Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53985

⸱

3 lipca 2016

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Arizona, Tucson

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Streszczenie

Komórki śródbłonka wyściełają wewnętrzną ścianę naczyń krwionośnych i odgrywają ważną rolę w regulacji napięcia naczyniowego, przepuszczalności naczyń krwionośnych i tworzenia nowych naczyń. Dysfunkcja komórek śródbłonka jest zaangażowana w rozwój i progresję wielu chorób sercowo-naczyniowych, w tym choroby niedokrwiennej serca. Aby zbadać funkcję i charakterystykę komórek śródbłonka naczyń wieńcowych, pierwszym krokiem jest izolacja komórek, która wymaga wysokiej czystości i ilości do przeprowadzenia kolejnych eksperymentów. Protokół ten opisuje skuteczną metodę izolowania dorosłych komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy. Serce myszy jest preparowane i mielone na małe kawałki. Po wytrawieniu serca za pomocą dypazy i kolagenazy II, komórki są myte i inkubowane za pomocą kulek magnetycznych, które są sprzężone z przeciwciałem anty-CD31. Koraliki z komórkami śródbłonka są kilkakrotnie myte i są gotowe do użycia w różnych zastosowaniach, w tym w obrazowaniu i eksperymentach biologii molekularnej. Wydajna izolacja daje około 104 komórek na jedno serce o czystości ponad 90%.

Wprowadzenie

Mysie modele różnych chorób sercowo-naczyniowych i zaburzeń metabolicznych wykazują zmiany fizjologiczne i molekularne, które są podobne do tych, które występują u pacjentów. Co więcej, zmiany genetyczne myszy są potężnym narzędziem, które pozwala nam badać patogenną rolę określonych genów w rozwoju i postępie chorób. W dzisiejszych czasach myszy z genami specyficznymi dla typu komórkowego są łatwo generowane w wielu laboratoriach, a pomiar poziomów mRNA i białek w określonych typach komórek jest pierwszym krokiem do ustalenia, czy myszy były naprawdę zmodyfikowane genetycznie.

Śródbłonek to cienka pojedyncza warstwa komórek śródbłonka (EC), która wyściela wewnętrzną ścianę naczyń krwionośnych. Komórki śródbłonka odgrywają kluczową rolę w regulacji napięcia naczyniowego, przepuszczalności naczyń krwionośnych i tworzenia nowych naczyńkrwionośnych 1,2. Dysfunkcja śródbłonka jest cechą charakterystyczną wielu stanów patologicznych, a zmiany w funkcji śródbłonka mogą prowadzić do różnych chorób sercowo-naczyniowych3,4. W związku z tym istotne jest badanie funkcji komórek śródbłonka w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Istnieje kilka sposobów na izolację EC5-8 i metoda izolacji musi być zoptymalizowana w zależności od tego, jakie tkanki i gatunki zostaną użyte. Dzieje się tak, ponieważ EC z różnych tkanek wykazują wysoki poziom niejednorodności w odniesieniu do ich markerów powierzchniowych i ekspresji białek9. Skuteczna izolacja komórek śródbłonka może być często trudna i wymaga pewnego stopnia szkolenia i praktyki. Po osiągnięciu tego celu metoda izolacji zaproponowana w tym protokole okazuje się stabilna i skuteczna.

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie mysich wieńcowych EC (MCEC) o wysokiej jakości i ilości. Mimo że ilość komórek pobranych z serca jest mniejsza niż komórek pobranych z innych tkanek przy użyciu innych technik, technika ta nadal zapewnia lepszą jakość. Czystość komórek śródbłonka w powstałej populacji jest większa niż 90%. Dlatego technika ta byłaby idealna do zastosowań, które opierają się na czysto izolowanych komórkach śródbłonka, takich jak obrazowanie komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Arizony i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH).

