Artykuł metodologiczny

Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami

27.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53988

⸱

30 maja 2016

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik po montażu i obsłudze mikroskopu z oświetleniem strukturalnym działającym z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF-SIM) do obrazowania dynamicznych procesów biologicznych z optyczną superrozdzielczością w wielu kolorach.

Streszczenie

Optyczne obrazowanie w superrozdzielczości z mikroskopią oświetlenia strukturalnego (SIM) jest kluczową technologią do wizualizacji procesów na poziomie molekularnym w naukach chemicznych i biomedycznych. Chociaż dostępne są komercyjne systemy SIM, systemy, które są projektowane na zamówienie w laboratorium, mogą przewyższać systemy komercyjne, przy czym te ostatnie są zwykle projektowane z myślą o łatwości obsługi i zastosowaniach ogólnych, zarówno pod względem wierności obrazu, jak i szybkości. W tym artykule przedstawiono szczegółowy przewodnik po budowie systemu SIM, który wykorzystuje oświetlenie całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) i jest w stanie obrazować z częstotliwością do 10 Hz w trzech kolorach w rozdzielczości sięgającej 100 nm. Dzięki połączeniu kart SIM i TIRF system zapewnia lepszy kontrast obrazu niż konkurencyjne technologie. Aby osiągnąć te specyfikacje, zastosowano kilka elementów optycznych, które umożliwiają automatyczną kontrolę stanu polaryzacji i struktury przestrzennej światła oświetleniowego dla wszystkich dostępnych długości fal wzbudzenia. Podano pełne informacje na temat implementacji i sterowania sprzętem w celu osiągnięcia synchronizacji między generowaniem wzoru światła wzbudzenia, długością fali, stanem polaryzacji i sterowaniem kamerą, z naciskiem na osiągnięcie maksymalnej liczby klatek na sekundę. Przedstawiono krok po kroku protokół dostrojenia i kalibracji systemu, a możliwa do osiągnięcia poprawa rozdzielczości jest weryfikowana na idealnych próbkach testowych. Zdolność do obrazowania w superrozdzielczości z szybkością wideo została zademonstrowana na żywych komórkach.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich pięciu lat mikroskopia superrozdzielcza dojrzała i przeniosła się z wyspecjalizowanych laboratoriów optycznych do rąk biologów. Dostępne są komercyjne rozwiązania mikroskopowe dla trzech głównych wariantów osiągania optycznej superrozdzielczości: mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), mikroskopii z ugaszeniem emisji stymulowanej (STED) oraz mikroskopii z oświetleniem strukturalnym (SIM)1,2. Techniki SMLM, takie jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanych cząsteczek (PALM) i stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), stały się najpopularniejszymi metodami, głównie ze względu na prostotę układu optycznego i obietnicę wysokiej rozdzielczości przestrzennej, sięgającej nawet 20 nm. Jednak mikroskopia superrozdzielcza poprzez lokalizację pojedynczych cząsteczek wiąże się z immanentnym kompromisem: osiągalna rozdzielczość przestrzenna zależy od zgromadzenia wystarczającej liczby lokalizacji poszczególnych fluoroforów, co ogranicza rozdzielczość czasową. Obrazowanie procesów dynamicznych w żywych komórkach staje się zatem problematyczne, ponieważ należy odpowiednio próbkować ruch badanej struktury, aby zapobiec artefaktom ruchowym, jednocześnie rejestrując w tym czasie wystarczającą liczbę zdarzeń lokalizacji, aby zrekonstruować obraz. Aby spełnić te wymagania, w demonstracjach SMLM na żywych komórkach uzyskano niezbędny wzrost szybkości przełączania fotochromowego fluoroforów poprzez znaczne zwiększenie mocy wzbudzenia, co z kolei prowadzi do fototoksyczności i stresu oksydacyjnego, ograniczając tym samym czas przeżycia próbek i ich znaczenie biologiczne3.

Wyraźną zaletą STED nad SIM i SMLM jest możliwość obrazowania z nadrozdzielczością w grubych próbkach; na przykład rozdzielczość boczna rzędu 60 nm została osiągnięta w organotypowych skrawkach mózgu na głębokościach do 120 µm4. Obrazowanie na tak dużych głębokościach przy użyciu implementacji SMLM lub SIM z jednym obiektywem jest niewykonalne, ale staje się możliwe dzięki mikroskopii arkuszowej światła pojedynczych cząsteczek lub mikroskopii arkuszowej światła sieciowego (lattice light sheet microscopy)5. Wykazano również możliwość stosowania STED z częstotliwością wideo i wykorzystano go do mapowania mobilności pęcherzyków synaptycznych, choć do tej pory ograniczało się to do obrazowania małych pól widzenia6.

W zastosowaniach w biologii komórki oraz w reakcjach molekularnego samoorganizowania7-12, które wymagają obrazowania z wysoką rozdzielczością czasową w wielu punktach czasowych, mikroskopia z oświetleniem strukturalnym (SIM) może być bardzo odpowiednia, ponieważ nie zależy ona od właściwości fotofizycznych konkretnej sondy fluorescencyjnej. Pomimo tej wrodzonej zalety SIM, do tej pory jej zastosowanie ograniczało się głównie do obrazowania utrwalonych komórek lub powolnych procesów. Wynika to z ograniczeń komercyjnie dostępnych systemów SIM: szybkość akwizycji klatek w tych instrumentach była ograniczona przez prędkość obrotową siatek używanych do generowania wymaganych sinusoidalnych wzorów oświetlenia, a także przez optykę utrzymującą polaryzację. Najnowsza generacja komercyjnych instrumentów SIM umożliwia szybkie obrazowanie, jednak ich cena jest zaporowa dla wszystkich poza centralnymi ośrodkami obrazowania.

Niniejszy protokół stanowi przewodnik po budowie elastycznego systemu SIM do obrazowania szybkich procesów w cienkich próbkach oraz w pobliżu powierzchni bazalnej żywych komórek. Wykorzystuje on fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do generowania wzoru oświetlenia, który wnika w próbkę na głębokość nie większą niż około 150 nm13, co znacząco redukuje sygnał tła poza ogniskiem. Idea połączenia SIM z TIRF jest niemal tak stara jak samo SIM14, lecz nie została zrealizowana eksperymentalnie przed 2006 rokiem15. Pierwsze obrazy in vivo uzyskane za pomocą TIRF-SIM zostały opisane w 2009 roku16, osiągając częstotliwość odświeżania klatek na poziomie 11 Hz w celu wizualizacji dynamiki tubuliny i kinezyny; przedstawiono również dwukolorowe systemy TIRF-SIM17,18. Niedawno zaprezentowano przewodnik po budowie i zastosowaniu jednobarwnego, dwuwiązkowego systemu SIM, charakteryzującego się częstotliwością odświeżania klatek do 18 Hz19,20.

Układ przedstawiony w niniejszej pracy umożliwia obrazowanie superrozdzielcze SIM z częstotliwością 20 Hz w trzech kolorach, z czego dwa mogą być wykorzystane w trybie TIRF-SIM. Cały system został zbudowany w oparciu o ramę mikroskopu odwróconego i wykorzystuje zmotoryzowany stół translacyjny xy ze sceną z sterowaną piezoelektrycznie. W celu generowania sinusoidalnych wzorów wzbudzenia wymaganych dla TIRF-SIM, zaprezentowany system wykorzystuje ferroelektryczny modulator światła przestrzennego (SLM). Na SLM wyświetlane są binarne wzory siatek, a powstałe rzędy dyfrakcyjne ±1 są filtrowane, przesyłane i ogniskowane w pierścieniu TIR obiektywu. Niezbędne przesunięcia fazowe i obroty siatek są realizowane poprzez zmianę wyświetlanego obrazu na SLM. Niniejszy protokół opisuje sposób budowy i wyrównania takiej ścieżki wzbudzenia, szczegółowo omawia wyrównanie ścieżki emisji oraz przedstawia próbki testowe służące do zapewnienia optymalnej kalibracji. Opisano w nim również problemy i wyzwania specyficzne dla szybkiego obrazowania TIRF-SIM w zakresie kontroli polaryzacji oraz synchronizacji komponentów.

Założenia i ograniczenia projektowe

Przed montażem systemu TIRF-SIM przedstawionego w niniejszym protokole należy rozważyć kilka ograniczeń projektowych, które determinują wybór komponentów optycznych. Wszystkie skróty dotyczące komponentów optycznych odnoszą się do Rysunku 1.

Przestrzenny modulator światła (SLM)

W tym układzie zastosowano binarny ferroelektryczny SLM, ponieważ umożliwia on przełączanie wzorów w czasie krótszym niż milisekunda. Można zastosować nematyczne SLM w skali szarości, lecz oferują one znacznie dłuższe czasy przełączania. Każdy piksel w stanie włączonym lub wyłączonym w binarnym SLM fazowym nadaje padającej płaskiej fali czołowej przesunięcie fazowe wynoszące odpowiednio π lub 0, zatem w przypadku wyświetlenia na SLM okresowego wzoru siatki, będzie on działał jako dyfrakcyjna siatka fazowa.

