
  11. Zszyć otrzewną zamknąć szwem wchłanialnym.
  12. Zszyć skórę za pomocą spinek chirurgicznych.
  13. Podaj środek przeciwbólowy, aby poradzić sobie z bólem i umieść mysz w czystej klatce na podgrzewaczu na 5-10 minut. Monitoruj mysz pod kątem oznak bólu lub krwawienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie sześć płatów prostaty zostało usuniętych z myszy za pomocą mikropreparacji prostaty (Rysunek 1). Cały układ moczowo-płciowy (UGT) składa się ze wszystkich płatów prostaty, pęcherza moczowego, pęcherzyków nasiennych i cewki moczowej (ryc. 1a). Nasieniowód przyczepia się do cewki moczowej, ale nie jest potrzebny do mikrorozwarstwienia prostaty, a zatem może zostać odłączony przed usunięciem UGT poprzez przecięcie cewki moczowej (ryc. 1b-1c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrorozwarstwienie prostaty pozwala na eksperymentowanie i analizę prostaty myszy specyficzne dla płata (ryc. 1). W genetycznie modyfikowanych modelach mysich fenotypy mogą być widoczne w jednym płacie, a nie są widoczne w innych. Również w przypadku analizy histologicznej protokół ten zapewnia, że maksymalna ilość czystej tkanki prostaty może zostać pocięta i wybarwiona, bez innych tkanek dróg moczowo-płciowych obecnych w przekroju. Wreszcie, w przypadku eksperymentów z pojedynczymi komórkami, protokół...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre z rycin w tym manuskrypcie zostały hojnie dostarczone przez laboratorium Barta O. Williamsa. Autorzy są wspierani przez granty National Cancer Institute U54CA143803, CA163124, CA093900 ORAZ CA143055.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzia chirurgiczneRoboz Różne
FormaldehydSigmaF8775
OCT mediumVWR25608-930Należy umieścić na suchym lodzie do zamrożenia i przechowywać w temperaturze -80 & stopni; C
PBSLife Technologies10010
IsofluraneJohns HopkinsDostępne również u sprzedawców online
Długopis do kauteryzacjiMedlineESCT002
Szew jedwabnyAD Chirurgiczneklipsy do ran chirurgicznych M-S330R19
RobozRS-9265

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Roehrborn, C. G. Pathology of benign prostatic hyperplasia. Int J Impot Res. 20 (suppl 3), 11-18 (2008).
  3. Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. , 895238(2011).
  4. Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
  5. Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
  6. El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
  7. Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
  8. Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
  9. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
  10. Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
  11. Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
  12. Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
  13. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

prostata myszyregeneracja hormonalnaponowne wprowadzenie testosteronudroga moczowo p ciowap aty prostatyoporno na kastracjdeprywacja hormonalnatest ELISA na testosteron

Powiązane artykuły