UWAGA: Sekcje 1, 2 i 3 należy wykonać dzień przed eksperymentem jako przygotowanie.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Bufor CD31 (50 ml)
    1. Dodać 50 ml 1× roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do probówki o pojemności 50 ml. Odważyć 0,05 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,037 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i dodać do probówki o pojemności 50 ml i obracać probówką przez około 1 godzinę, aż proszek się rozpuści. Doprowadzić pH do 7,4, przefiltrować przez filtr 0,2 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) z HEPES (500 ml)
    1. Dodaj 1,1915 g HEPES, aby uzyskać 10 mM HEPES w roztworze HBSS i dobrze wymieszaj. Zmierzyć pH i dostosować do 7,4. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. 1x roztwór Kreba (1 L)
    1. Dodać 100 ml 10× roztworu Kreba [Tabela 1] do podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 1 l. Odważyć 2,1 g wodorowęglanu sodu i 2 g D-glukozy i dodać do kolby. Wymieszaj i dostosuj całkowitą objętość do 1 l.
    2. Roztwór bąbelkowy z 95% gazem O2/5% CO2 przez 30 minut i roztwór filtrujący wewnątrz okapu. Przechowywać w temperaturze 4 °C i przechowywać na lodzie podczas eksperymentu.

2. Przygotowanie koralików magnetycznych

  1. Dodać 1 ml buforu CD31 do każdej probówki o pojemności 1,5 ml (jedna probówka na próbkę). Wymieszać owcze kulki IgG przeciw szczurom i dodać odpowiednią ilość do każdej próbki [Tabela 1]. Wstrząśnij energicznie probówkami 30 razy i umieść je w płycie magnetycznej na 1 minutę wstrząsania. Otwórz probówki na talerzu i wrzuć roztwory do wiadra.
  2. Dodać 1 ml buforu CD31 do każdej probówki. Dodać 2 μl szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD31 do każdej probówki i obrócić probówki O/N w temperaturze 4 °C.

3. Autoklawowanie

  1. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i końcówki do pipet. Odetnij końce końcówek pipet tak, aby były końcówki o 4 różnych średnicach, od najszerszej do najwęższej. Przybliżone średnice końcówek to odpowiednio 3 mm, 2,5 mm, 2 mm i 1,5 mm. Odetnij końcówki i przeprowadź autoklaw dzień wcześniej z 30 minutową sterylizacją w temperaturze 121 ºC.
    UWAGA: Sekcje 4 - 11 należy wykonać w dniu eksperymentu.

4. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować bufor do przemywania zawierający 2% surowicy cielęcej wzbogaconej żelazem (IFCS) w M199. Do obrazowania przygotuj 30 ml/mysz.
  2. Przygotować roztwór enzymatyczny (10 ml na próbkę). Odważyć 0,6 jednostki/ml leku Dispaza i 1 mg/ml kolagenazy typu II do probówki o pojemności 50 ml. Dodać M199 i obracać probówkę w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przefiltrować przez filtr 0,2 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml wewnątrz okapu i utrzymywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Przygotować HBSS/HEPES z heparyną. Dodać 10 ml HBSS z 10 mM HEPES do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 100 μl heparyny do probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

5. Mycie koralików

  1. Wyjąć rurki z koralikami z rotatora w temperaturze 4 ºC i przynieść, do okapu. Umieść probówki w płytce magnetycznej i potrząsaj przez 1 minutę. Zrzucić roztwór i dodać 1 ml buforu CD31 do każdej probówki.
  2. Wyjmij probówki z płytki magnetycznej i energicznie wstrząśnij 30 razy. Włóż probówki z powrotem do płytki magnetycznej i powtórz w sumie 3 prania. Po zakończeniu włóż probówki z powrotem do 4°C i obracaj je aż do użycia.

6. Sekcja

  1. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 0,1 ml heparyny, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Odczekaj 10 minut, a następnie znieczul myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 0,01 ml pentobarbitalu. Sprawdź, czy mysz odczuwa ból, ściskając stopę.
  2. Umieść mysz na styropianowej płycie głową do góry i przytrzymaj ramiona za szpilki. Użyj kleszczy i twardych nożyczek, aby przeciąć skórę w górnej części klatki piersiowej aż do gardła.
  3. Wykonaj nacięcie na środku klatki piersiowej tuż nad przeponą. Przetnij kość na boki i w górę w kierunku gardła, aby utworzyć trójkąt odsłaniający serce i płuca. Przetnij aortę tuż nad przeponą.
  4. Trzymaj grasicę kleszczami bez ciągnięcia i użyj nożyczek, aby ostrożnie przeciąć tkankę łączną, aby usunąć płuca i serce razem. Umieść chusteczki w zlewce z 1× Kreba, wstrząśnij kleszkami i przenieś do 6 cm naczynia z 1× Kreba.
  5. Usuń płaty płuc za pomocą nożyczek i kleszczy. Wprowadzić sterylny cewnik o wadze 20 G do aorty. Przepłukać krew w układzie krążenia wieńcowego za pomocą HBSS/heparyny. Wykonaj małe nacięcie w komorze, potrząśnij sercem i przenieś do probówki z próbką M199. Trzymaj probówki na lodzie.