Całkowite wewnętrzne odbicie (TIR)

Aby uzyskać całkowite wewnętrzne odbicie (TIR) i wytworzyć pole ewanescentne, kąt padania wiązek wzbudzenia na granicy szkło-próbka musi być większy niż kąt krytyczny figure-introduction-1. Wyznacza to minimalny wymagany kąt padania, a tym samym maksymalny odstęp, czyli okres, wzoru oświetlenia ewanescentnego. Maksymalny kąt padania figure-introduction-2 (kąt akceptacji) jest ograniczony przez aperturę numeryczną (NA) obiektywu, którą można obliczyć z definicji figure-introduction-3. Określa to minimalny możliwy do uzyskania odstęp wzoru zgodnie z formułą Abbego figure-introduction-4, która wiąże NA i długość fali figure-introduction-5 z minimalnym odstępem wzoru figure-introduction-6. W praktyce obiektyw TIRF z imersją olejową o NA 1,49 zapewnia maksymalny kąt padania wynoszący około 79° i minimalny okres wzoru na próbce wynoszący 164 nm przy zastosowaniu długości fali wzbudzenia 488 nm. Te dwa kąty definiują pierścień w tylnej aperturze obiektywu, w obrębie którego instrument uzyskuje oświetlenie TIR (tj. pierścień TIR), a w którym dwie ogniska wzbudzenia muszą być dokładnie rozmieszczone i precyzyjnie obracane w celu wygenerowania każdego wzoru oświetlenia.

Rekonstrukcja obrazów TIRF-SIM wymaga pozyskania minimum trzech przesunięć fazowych na każdy obrót wzoru, dlatego okres wzoru SLM musi być podzielny przez 3 (patrz Rycina 1). Na przykład okres wynoszący 9 pikseli dla oświetlenia 488 nm oraz 12 pikseli dla oświetlenia 640 nm. Kompleksową dyskusję na temat projektowania wzorów SLM, w tym optymalizacji odstępów wzorów w skali subpikselowej z wykorzystaniem siatek ścinanych, przedstawiono w poprzednich pracach Kner et al.16 oraz Lu-Walther et al.20 Położenie dwóch ognisk wzbudzenia musi znajdować się wewnątrz pierścienia TIR dla wszystkich długości fal, jednak kąt dyfrakcji dla rzędów ±1 z SLM jest zależny od długości fali. W przypadku standardowego SIM obrazowanie wielokolorowe można osiągnąć poprzez optymalizację okresu siatki dla najdłuższej długości fali, akceptując spadek wydajności w kanałach o krótszych długościach fal. Jednak w przypadku TIRF-SIM optymalizacja dla jednej długości fali sprawia, że ogniska dla pozostałych długości fal nie znajdują się już wewnątrz pierścienia TIR. Na przykład zastosowanie okresu siatki wynoszącego 9 pikseli jest wystarczające do zapewnienia TIRF dla 488 nm, ponieważ ogniska znajdują się na poziomie 95% średnicy tylnej apertury i wewnątrz pierścienia TIR, ale dla 640 nm taki okres spowodowałby umieszczenie ognisk poza aperturą. Z tego powodu dla każdej długości fali wzbudzenia należy stosować różne odstępy wzorów pikselowych.

Ustawienie ścieżki wzbudzenia TIRF-SIM jest niezwykle wrażliwe na niewielkie zmiany pozycji lustra dichroicznego (DM4 na Rys. 1) w korpusie mikroskopu, znacznie bardziej niż w konwencjonalnym SIM. Nie zaleca się stosowania obrotowej wieżyczki z kostkami filtrów; zamiast tego należy użyć pojedynczego, wielopasmowego lustra dichroicznego, które znajduje się w stałej pozycji i jest zaprojektowane specjalnie dla stosowanych długości fal wzbudzenia. Niezbędne jest stosowanie wyłącznie najwyższej jakości luster dichroicznych. Wymagają one grubych podłoży o grubości co najmniej 3 mm i są często określane przez producentów jako „imaging flat”. Wszystkie pozostałe podłoża prowadzą do niedopuszczalnej aberracji i degradacji obrazu w TIRF-SIM.

Kontrola polaryzacji

Aby uzyskać TIRF-SIM, niezbędne jest obracanie stanu polaryzacji światła wzbudzenia w synchronizacji ze wzorem oświetlenia w taki sposób, aby pozostawało ono spolaryzowane azymutalnie w płaszczyźnie źrenicy obiektywu względem osi optycznej (t.j. spolaryzowane s). Ustawienie optyki sterującej polaryzacją zależy od zastosowanego konkretnego elementu optycznego, na przykład komórki Pockelsa21 lub płytki ćwierćfalowej w zmotoryzowanym stole obrotowym22. W niniejszym protokole zastosowano niestandardowy ciekłokrystaliczny zmienny opóźniacz (LCVR), zaprojektowany tak, aby zapewnić opóźnienie pełnofalowe (2π) w zakresie długości fal od 488 do 640 nm, co umożliwia szybkie przełączanie (~msek). W przypadku stosowania opóźniacza ciekłokrystalicznego niezbędne jest użycie komponentu wysokiej jakości: standardowe komponenty zazwyczaj nie są wystarczająco stabilne, aby zapewnić stałe opóźnienie przez cały czas naświetlania kamery, co prowadzi do rozmycia wzoru oświetlenia i niskiego kontrastu modulacji. Opóźniacze ciekłokrystaliczne są również silnie zależne od temperatury i wymagają wbudowanej kontroli temperatury.

Synchronizacja

Lasery muszą być zsynchronizowane z SLM. Binarne ferroelektryczne SLM są wewnętrznie równoważone poprzez przełączanie między stanem włączonym (on) a stanem wyłączonym (off). Piksele działają jako płytki ćwierćfalowe wyłącznie w stanie włączonym lub wyłączonym, a nie w czasie przełączania między klatkami. W związku z tym lasery powinny być włączane tylko w stanach on/off za pomocą sygnału LED Enable z SLM, aby zapobiec spadkowi kontrastu wzorca wynikającemu ze stanu pośredniego pikseli. Alternatywnie, jeśli lasery nie mogą być modulowane cyfrowo, jako szybka migawka może zostać zastosowany modulator akustyczno-optyczny (AOM).

Wybór obiektywów

Na podstawie tych ograniczeń można określić wymaganą demagnifikację płaszczyzny SLM na płaszczyznę próbki w celu wytworzenia pożądanych wzorów oświetlenia. Pozwala to na obliczenie ogniskowych dwóch soczewek L3 i L4 w teleskopie przekaźnikowym obrazu oraz soczewki kondensatora wzbudzenia L5. W tym układzie przy wzbudzeniu 488 nm i 640 nm zastosowano obiektyw imersyjny olejowy 100X/1.49NA, zatem użyto ogniskowych 300 mm i 140 mm dla L4 i L3 oraz 300 mm dla L5, co daje całkowitą demagnifikację 357X, odpowiadającą rozmiarowi piksela SLM wynoszącemu 38 nm w płaszczyźnie próbki. Przy zastosowaniu tej kombinacji soczewek okresy siatki SLM wynoszące 9 pikseli dla oświetlenia 488 nm i 12 pikseli dla 640 nm dają odstępy wzorów 172 nm i 229 nm w próbce, co odpowiada kątom padania odpowiednio 70° i 67°. Dla granicy szkło-woda kąt krytyczny wynosi 61° i jest niezależny od długości fali, zatem te dwa odstępy wzorów umożliwiają wzbudzenie TIRF dla obu długości fal. Obiektyw wyposażony w pierścień korekcyjny jest użyteczny do korekcji aberracji sferycznych wprowadzanych przez różnice w grubości szkiełka podstawowego lub w przypadku pracy w temperaturze 37 °C.

Rekonstrukcja obrazu

Po pozyskaniu surowych danych SIM, wygenerowanie obrazów o superrozdzielczości odbywa się w dwuetapowym procesie obliczeniowym. Po pierwsze, dla każdego obrazu należy wyznaczyć wzór oświetlenia, a po drugie, komponenty widma SIM muszą zostać oddzielone i odpowiednio ponownie połączone, aby podwoić efektywny zakres OTF (patrz Rysunek 6, wstawki).

Precyzyjna wiedza na temat projektowanych wzorów oświetlenia jest kluczowa, ponieważ superrozdzielcze składowe częstotliwości muszą zostać rozdzielone jak najdokładniej, aby zapobiec powstawaniu artefaktów spowodowanych pozostałościami nakładających się składowych. Parametry wzoru oświetlenia wyznaczamy a posteriori z surowych danych obrazowych zgodnie z procedurą wprowadzoną przez Gustafssona et al.23 W skrócie, dla każdego z figure-introduction-7 wzorów wzbudzenia figure-introduction-8 należy znaleźć zestaw parametrów oświetlenia opisujący znormalizowaną dwuwymiarową sinusoidę:

figure-introduction-9

Powyższe figure-introduction-10 oraz figure-introduction-11 opisują odpowiednio kontrast prążków i początkową fazę wzoru dla każdego poszczególnego obrazu m. Składowe wektora falowego, figure-introduction-12 i figure-introduction-13, zmieniają się jedynie przy różnych orientacjach figure-introduction-14 wzoru i można założyć, że w pozostałych przypadkach są stałe. Aby wstępnie wyznaczyć składowe wektora falowego, wykonuje się korelację wzajemną widm obrazów surowych, którą następnie doprecyzowuje się poprzez zastosowanie przesunięć subpikselowych dla jednego z korelujących obrazów w celu optymalizacji pokrycia. Odbywa się to poprzez mnożenie gradientów fazy w przestrzeni rzeczywistej figure-introduction-15, które indukują przesunięcie subpikselowe w przestrzeni częstotliwości. Należy zauważyć, że przed właściwym wyznaczeniem wzoru użyteczne jest posiadanie dobrego oszacowania wektorów falowych, co można osiągnąć poprzez obrazowanie warstwy kulek fluorescencyjnych.