7. Trawienie tkankowe

  1. Przełóż serce do 6 cm naczynia wypełnionego 10 ml roztworu enzymu i zmiel je na małe kawałki za pomocą nożyczek. Umieścić naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 ºC na 15 minut. Mieszaj strawione materiały, pipetując w górę i w dół 30 razy przez końcówkę z odciętym końcem, aby umożliwić łatwiejsze przejście tkanki.
  2. Umieścić go z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 ºC na kolejne 15 minut. Powtórzyć mieszanie trzy razy, za każdym razem używając końcówek pipet od największych otworów do najwęższych i 15 minut inkubacji między nimi.
  3. Po ostatnich 15 minutach inkubacji wyjąć próbki i umieścić je w kapturze. Odpipetować roztwór 30 razy w górę i w dół za pomocą końcówki pipety z najwęższym otworem i przepuścić przez sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Umyć naczynie 10 ml buforem do płukania za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść na sitko do komórek. Umieścić probówki o pojemności 50 ml w wirówce i wirować z prędkością 400 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

8. Mycie i koniugacja za pomocą koralików

  1. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dwukrotnie przemyć komórki 5 ml buforu do mycia.
  2. Weź jedną z wcześniej przygotowanych tubek o pojemności 1,5 ml z koralikami i pracuj nad jedną tubką na raz. Umieść jedną tubkę o pojemności 1,5 ml w płytce magnetycznej, wstrząśnij 3 razy i otwórz.
  3. Po ostatnim wirowaniu usuń jak najwięcej supernatantu, nie przerywając osadu. Odłącz grudki komórek, energicznie przesuwając.
  4. Dodać 1 ml buforu do przemywania do probówki o pojemności 50 ml i wymieszać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wylej roztwór z probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 1 ml zawiesiny komórek z probówki o pojemności 50 ml do kulek. Przesuń probówki 30 razy, a następnie obracaj w temperaturze 4 ºC przez 30 minut.

9. Przygotowanie do hodowli komórkowej/obrazowania

  1. Przygotuj komory do posiewania komórek. Dodać roztwór żelatyny (5% m/v, 300 μl) do studzienki komory, aby pokryć powierzchnię i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usuń żelatynę i osusz powierzchnię.
  2. Po 30 minutach obrotu wyjmij rurki z koralikami/komórkami i włóż płytkę magnetyczną do wnętrza okapu. Wstrząsać przez 2 minuty, wysypać i dodać 1 ml buforu do mycia.
  3. Wyjmij rurki z talerza, energicznie wstrząśnij 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Włóż je z powrotem do płytki magnetycznej i potrząsaj przez 1 minutę. Powtórz 4 razy, w sumie 5 prań, ale z 1 minutą potrząsania talerzem.
  4. Po ostatnim praniu wyjmij jedną tubkę i pracuj nad każdą tubką pojedynczo. Potrząśnij 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Połóż go na płycie magnetycznej i potrząsaj przez 1 minutę. Wylać i dodać 1 ml 20% pożywki IFCS EC (wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 ºC).
  5. Wstrząśnij energicznie 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Ustawić pipetę na 500 μl i pipetować w górę i w dół 10 razy. Przenieś 500 μl do każdej komory.
  6. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 ºC i pozostawić O/N. Następnego dnia umyj komórki 10% pożywką FBS EC.

10. Przygotowanie do próbek Western Blot (WB)

  1. Wyjmij probówki z koralikami/komórkami po 1 godzinie obrotu. Umieść je w płytce magnetycznej i potrząsaj przez 2 minuty. Zrzuć supernatant i dodaj 1 ml zimnego HBSS. Wstrząśnij energicznie 30 razy, a następnie przesuń 30 razy. Powtórz dwa razy przez 3 prania, ale z 1 minutą potrząsania talerzem.
  2. Po ostatnim przemyciu umieścić probówki na płytce magnetycznej i wstrząsać przez 1 min. Usunąć bufor za pomocą pipety i zdać komórki na WB metodą opisaną wcześniejw punkcie 11,12. Zebrany lizat zawiera zwykle około 30 μg białka.

11. Obrazowanie

  1. Umyć komórki 3 razy pożywką, o końcowej objętości 250 μl na komorę. Dodaj 1,5 μl Dil-acLDL do komórek. Od tego momentu utrzymuj komórki w ciemności.
  2. Inkubować przez 3,5 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać 1,5 μl Hoechst, dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć komórki PBS i utrwalić 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyć dwukrotnie PBS i zablokować 5% BSA-PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyć dwukrotnie 1% BSA-PBS. Rozcieńczyć BS-lectin-FITC za pomocą 1% BSA-PBS do stężenia 2 μg/ml i dodać 300 μl do każdej komory.
  4. Umieść komorę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze RT na 30 minut. Przemyj PBS 3 razy.
  5. Wizualizacja komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym z czasem ekspozycji 200 ms dla FITC (barwienie lektyny, marker EC, wzbudzenie/emisja 488 nm/519 nm), 30 ms dla DAPI (Hoechst, barwienie jądrowe, wzbudzenie/emisja przy 358 nm/461 nm) i 300 ms dla TRITC (barwienie acLDL, marker EC, wzbudzenie/emisja przy 557 nm/576 nm). Rób zdjęcia za pomocą obiektywu 20x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślna izolacja komórek śródbłonka wieńcowego z serca myszy zazwyczaj pozwala na uzyskanie około 104 komórek o czystości powyżej 90% i charakterystycznym brukowym kształcie. W celu uzyskania czystej populacji komórek śródbłonka, na każdym etapie protokołu należy zachować ostrożność, aby zapewnić środowisko sterylne i wolne od zanieczyszczeń. Pojawienie się w populacji komórek wydłużonych lub powiększonych wskazuje na zanieczyszczenie innymi typami komórek, takimi jak komórki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najczęściej stosowanymi komórkami śródbłonka w badaniach są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) ze względu na ich wygodę i łatwość hodowli. Jednak wiele badań wymaga dostępności modelu fizjologicznego uzyskanego poprzez izolację komórek śródbłonka z innych określonych narządów10. Komórki śródbłonka stanowią bardzo niewielką populację komórek w tkance serca; Ich izolacja i hodowla mogą okazać się bardzo trudne.

W ramach tego protokołu istnieją trzy kluczowe kroki. Pie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z National Institutes of Health (HL115578 dla A. Makino).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BSASigma A3311-10G
EDTAFisherBP120-500
HBSSFisherSH3026801
HepesSigma-AldrichH4034-500G
Wodorowęglan sodu SigmaS5761
D-(+)-Glukoza SigmaG7021-1KG
DynaBeads pan mysz Koraliki IgG Thermo Fisher Scientific11035
Szczurze przeciwciało przeciw myszom CD31BD Biosciences550274
IFCS FisherSH30072.04
M199FisherMT10060-CV
Dispase (neutralna proteaza)Worthington Biochemical Corp./FisherLS02109
Kolagenaza typu II Worthington Biochemical Corp./FisherLS004176
Glicerol FisherBP381-1
IgepalSigmaI3021-50 ml
Koktajl inhibitorów fosfatazySigmaP0044-1ml
Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340-1 ml
Heparyna SigmaH3149-100KU
FBS Fisher/MediatechMT35010CV
D-ValineSigmaV1255-5G
EGSCorning356006
Penicylina/StreptomycynaFisher/MediatechMT-30-002-CI

Bibliografia

  1. Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
  3. Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
  4. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
  5. Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
  6. Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
  7. Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
  8. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
  9. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
  10. Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
  11. Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
  12. Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

izolacja kom rekkulki magnetyczneprzeciwcia o anty CD31trawienie tkanekpo ywka dla kom rek r db onkabarwienie immunohistochemiczneczysto kom rkowarodowisko sterylneprzep ukiwanie krwi
Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.