Ponieważ krok fazowy między przesuniętymi wzorami wynosi figure-introduction-16, t.j. figure-introduction-17, rozdzielenie składowych częstotliwości można przeprowadzić za pomocą transformaty Fouriera wzdłuż „osi fazy”. Globalną fazę figure-introduction-18 oraz kontrast prążków figure-introduction-19 można następnie wyznaczyć, stosując zespoloną regresję liniową różnych składowych. Indywidualnie rozdzielone składowe są następnie łączone przy użyciu uogólnionego filtru Wienera. Szczegółowy opis zarówno ekstrakcji parametrów, jak i implementacji uogólnionego filtru Wienera odsyłamy do pracy Gustafsson et al.23, w której zastosowano ten sam algorytm.

Protokół

1. Układanie i wyrównywanie ścieżki wzbudzenia

  1. Zaznacz położenie elementów na stole optycznym (patrz Rysunek 1, aby zapoznać się z ponadview konfiguracji optycznej). Oddziel obiektyw, soczewki L3, L4, L5 i SLM przez sumę ich odpowiednich ogniskowych tak, aby powierzchnia SLM została przekazana na płaszczyznę ogniskowej obiektywu.
  2. Włóż wielokrawędziowe zwierciadło dichroiczne DM4 do wieżyczki kostki filtracyjnej ramy mikroskopu.
  3. Włóż drugie zwierciadło dichroiczne DM3 do kwadratowego mocowania lustra kinetycznego 1" i ustaw je o jedną ogniskową od soczewki kondensatora L5.
    Uwaga: Ta konstrukcja ścieżki wzbudzenia obejmuje dwa identyczne zwierciadła dichroiczne DM3 i DM4, które są pobierane z tej samej partii produkcyjnej, aby zapewnić identyczne właściwości optyczne. Lustro dichroiczne (DM4) jest ustawione w taki sposób, że osie s i p są zamienione w porównaniu z dichroicznym znajdującym się w mikroskopie (DM3), niwelując w ten sposób eliptyczność polaryzacji wprowadzoną przez jego dwójłomność (ryc. 1). Kompensacja ta działa równie dobrze dla każdej długości fali oświetlenia. Ten krok jest niezbędny do utrzymania wysokiego kontrastu modulacji.
  4. Przed włożeniem jakichkolwiek soczewek do ścieżki wzbudzenia należy dokładnie zdefiniować oś optyczną systemu.
    1. Zdejmij soczewkę obiektywu (OB) z głowicy rewolwerowej i zamiast tego wkręć narzędzie do wyrównywania. Składa się on z systemu klatek optycznych o długości 500 mm z dwoma tarczami wyrównującymi na obu końcach.
    2. Użyj zwierciadła dichroicznego DM3 i tymczasowego lustra wyrównującego umieszczonego w przybliżonym późniejszym położeniu SLM, aby skierować skolimowaną wiązkę odniesienia z lasera 1 przez środek otworów w dwóch tarczach wyrównujących. Skieruj wiązkę z lasera 1 do tymczasowego zwierciadła, jak pokazano na rysunku 1, za pomocą trzech luster i zwierciadła dichroicznego DM2. Zwierciadło tymczasowe w położeniu SLM musi być prawie prostopadłe do osi optycznej.
      Uwaga: Użyj Lasera 1 jako wiązki odniesienia, ponieważ inne lasery można następnie wyrównać po ustaleniu ścieżki wzbudzenia.
    3. Wyjmij narzędzie do wyrównywania po określeniu zgrubnej osi optycznej. Umieść tęczówkę na ścieżce wiązki, zanim wejdzie ona do korpusu mikroskopu i wyśrodkuj ją na belce. Dołącz kawałek białej karty z małym otworem wyśrodkowanym na tęczówce. Włóż ponownie soczewkę obiektywu (OB).
      Uwaga: Wiązka wychodząca z obiektywu będzie teraz bardzo rozbieżna, ale będzie bardzo słabe odbicie od tylnej powierzchni soczewki, które będzie widoczne na białej karcie. Wszystkie soczewki, nawet jeśli są pokryte powłoką antyrefleksyjną, będą miały słabe odbicia wsteczne, które można wykorzystać do zapewnienia wyrównania współosiowego. Jeśli wiązka jest dokładnie prostopadła do soczewki, to odbicie wsteczne przejdzie z powrotem przez środek tęczówki
    4. Wykonaj iteracyjne korekty kątowe dwóch luster (DM3 i lustro wyrównujące w pozycji SLM), aby wyśrodkować odbicie wsteczne na karcie z nadchodzącą wiązką. Tymczasowo zdejmij soczewkę obiektywu (OB) i zaznacz plamkę lasera na suficie, aby utworzyć pozycję odniesienia.
    5. Wstaw parę tęczówek na wysokości belki odniesienia wzdłuż gwintowanych otworów stołu. Wiązka powinna być równoległa do powierzchni stołu optycznego. Oś optyczna jest teraz zdefiniowana.
  5. Włóż soczewkę kondensora (L5) mniej więcej o jedną ogniskową od obiektywu. Zamontuj tę soczewkę na stoliku z translacją liniową ustawioną tak, aby przesuwała się wzdłuż kierunku wiązki odniesienia.
  6. Dostosuj położenie i kąt soczewki kondensora tak, aby wiązka wychodząca z obiektywu była skolimowana i uderzała w punkt odniesienia na suficie. Sprawdź, czy obiektyw jest prostopadły do wiązki, ponownie sprawdzając odbicie wsteczne za pomocą przysłony i białej karty. Zdejmij soczewkę obiektywu (OB) i włóż drugą soczewkę teleskopu przekaźnikowego obrazu (L4).
    Uwaga: Zapewnienie prawidłowej kolimacji i braku odchyleń wiązki jest łatwiejsze, gdy na ścieżce wiązki znajduje się parzysta liczba soczewek.
  7. Dostosuj położenie i kąt tej soczewki za pomocą liniowego stolika translacyjnego, aby utrzymać kolimację i upewnić się, że wiązka referencyjna nadal uderza w zaznaczone miejsce na suficie.
  8. Wymień soczewkę obiektywu (OB) i włóż pierwszą soczewkę teleskopu (L3). Dostosuj położenie i kąt tej soczewki, aby zapewnić kolimację i brak ugięcia, zgodnie z opisem w poprzednich krokach.
  9. Zamontuj układ SLM na uchwycie gimbala, który zapewnia obrót bez translacji wokół środka powierzchni chipa.
    Uwaga: Konkretna konstrukcja montażowa zależy od zastosowanego SLM. Jeśli SLM jest dostarczany bez mocowania, należy go przymocować do niestandardowej aluminiowej płyty, która jest następnie przymocowana do mocowania gimbala obiektywu.
  10. Po wyrównaniu soczewek włóż SLM w miejsce lustra. Dostosuj położenie SLM tak, aby wiązka referencyjna znajdowała się w środku układu SLM i wyreguluj kąt tak, aby wiązka przechodziła przez dwie soczewki przekaźnikowe (L3 i L4). Sprawdź, czy belka referencyjna jest nadal wyśrodkowana w zaznaczonym miejscu.
  11. Rozpręż i skolimuj wiązkę odniesienia za pomocą ekspandera wiązki keplerowskiej.
    1. Zamontuj dwa obiektywy (L1 i L2) w systemie klatkowym, aby ułatwić regulację.
    2. Wyśrodkuj system koszykowy na wiązce odniesienia, wyjmując soczewki i zastępując je tęczówkami.
    3. Włóż dwie soczewki i wyreguluj położenie osiowe L2, aby skolimować rozszerzoną wiązkę za pomocą interferometru ścinającego. L2 powinno znajdować się w odległości jednej ogniskowej od powierzchni SLM.
    4. Sprawdź, czy rozszerzona wiązka jest nadal skolimowana za dwiema soczewkami przekaźnikowymi L3 i L4. Użyj interferometru ścinającego tuż za DM3, aby sprawdzić kolimację.
  12. Po wyrównaniu ścieżki wzbudzenia dla jednej długości fali, połącz pozostałe dwa lasery ze ścieżką wiązki. Skieruj każdą wiązkę przez dwie tęczówki wyśrodkowane na ścieżce wzbudzenia za pomocą wiązki łączącej zwierciadła dichroiczne (DM1 i DM2).

2. Wyrównanie rotatora polaryzacji

  1. Zamontuj LCVR z jego szybką osią pod kątem 45° do padającej polaryzacji.
  2. Dostosuj kąt polaryzacji wiązki padającej na LCVR za pomocą achromatycznej płytki półfalowej (HWP), umieszczając HWP i LCVR między skrzyżowanymi polaryzatorami. Obróć HWP, aby zminimalizować przesyłaną moc.
    Uwaga: Aby działać jako rotator o zmiennej polaryzacji, szybka oś opóźniacza ciekłokrystalicznego (LCVR) musi być precyzyjnie ustawiona pod kątem 45° do padającej polaryzacji wiązki pionowej. LCVR jest fizycznie zamontowany pod kątem 45°, ale jest to tylko zgrubne ustawienie. HWP służy do zapewnienia idealnego wyrównania polaryzacji padającej pod kątem 45° względem szybkiej osi LCVR. Płyta ćwierćfalowa (QWP) przekształca nachyloną polaryzację eliptyczną indukowaną przez LCVR z powrotem na polaryzację liniową pod kątem kontrolowanym przez przyłożone napięcie24.
  3. Włóż QWP za LCVR i obróć go, aby wyrównać jego powolną oś z przychodzącą polaryzacją, minimalizując przesyłaną moc między skrzyżowanymi polaryzatorami.

3. Wyrównanie ścieżki emisji

  1. Zgrubnie ustaw kamerę za pomocą szkiełka mikrometrycznego stage i światła przechodzącego.
    1. Ustaw ostrość na siatce celowniczej za pomocą okularów mikroskopu i ustaw soczewkę obiektywu w tej pozycji.
    2. Z grubsza wyśrodkuj kamerę i przesuń pozycję kamery, aby ustawić ostrość obrazu siatki, obserwując obraz na ekranie.
      Uwaga: Jeśli używane jest zewnętrzne koło filtrów, wówczas kostka filtra nie będzie zawierała filtra emisyjnego, dlatego okularów nie wolno używać, gdy lasery są włączone.
  2. Dokładnie wyreguluj pozycję aparatu za pomocą próbki koralików fluorescencyjnych.
    1. Przygotuj monowarstwę koralików fluorescencyjnych, rozprowadzając kroplę wielokolorowych koralików o długości 100 nm na szkle nakrywkowym #1.5. Pozostaw do wyschnięcia, aby zaadsorbować koraliki do szkła nakrywkowego, a następnie ponownie zanurz w wodzie.
    2. Umieść próbkę koralików na obiektywie za pomocą olejku immersyjnego. Precyzyjnie dostosuj położenie aparatu tak, aby warstwa koralików fluorescencyjnych była ostra. Nie reguluj pozycji soczewki obiektywu po znalezieniu ostrości.
      Uwaga: Ponieważ SLM musi znajdować się w płaszczyźnie sprzężonej z płaszczyzną próbki, pozycja SLM, soczewek przekaźnikowych i obiektywu musi być ustalona. Aby wyregulować ostrość, przesuń próbkę osiowo, a nie obiektyw, za pomocą piezoelektrycznego stolika w osi Z.
  3. Wygeneruj odpowiednie wzorce siatki binarnej SIM jako pliki bitmapowe.
    1. W przypadku 2D/TIRF-SIM wygeneruj serię 9 binarnych obrazów siatki: 3 orientacje wzoru, każda z 3 równomiernie rozmieszczonymi przesunięciami fazowymi. Wygeneruj je numerycznie (na przykład za pomocą MATLAB) z obróconej sinusoidy 2D z zastosowanym przesunięciem fazowym, a następnie progowaniem, aby uzyskać obraz binarny. Zobacz Pliki kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładowym kodem.
    2. W celu wyrównania wygeneruj również wzory siatki, które zostały oknierane przez mały okrągły otwór dla każdej z 3 orientacji, jak pokazano na rysunku 2. Kraty wyrównujące w oknach nie muszą być uruchamiane zewnętrznie, ale mogą być ręcznie przełączane przez użytkownika za pomocą oprogramowania SLM.
      Uwaga: Zapoznaj się z referencjami, aby zapoznać się z omówieniem optymalnych kątów obrotu i przykładem kodu generowania wzoru siatki 16,20.
  4. Prześlij obrazy bitmapowe do SLM za pomocą oprogramowania producenta (na przykład MetroCon).
    1. Załaduj oprogramowanie sterujące SLM i kliknij "Połącz".
    2. W zakładce "Repertuar" kliknij "Załaduj", aby otworzyć plik z repertuarem i sprawdzić liczbę Bieżących Zamówień zawartych w pliku. W podanym przykładowym pliku z repertuarem znajduje się pięć rozkazów uruchomienia.
    3. Kliknij "Wyślij na tablicę", aby przesłać plik z repertuarem do SLM.
    4. Poczekaj na przesłanie obrazów bitmapowych i automatyczne ponowne uruchomienie urządzenia.
      Uwaga: Przykładowy plik repertuaru, który zawiera obrazy bitmapowe z siatką oraz plik definiujący kolejność, jest dołączony jako plik kodu uzupełniającego. Plik ".repz" można otworzyć za pomocą archiwizatora plików ZIP.
  5. Wyświetlić siatkę wyrównującą w oknie na SLM dla pierwszej orientacji (na przykład 0°).
    1. W oprogramowaniu sterującym SLM należy wybrać zakładkę "Status", wpisać numer Zlecenia Uruchomienia (w przypadku przykładowego pliku jest to Zlecenie Uruchomienia "1").
    2. Kliknij "Wybierz", aby zmienić kolejność jazdy na kratę wyrównującą.
      Uwaga: Spowoduje to oświetlenie małego okrągłego obszaru na płaszczyźnie próbki. Jeśli powierzchnia SLM jest prawidłowo sprzężona z płaszczyzną próbki, krawędzie tego obszaru będą ostro ostre. Wzór siatki wytworzy wiele rzędów dyfrakcyjnych w ognisku L3: odbicie zerowego rzędu od odblaskowej płyty tylnej SLM, rzędy -1 i +1 odpowiadające siatce, a także słabsze wyższe rzędy, które wynikają z dyfrakcji elementów wewnętrznych specyficznych dla urządzenia SLM (np. odbicia wewnętrznych przewodów pikseli SLM i nieregularności na krawędziach pikseli). Wszystkie zlecenia z wyjątkiem -1 i +1 muszą zostać odfiltrowane.
  6. Włóż maskę przestrzenną (SM) zamontowaną w stoliku x,y do toru wiązki w pozycji ogniskowej L3 i przesuń jej położenie względem osi optycznej tak, aby przekazywane były tylko pożądane pierwsze zamówienia. Bezpośrednio za filtrem przestrzennym widoczne będą tylko dwie okrągłe belki.
    Uwaga: Maska przestrzenna jest wytwarzana przez wybicie 6 otworów w folii aluminiowej za pomocą igły. Otwory powinny być wystarczająco duże, aby przepuszczać wiązki pierwszego rzędu dla wszystkich długości fal lasera. Szczegółowa analiza maski przestrzennej znajduje się w odnośniku20.
  7. Wyświetl następną orientację siatki wyrównującej (60°, kolejność pracy 2) i ponownie upewnij się, że tylko pierwsze rzędy są przepuszczane przez maskę przestrzenną, dostosowując jej położenie w razie potrzeby.
  8. Powtórz dla końcowej orientacji (120°, kolejność jazdy 3).
  9. Sprawdź obraz warstwy koralików fluorescencyjnych w aparacie. Jeśli dwie okrągłe wiązki nie nakładają się na siebie, jak pokazano na rysunku 2, zmień położenie płaszczyzny próbki, iteracyjnie dostosowując soczewkę obiektywu i położenie kamery.
  10. Dostosuj położenie obiektywu tak, aby nakładało się na dwie wiązki, co spowoduje utratę ostrości obrazu. Zmień położenie aparatu, aby przywrócić ostrość obrazu i dostroić obiektyw w przypadku, gdy dwa okręgi są nadal widoczne. Powtarzaj ten proces, aż dwie wiązki nałożą się na siebie i pojedynczy okrągły obszar będzie ostry.
  11. Po ustawieniu położenia płaszczyzny próbki utrzymuj stałą pozycję obiektywu.
  12. Aby potwierdzić oświetlenie TIRF, zobrazuj roztwór barwnika fluorescencyjnego, na przykład dla długości fali wzbudzenia 488 nm użyj roztworu 10 μM rodaminy 6G.
    1. Ustawić ostrość próbki barwnika. Jeśli dwie wiązki padną pod odpowiednim kątem TIRF, pojedyncze cząsteczki będą widoczne bez wysokiego tła, a krawędzie okrągłej apertury będą ostre. Patrz rysunek 2B-D, aby zapoznać się z przykładami wyrównanych i niewspółosiowych belek TIRF.
    2. Wyświetlić po kolei każdą orientację krat z oknami i upewnić się, że wszystkie trzy orientacje zapewniają oświetlenie TIRF i że dwie wiązki zachodzą na siebie w płaszczyźnie próbki. Precyzyjna regulacja położenia belek może być dokonana poprzez regulację lustra dichroicznego DM3.
      Uwaga: Chociaż różne długości fal są skupiane w nieco innych pozycjach z powodu osiowej aberracji chromatycznej, nie jest to krytyczne i można je skorygować, stosując stałe przesunięcie z do pozycji próbki przed wzbudzeniem drugą długością fali.

4. Synchronizacja i kalibracja systemu

  1. Umieść próbkę jednowarstwowej kulki na obiektywie i ustaw ostrość.
  2. Zaprogramuj SLM za pomocą oprogramowania sterującego, aby wyświetlać każdy z 3 obrazów przesunięcia fazowego po kolei, dla pierwszej orientacji wzoru (0°).
    1. Korzystając z oprogramowania sterującego SLM, przełącz się na Kolejność biegu 4 przykładowego repertuaru.
    2. Skonfiguruj kamerę za pomocą oprogramowania do akwizycji (na przykład HCImage), aby wyprowadzać dwa sygnały: jeden dodatni i jeden ujemny sygnał wyzwalający TTL podczas globalnego okresu ekspozycji. W oprogramowaniu aparatu, w sekcji "Zaawansowane właściwości aparatu", ustaw Rodzaj wyzwalania wyjścia 1 i 2 na "Ekspozycja", a Polaryzacja wyzwalacza wyjściowego 1 i 2 odpowiednio na "Dodatnia" i "Ujemna".
    3. Podłącz wyjścia 1 i 2 kamery odpowiednio do wejść "Trigger" i "Finish" SLM za pomocą koncentrycznych. SLM jest teraz zsynchronizowany z kamerą.
  3. Zdobądź serię 3 obrazów.
    1. W okienku "Sekwencja" wybierz "Hard Disk Record" jako typ skanowania i ustaw liczbę klatek na 3.
    2. Kliknij "Start", aby uzyskać 3 ramki. Wzór SLM będzie się zmieniał przy każdej ekspozycji. Koraliki fluorescencyjne na obrazie będą migać i wyłączać się między każdym z 3 obrazów. Ilość mrugania jest odczytana z kontrastu modulacji sinusoidalnego wzoru oświetlenia.
  4. Obróć polaryzację lasera wzbudzającego za pomocą LCVR za pomocą niestandardowego oprogramowania, aby uzyskać polaryzację azymutalną, a tym samym najwyższy kontrast modulacji dla danej orientacji wzoru.
    1. Załaduj oprogramowanie do kalibracji LCVR.
    2. Wprowadź 0 i 8 odpowiednio dla minimalnego i maksymalnego napięcia.
    3. Kliknij "Sweep LCVR Voltage", aby obrócić polaryzację.
      Uwaga: Opóźnienie LCVR jest funkcją temperatury i może dryfować z dnia na dzień, nawet przy kontroli temperatury. Na tym etapie optymalną polaryzację azymutalną stwierdza się empirycznie, przesuwając przyłożone napięcie między jego minimalnym a maksymalnym napięciem, co powoduje obracanie polaryzacji padającej na próbkę. Kontrast modulacji jest obliczany dla każdego napięcia25, a napięcie, które osiąga kontrast szczytowy, jest używane w kolejnych krokach.
    4. Poczekaj na zakończenie procesu kalibracji i zanotuj zmierzoną objętośćtage.
  5. Powtórz ten proces kalibracji dla pozostałych dwóch orientacji wzoru (60° i 120°) i każdej z długości fali wzbudzenia.
  6. Zsynchronizuj ekspozycję kamery z LCVR, laserami, kołem filtrów emisyjnych i piezoelektrycznym stolikiem z26. Aby to osiągnąć, należy użyć płytki szybkiego akwizycji danych (DAQ) jako głównego źródła zegara systemu i użyć sygnału wyjściowego LED Enable SLM do modulacji laserów (patrz rysunek 3B).
    Uwaga: Konkretna implementacja zależy od użytych komponentów, ale zalecane jest użycie szybkiej płytki DAQ do cyfrowej synchronizacji wyzwalaczy i sterowania LCVR za pomocą napięcia analogowego, sterowanego za pomocą oprogramowania. Oprogramowanie sterujące używane w tym protokole jest dostępne na żądanie.
  7. Ze względu na osiową aberrację chromatyczną, dla każdej długości fali należy również zastosować przesunięcie z do stolika próbki.
    1. Określić przesunięcie eksperymentalnie, skupiając się na próbce jednowarstwowej wielokolorowych kulek na pierwszej długości fali (np. 488 nm), a następnie przełączając się na drugą (np. 640 nm). Koraliki będą teraz nieostre.
    2. Ponownie ustaw ostrość ściegów i zmierz potrzebną zmianę pozycji z. To przesunięcie można następnie zastosować do piezoelektrycznego stopnia z za każdym razem, gdy zmienia się długość fali wzbudzenia.
  8. Korzystając z oprogramowania sterującego SLM, przełącz kolejność działania SLM na pełną serię 9 binarnych obrazów siatek wymaganych dla TIRF-SIM. Jest to Kolejność biegowa 0 w przykładowym repertuarze.
  9. Za pomocą oprogramowania sterującego kamerą uzyskaj 9 obrazów próbki ściegu.
    1. W okienku "Sekwencja" w oprogramowaniu aparatu wybierz "Hard Disk Record" (Nagrywanie dysku twardego) jako typ skanowania i zmień liczbę klatek na 9.
    2. Kliknij "Start", aby pobrać obrazy.
    3. Zapisz pozyskane obrazy jako pliki TIFF, wybierając "TIFF" jako typ obrazu w oknie "Zapisz zbuforowane obrazy" i klikając OK.
  10. Rekonstrukcja obrazu o wysokiej rozdzielczości na podstawie nieprzetworzonych obrazów TIFF przy użyciu komercyjnego lub niestandardowego oprogramowania w celu sprawdzenia poprawy rozdzielczości w porównaniu ze standardowym formatem TIRF.
    Uwaga: W naszym mikroskopie używamy niestandardowego kodu rekonstrukcyjnego opracowanego zarówno wewnętrznie, jak i przez dr Lin Shao27.

Wyniki

Wielokolorowe koraliki fluorescencyjne o średnicy 100 nm obrazowano w celu porównania standardowej metody TIRF z TIRF-SIM oraz ilościowego określenia osiągalnej poprawy rozdzielczości bocznej (Rysunek 4A-B). Rekonstrukcja surowych klatek w obrazy o wysokiej rozdzielczości została przeprowadzona przy użyciu standardowych algorytmów opisanych w literaturze27,28. Widać wyraźnie, że TIRF-SIM charakteryzuje się znacznie wyższą rozdzielczością boczną w porównaniu do TIRF. Funkcję rozproszenia punktu (PSF) mikroskopu można dobrze przybliżyć obrazem pojedynczego koralika fluorescencyjnego o rozmiarze subdyfrakcyjnym, dlatego PSF i rozdzielczość można określić ilościowo poprzez dopasowanie funkcji Gaussa 2D do poszczególnych koralików dla każdej długości fali. Szacowana rozdzielczość mikroskopu na podstawie średniej wartości pełnej szerokości w połowie maksimum (FWHM) wynosi odpowiednio 89 nm i 116 nm dla TIRF-SIM przy 488 i 640 nm (Rysunek 4C). Odpowiada to dwukrotnej poprawie rozdzielczości bocznej dla obu długości fal w porównaniu z teoretycznym przypadkiem ograniczonym dyfrakcją. Fluorescencyjnie znakowane włókna amyloidowe stanowią również doskonałą próbkę testową do zademonstrowania podwojonej rozdzielczości (Rysunek 4D). Włókna amyloidowe utworzono in vitro poprzez inkubację β-amyloidu znakowanego 10% pochodnymi barwników rodamynowych (pobudzenie 488 nm) przez 1 tydzień, a następnie obrazowanie metodą TIRF-SIM. Więcej informacji znajduje się w referencji12.

Struktury subkomórkowe o wysokim kontraście, takie jak mikrotubule znakowane emGFP (Rysunek 5B, G) lub LifeAct-GFP (Rysunek 5D), są idealne do obrazowania TIRF-SIM i pozwalają na uzyskanie obrazów superrozdzielczych o wysokim kontraście. Obrazowanie TIRF-SIM z wykorzystaniem układu opisanego w niniejszym protokole umożliwia obserwację subpopulacji mikrotubul zlokalizowanych w sąsiedztwie podstawnej kory komórkowej, a polimeryzacja i depolimeryzacja mikrotubul mogą być obserwowane w czasie (Animowany Rysunek 1). Nie wszystkie próbki nadają się do obrazowania TIRF-SIM, w szczególności próbki o niskim kontraście bez dyskretnych struktur. Komórki wykazujące ekspresję cytozolowego GFP nie dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości poza krawędziami błony plazmatycznej (Rysunek 5F, H oraz Animowany Rysunek 2) i są zatem suboptymalne do obrazowania TIRF-SIM, ponieważ wynikowe rekonstrukcje są w zasadzie obrazami TIRF z nałożonymi artefaktami. W takich próbkach wzrost kontrastu często można przypisać etapowi dekonwolucji algorytmu rekonstrukcji.

Wysoki kontrast modulacji jest niezbędny do pomyślnego obrazowania SIM. Transformata Fouriera zrekonstruowanego obrazu umożliwia wizualizację funkcji przenoszenia optycznego (OTF) SIM (Rysunek 6A, wstawka). Bez maksymalizacji kontrastu modulacji dla każdej orientacji poprzez zapewnienie polaryzacji azymutalnej za pomocą rotatora polaryzacji, modulacja informacji o wysokiej rozdzielczości w próbce jest bardzo mała, co prowadzi do niskiego stosunku sygnału do szumu w pasmach przepustowych SIM. Algorytmy rekonstrukcji wykorzystujące standardowe podejście z filtrem Wienera będą po prostu wzmacniać szum w pasmach przepustowych SIM i dostarczą obraz, który jest w rzeczywistości standardowym obrazem TIRF z nałożonymi heksagonalnymi (lub „plastra miodu”) artefaktami pierścieniowania (Rysunek 6A, prawy panel). Możliwym ulepszeniem może być zastosowanie iteracyjnych29,30 lub ślepych algorytmów rekonstrukcji31,32 w celu redukcji tych artefaktów, w zależności od rodzaju próbki. Zalecamy stosowanie wtyczki SIMcheck do programu ImageJ w celu sprawdzenia jakości danych SIM przed i po rekonstrukcji33.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat układu wielokolorowego TIRF-SIM. Mikroskop TIRF-SIM składa się z trzech głównych części: jednostki generowania wiązki, jednostki projekcji wzoru oraz jednostki detekcji. W jednostce generowania wiązki trzy różne lasery są nakierowane na tę samą ścieżkę wiązki za pomocą luster dichroicznych (DM1 i DM2) i kierowane przez cztery elementy optyczne w celu kontroli polaryzacji. Najpierw polaryzator (P) zapewnia czystość stanu polaryzacji liniowej każdej z wiązek laserowych. Kolejne trzy elementy optyczne są niezbędne do szybkiej, zautomatyzowanej rotacji polaryzacji, co zostało opisane szczegółowo w tekście. Następnie dwie soczewki (L1 i L2) w konfiguracji teleskopu rozszerzają wiązkę, aby dopasować ją do aktywnej powierzchni przestrzennego modulatora światła (SLM), która dyfrakuje wiązkę na trzy mniejsze wiązki za pomocą rzutowanych przez SLM binarnych wzorów siatek (przykłady pokazano w kafelkach 1-9). Stan polaryzacji światła oświetlającego względem wzoru SLM jest przedstawiony jako strzałka. Drugi teleskop (L3 i L4) zmniejsza wzór i zapewnia dostęp do płaszczyzny Fouriera wzoru SLM. W tej płaszczyźnie maska przestrzenna (SM) jest używana do odfiltrowania składowej centralnej oraz innych niepożądanych składowych dyfrakcji wynikających z pikselowej struktury SLM i jego wewnętrznego okablowania. Zanim dwie pozostałe wiązki zostaną skupione na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (OB) za pomocą soczewki kondensatora (L5), w układzie umieszczono dwa lustra dichroiczne (DM3 i DM4). DM4 działa jako konwencjonalne lustro dichroiczne w mikroskopii fluorescencyjnej w celu oddzielenia światła oświetlenia od światła emisji. Jednak lustro to nieuchronnie indukuje eliptyczność stanu polaryzacji światła oświetlającego, co może zostać skompensowane przez DM3, lustro dichroiczne pochodzące idealnie z tej samej partii co DM4. Obiektyw TIRF z imersją olejową posiada wystarczająco dużą NA, aby bezpośrednio wprowadzić na szkiełko nakrywkowe dwie fale przeciwbieżne, które ulegają całkowitemu odbiciu i generują ustrukturyzowane pole ewanescentne w szkiełku nakrywkowym. Próbka jest zamocowana na stole translacyjnym x-y-z. Detekcja odbywa się przez ten sam obiektyw i DM4 w transmisji, z dodatkowym filtrowaniem za pomocą filtrów pasmowo-przepuszczających emisji, zamontowanych w sterowanym komputerowo kole filtrów (EFW). Na koniec obraz jest rzutowany na kamerę sCMOS przez wewnętrzną soczewkę tubusową mikroskopu (L6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Współosiowość nakładających się wiązek. (A) Wzorzec siatki SLM z okrągłą aperturą jest przydatny do kalibracji. Jeśli na kamerze widoczne są dwie niepokrywające się wiązki (po lewej), należy skorygować położenie płaszczyzny próbki poprzez iteracyjne dostrajanie pozycji osiowej obiektywu i kamery, aby uzyskać pojedynczą, okrągłą plamkę oświetlenia (po prawej). Wiązki muszą na siebie nachodzić, aby wytworzyć sinusoidalny wzór wzbudzenia wymagany dla TIRF-SIM. Brak pełnego pokrycia wiązek ogranicza pole widzenia, w którym tworzy się wzór interferencyjny. (B i C) Precyzyjny kąt padania wiązek jest istotny dla TIRF-SIM. Jeśli kąt jest nieprawidłowy, jedna z wiązek nie będzie miała kąta wymaganego dla TIRF, co jest łatwo zauważalne podczas obrazowania roztworu barwnika fluorescencyjnego. Jedna wiązka ma kąt padania większy od kąta krytycznego, co daje okrągłą plamkę, natomiast druga nie, co prowadzi do powstania jasnej smugi po lewej stronie obrazu w (B). (D) Dostrojenie kąta lustra DM3 zapewnia, że obie wiązki padają pod tym samym kątem, co można zweryfikować poprzez rozostrzenie obiektywu: przy prawidłowej kalibracji projekcja xz stosu z próbki barwnika fluorescencyjnego powinna wykazać dwie symetrycznie przecinające się wiązki z pomijalnym tłem w ognisku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Zależności synchronizacji różnych komponentów systemu. (A) W celu szybkiego pozyskiwania obrazów SIM niezbędna jest synchronizacja komponentów systemu za pomocą rozwiązania sprzętowego. (B) Jako główny wyzwalacz (master trigger) powinna zostać wykorzystana karta akwizycji danych (DAQ). Sygnał TTL z karty DAQ jest wysyłany do wejścia zewnętrznego sCMOS i służy do wyzwalania ekspozycji kamery. Wyjście Global Exposure kamery wyzwala następnie SLM w celu wyświetlenia wzoru siatki, a wyjście SLM LED Enable jest używane do cyfrowej modulacji wzbudzenia laserowego w taki sposób, aby laser emitował światło tylko wtedy, gdy piksele SLM znajdują się w stanie „włączony”. Po zakończeniu ekspozycji wyjście Global Exposure kamery służy do przejścia wzoru SLM do następnej fazy lub kąta siatki. Karta DAQ wysyła również napięcie analogowe do kontrolera LCVR w celu sterowania stanem polaryzacji liniowej wiązki oświetlającej. Napięcie to jest przełączane po pozyskaniu obrazów z 3 faz dla każdego kąta wzoru. Po pozyskaniu 9 obrazów dla jednej długości fali, karta DAQ wysyła sygnał do kontrolera koła filtrów emisyjnych i przełącza się na następną długość fali. Karta DAQ stosuje również offset z próbki poprzez wysyłanie napięcia analogowego do kontrolera piezoelektrycznego stolika w osi z. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazowanie TIRF-SIM próbek testowych wielokolorowych kulek 100 nm oraz fluorescencyjnie znakowanych włókien amyloidowych. (A i B) Porównanie standardowego TIRF z rekonstrukcjami TIRF-SIM dla wzbudzenia 488 nm i 640 nm. (C) Histogram pełnej szerokości połówki maksimum (FWHM) dopasowań Gaussa do kulek w TIRF-SIM, wykazujący oczekiwaną poprawę rozdzielczości. (D) TIRF w porównaniu z TIRF-SIM dla włókien β-amyloidu znakowanych 10% pochodną barwnika rodaminy (wzbudzenie 488 nm). Paski skali = 1 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Obrazowanie żywych komórek metodą TIRF-SIM. Porównanie obrazów konwencjonalnego TIRF i TIRF-SIM (A, B) mikrotubul (emGFP-tubulina) w komórce HEK293, (C, D) aktyny filamentowej (LifeAct-GFP) w komórce COS-7 oraz (E, F) GFP cytozolowego w komórce HEK293. Obrazy w B i F stanowią pojedyncze punkty czasowe z filmów. Obszary zaznaczone ramkami przedstawiono w powiększeniu w (G, H). Paski skali = 3 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wpływ rotatora polaryzacji na zrekonstruowane obrazy kulek. (A) Bez użycia rotatora polaryzacji, takiego jak LCVR, stosunek sygnału do szumu w pasmach SIM jest niski, co skutkuje charakterystycznymi artefaktami sześciokątnymi w zrekonstruowanych obrazach SIM (po prawej), (B) W 2D-SIM wzory strukturyzowanego oświetlenia są bezpośrednio widoczne w transformacie Fouriera surowych obrazów (po lewej, zaznaczona częstotliwość przestrzenna wzbudzenia), ponieważ mieszczą się w promieniu obszaru wsparcia OTF emisji; jednak w TIRF-SIM znajdują się one poza obszarem wsparcia OTF i są zatem niewidoczne (po prawej). W takim przypadku kontrast modulacji wzoru musi zostać oceniony przy użyciu rzadkiej monowarstwy kulek, zgodnie z opisem w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Generowanie wzorów w oparciu o modulator światła przestrzennego umożliwia implementację innych modalności obrazowania, takich jak wieloogniskowe SIM. (A) W MSIM siatka kwadratowych punktów wyświetlana na SLM (wstawka) generuje siatkę ognisk ograniczonych dyfrakcyjnie w płaszczyźnie obrazu. Obrazowana jest cienka warstwa rodaminy 6G o niskim stężeniu w celu wizualizacji ognisk. Wzór jest przesuwany nad próbką (B), a pozyskany surowy stos obrazów z-stack jest rekonstruowany w celu wygenerowania obrazu z zredukowanym światłem poza ogniskową (C). Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-8
Animowana rycina 1: Film z serii czasowej emGFP-tubuliny w komórce HEK293. Szybką polimeryzację i depolimeryzację mikrotubul znakowanych emGFP można obserwować przy użyciu TIRF-SIM. Obrazy zostały pozyskane przy czasie ekspozycji 50 msec na klatkę surową (450 msec na klatkę SIM) w odstępach 0,5 sec. Zastosowany czas ekspozycji był ograniczony jasnością fluoroforu, a nie prędkością kamery lub SLM. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

figure-results-9
Animowana rycina 2: Film z serii czasowej cytosolic GFP w komórce HEK293. Próbki o niskim kontraście, takie jak ta, nie są idealne do obrazowania TIRF-SIM. W obrazach TIRF można zaobserwować wsteczny przepływ błony, ale TIRF-SIM nie dostarcza żadnych dodatkowych informacji poza krawędziami komórki. Obrazy TIRF-SIM uzyskano przy czasie ekspozycji 50 msec na surową klatkę (450 msec na klatkę SIM) w odstępach 5 sec. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Uzupełniający plik z kodem: Przykładowy plik repertuaru SLM (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_001.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_002.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_003.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_004.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_005.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_006.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik z kodem: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_007.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_008.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_009.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_mask_1.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_mask_2.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (period9_mask_3.bmp). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodu: Przykładowy plik repertuaru SLM (TIRF-SIM_example.rep). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy kod generowania siatek (1 z 2) (generate_gratings.m). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodu: Przykładowy kod generowania siatki (2 z 2) (circular_mask.m). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodu: Przykładowy kod do obliczania kontrastu modulacji (calculate_contrast.m). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Systemy TIRF-SIM budowane na zamówienie, takie jak układ opisany w niniejszym protokole, umożliwiają wielokolorowe obrazowanie w superrozdzielczości z wysoką prędkością w porównaniu z mikroskopami dostępnymi komercyjnie. Wrodzoną zaletą SIM jako techniki superrozdzielczej jest to, że rozdzielczość czasowa nie jest ograniczona fotofizyką fluoroforu, w przeciwieństwie do innych metod, takich jak mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM) czy metody skanowania punktowego, takie jak mikroskopia z ugaszaniem emisji stymulowanej (STED). W przeciwieństwie do tych technik, SIM nie wymaga fluoroforów fotoprzełączalnych lub podatnych na ugaszenie, dzięki czemu obrazowanie wielokolorowe jest proste w realizacji. Systemy niebędące TIRF-SIM, takie jak SIM z sekcjonowaniem optycznym oraz SIM multifokalny, w praktyce zazwyczaj osiągają poprawę rozdzielczości o 1,7 raza lub mniej, w przeciwieństwie do dwukrotnej poprawy opisanej w niniejszej pracy, a systemy komercyjne są często wolniejsze i mniej elastyczne niż układ przedstawiony w tym protokole.

Dwie główne trudności w implementacji tej techniki to po pierwsze konieczność precyzyjnego pozycjonowania sześciu wiązek SIM w strefie TIR tylnej apertury obiektywu, co wymaga żmudnej i czasochłonnej procedury wyrównania optycznego. Po drugie, aby uzyskać wysoki kontrast wzorca w próbce, niezbędna jest rotacja polaryzacji. W systemach 2D-SIM o niskiej aperturze numerycznej (NA) rotacji polaryzacji można uniknąć poprzez staranny dobór orientacji polaryzacji liniowej, jednak w przypadku TIRF-SIM25 jest to niemożliwe. Do szybkiego obrazowania wielokolorowego niezbędna jest elektrooptyczna kontrola polaryzacji, co zwiększa złożoność i koszt systemu.

Ograniczenia techniki

Metoda TIRF-SIM, podobnie jak konwencjonalna mikroskopia TIRF, jest z natury ograniczona do obserwacji struktur i procesów biologicznych zlokalizowanych w podstawowej błonie komórkowej, które mogą być oświetlone przez pole ewanescentne o głębokości penetracji 150-200 nm. Choć często wskazuje się, że SIM jest mniej fotodestrukcyjna dla komórek niż STED lub SMLM, dwukrotne zwiększenie rozdzielczości bocznej nadal zwiększa wymaganą liczbę fotonów co najmniej 4-krotnie5 w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią TIRF. W przypadku obrazowania z wysoką częstotliwością klatek i krótkimi czasami ekspozycji, ten wzrost liczby fotonów wymusza zastosowanie większych intensywności oświetlenia. O ile do obrazowania SIM utrwalonych lub wolno poruszających się próbek można użyć dowolnego fluoroforu, o tyle do obrazowania żywych komórek zaleca się stosowanie białek fluorescencyjnych o wysokiej jasności lub syntetycznych barwników nowej generacji o zwiększonej fotostabilności.

Chociaż ta implementacja umożliwia obrazowanie w jednym kolorze z częstotliwością klatek SIM przekraczającą 20 Hz, obrazowanie wielokolorowe w prezentowanym systemie jest ograniczone czasem przełączania zmotoryzowanego koła filtrów emisyjnych. Ze względu na duży rozmiar matrycy kamery sCMOS, możliwe byłoby zastosowanie wielopasmowego filtru emisyjnego oraz optyki rozdzielającej obraz, co pozwoliłoby na jednoczesne obrazowanie z wykorzystaniem wielu długości fal bez utraty szybkości. Inną możliwością byłoby naprzemienne używanie różnych laserów wzbudzających i zastosowanie wielopasmowego filtru notch w celu odcięcia światła wzbudzenia. Zastosowanie binarnego ferroelektrycznego SLM w tej implementacji również nie jest optymalne. Sprawność dyfrakcyjna takiego SLM jest bardzo niska, przez co większość światła padającego znajduje się w odbiciu zerowego rzędu, które jest odfiltrowywane przez maskę przestrzenną. W przypadku zastosowań wymagających bardzo wysokiej częstotliwości klatek, szybkość obrazowania jest zatem ograniczona mocą wyjściową diod laserowych. SLM wprowadza również pewną eliptyczność polaryzacji dla długości fal oddalonych od projektowanej długości fali 550 nm, przy której piksele nie działają jako idealne płytki półfalowe. Chociaż można by to skompensować za pomocą dodatkowego LCVR, idealnym rozwiązaniem może być zastosowanie urządzenia cyfrowego mikrolusterek (DMD) jako generatora wzorów.

Możliwe modyfikacje

Przedstawiona tutaj konfiguracja jest elastyczna i łatwiejsza w modyfikacji niż instrumenty komercyjne, dzięki czemu można w niej zaimplementować inne modalności obrazowania, takie jak 3D-SIM, szybki 2D-SIM, wieloogniskowy SIM (MSIM) oraz nieliniowy SIM (NL-SIM)21,34,35.

2D-SIM może być odpowiednio dopasowany do obrazowania stosunkowo płaskich, szybko poruszających się struktur, takich jak obwodowy retikulum endoplazmatyczny. Obwodowe ER znajduje się głębiej w komórce, niż pozwala na oświetlenie polem ewanescentnym TIRF, lecz ze względu na swoją płaską strukturę może być obrazowane przy użyciu standardowego 2D-SIM z pomijalnym tłem poza ogniskową. Dodatkowo, zastosowanie ulepszonych algorytmów rekonstrukcji sekcji optycznej w celu stłumienia światła poza ogniskową rozszerza zastosowanie 2D-SIM na próbki optycznie grube, choć w przypadkach, w których dwukrotne zwiększenie rozdzielczości osiowej nie jest wymagane21.

W technice MSIM próbka jest oświetlana rzadką siecią ognisk wzbudzenia36. Tryb ten można zaimplementować, po prostu usuwając maskę przestrzenną (SM) i zastępując ją polaryzatorem. SLM działa teraz jako modulator amplitudy. Binarne kratki SIM wyświetlane na SLM mogą zostać zastąpione dwuwymiarową siecią punktów, przy czym rozmiar punktów dobiera się tak, aby był równy rozmiarowi ognisk ograniczonych dyfrakcją w płaszczyźnie obrazu. Na Rysunku 7A na SLM wyświetlona jest sieć kwadratów o rozmiarze 4 x 4 piksele (wstawka), która po zredukowaniu na próbkę generuje ograniczone dyfrakcją ogniska o rozmiarach 150 x 150 nm, przy fizycznym rozmiarze piksela SLM wynoszącym 13,62 µm. Ogniska wzbudzenia można następnie przesuwać poprzez zmianę położenia wzoru sieci na SLM; czynność tę powtarza się wielokrotnie, aby oświetlić całe pole widzenia. Obrazy są pozyskiwane dla każdego przesuniętego położenia wzoru, a uzyskany stos jest poddawany postprocesingowi w celu uzyskania zrekonstruowanego obrazu o rozdzielczości zwiększonej nawet o czynnik figure-discussion-1 i zredukowanym świetle poza ogniskową w porównaniu do równoważnego obrazu szerokopolowego30. Tryb ten może być użyteczny do obrazowania grubych, gęstych próbek, do których standardowe SIM jest nieodpowiednie, na przykład struktur o niskim kontraście, takich jak barwione erytrocyty (Rysunek 7C), choć czas akwizycji jest wydłużony ze względu na dużą liczbę surowych klatek wymaganych dla jednego pola widzenia (w tym przypadku N = 168).

Ostatecznie układ można zmodyfikować, aby umożliwić stosowanie albo liniowej TIRF-SIM o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA), albo nieliniowej SIM z wzorcowaną aktywacją (PA NL-SIM), zgodnie z niedawną prezentacją Li i wsp...., poprzez zastosowanie obiektywu o ultrawysokiej aperturze numerycznej (NA 1,7) lub dodanie lasera do fotoaktywacji o długości fali 405 nm oraz staranną optymalizację wzorów siatek SLM35.

Przyszłe zastosowania

SIM jest wciąż szybko rozwijaną techniką, która w przyszłości umożliwi wiele zastosowań w naukach o życiu. Zwiększenie szybkości, rozdzielczości i kontrastu tej metody oraz możliwość stosowania standardowych fluoroforów sprawiają, że w obrazowaniu biologicznym SIM ma szansę zastąpić konwencjonalne systemy mikroskopowe, takie jak platformy konfokalne i szerokopolowe. Komercyjne systemy SIM są już dziś dostępne i oferują wyjątkowe specyfikacje techniczne, jednak pozostają one poza zasięgiem finansowym wielu laboratoriów badawczych i, co kluczowe, są nieelastyczne w kwestii modyfikacji i rozwoju w celu wdrażania najnowszych osiągnięć badawczych w tej dziedzinie. Brakuje im również niezbędnej możliwości „dostosowania do konkretnego eksperymentu”, co często stanowi krytyczne wąskie gardło w przełomowych badaniach nad naukami o życiu. System opisany w niniejszej pracy będzie szczególnie odpowiedni do badania procesów dynamicznych w pobliżu powierzchni komórki, do badań in vitro rekonstytuowanych systemów dwuwarstwowych, do badania chemii powierzchni w naukach o materiałach i fizyce, np. materiałów 2D, a także do wielu innych zastosowań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Leverhulme Trust, Rady Badań Inżynieryjnych i Fizycznych [EP/H018301/1, EP/G037221/1]; Brytyjskie Badania nad chorobą Alzheimera [ARUK-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703/Z/09/Z] oraz Rada ds. Badań Medycznych [MR/K015850/1, MR/K02292X/1]. Dziękujemy E. Avezovowi i M. Lu za transfekcję odpowiednio komórek LifeAct-GFP i cytozol-GFP oraz W. Chenowi za przygotowanie hodowli HEK293. Dziękujemy również K. O'Holleranowi za pomoc w zaprojektowaniu mikroskopu oraz L. Shao i R. Heintzmannowi za przydatne dyskusje i sugestie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser 488 nmTopticaiBeam SMARTz modulacją cyfrową
Laser 561 nmCoherentOBIS LSz modulacją cyfrową
Laser 640 nmCoboltMLDz modulacją cyfrową
Zwierciadła dichroiczne długoprzepustowe Thorlabsdo łączenia wiązek wzbudzających
Czteropasmowe zwierciadło dichroiczneChromaZT405/488/561/640rpco grubości 3 mm, płaskie obrazowanie TIRF, zamontowane w kostce filtracyjnej Olympus BX
Czteropasmowe lustro dichroiczneChromaZT405/488/561/640rpcZ tej samej partii co powyżej, 25 x 25 mm
1" kwadratowy montaż kinematycznyEdmund Optics58-860
Kalcyt Glan-Taylor PolaryzatoryThorlabsGT5-ADo wyrównania LCVR
Montaż Glan-TaylorThorlabsSM05PM5
Achromatyczna płyta półfalowaThorlabsAHWP05M-600400-800 nm
Obrotowe mocowanie klatkiThorlabsCRM1/MDo HWP
Ciekłokrystaliczny zmienny retarderMeadowlark OpticsSWIFTZbudowany na zamówienie, aby zapewnić pełną odporność falową w zakresie od 488 do 640 nm.
Kontroler LCVRMeadowlark OpticsD3060HVDwukanałowy sterownik wysokiego napięcia do opóźniaczy ciekłokrystalicznych
Achromatyczna płyta ćwierćfalowaMeadowlark OpticsAQM-100-0545
Obrotowe mocowanie klatkiThorlabsCRM1P/MDo
dubletu achromatycznego QWP 10 mmThorlabsAC080-010-A-MLDo ekspandera wiązki
200 mm achromatyczny dubletThorlabsAC254-200-A-MLDo ekspandera wiązki
Klatka XY TranslatoryThorlabsCXY1
Ferroelektryczny przestrzenny modulator światłaCzwarty wymiar WyświetlaczeM0787-00249       SXGA-3DM (IFF) Mikrowyświetlacz typu M249, 1 280 x 1 024 pikseli, z płytą sterownika
Rama montażowa SLMForth Dimension DisplaysM0787-10014Mocowana do niestandardowego aluminiowego uchwytu
i Oslash; 50,8 mm Uchwyt do lustra gimbalaThorlabsGM200/MDo montażu SLM
Dwuosiowy liniowy stolik translacyjny z obrotową platformąThorlabsXYR1/MDo montażu SLM
Nośnik szynowyNewportM-PRC-3Do montażu SLM
Precyzyjna szyna optycznaNewportPRL-6Do montażu SLM
300 mm achromatyczny podwójny obiektywQioptiqG322 273 322 f = 300 mm, średnica 31,5 mm
Achromatyczny obiektyw dubletowy 140 mmQioptiqG322 239 322f=140 mm, średnica 31,5 mm
Precyzyjne mocowania translacyjne XYThorlabsLM2XY Adaptery montażowe
obiektywuThorlabsSM2AD32Do montażu obiektywów 31,5 mm w mocowaniach 2"
Etapy translacjiComar12XT65Dovetail, napęd boczny
XY Translator z napędami różnicowymiThorlabsST1XY-D/Mdo filtra przestrzennego
Obrotowe mocowanie klatkoweThorlabsCRM1/Mdo filtra przestrzennego
300 mm achromatyczny dubletThorlabsAC508-300-A-MLSoczewka rurki wzbudzenia
Zautomatyzowany stolik XY z górną płytą Z-piezoASIPZ-2150-XYFT-PZ-IX71 ze sterownikiem MS-2000
Odwrócona ramka mikroskopuOlympusIX-71
ObiektywOlympusUAPON100XOTIRF100X/1.49NA
Szybkie koło filtrówPrior ScientificHF110Az kontrolerem Prior ProScan III
Filtry emisji pasmowoprzepustowejKamera sCMOS SemrockFF01-525/30, FF01-676/29
HamamatsuORCA Flash v4.0
Inkubator stołowyOKO LabH301-K-FRAMEDo obrazowania komórek na żywo z regulatorami temperatury Bold Line i CO2
Słupki optyczne ze stali nierdzewnejSeria ThorlabsTRdo montażu elementów optycznych
UchwytySeria ThorlabsPHdo montażu elementów optycznych
Mocowania lusterek kinematycznychThorlabsKM100do montażu luster 1"
Interferometr ścinającyThorlabsSI100
100 mikrosfery fluorescencyjneTechnologiesT-7279Tetraspeck
Rhodamine 6GSigma Aldrich83697-250MG
naczynia ze szklanym dnemibidi80827ze szkłem nakrywkowym #1.5 Szkło nakrywkowe
komorowe Nunc Lab-Tek IIThermo Fisher Scientific155409ze szkłem nakrywkowym #1,5
Szkiełko siatkowe mikroskopu 0,01 mmEMS68039-22
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0Thermo Fisher ScientificC10613
do słupków Life 8-dołkowe

Bibliografia

  1. Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).
  5. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  6. Westphal, V., et al. Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
  7. Davies, T., et al. CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation. PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).
  8. Laine, R. F., et al. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat. Commun. 6, 5980(2015).
  9. Pinotsi, D., et al. Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy. Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).
  10. Esbjörner, E. K., et al. Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation. Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).
  11. Michel, C. H., et al. Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology. J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).
  12. Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques. Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).
  13. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  14. Cragg, G. E., So, P. T. Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves. Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).
  15. Chung, E., Kim, D., So, P. T. Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy. Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).
  16. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).
  17. Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).
  18. Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks. Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).
  19. Förster, R., et al. Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator. Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).
  20. Lu-Walther, H. W., et al. fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy. Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).
  21. Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. High speed structured illumination microscopy in optically thick samples. Methods. , (2015).
  22. von Olshausen, P. Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , University of Freiburg. (2012).
  23. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  24. Meadowlark Optics Inc. Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).
  25. O'Holleran, K., Shaw, M. Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy. Opt. Lett. 37 (22), 4603(2012).
  26. Brankner, S. Z., Hobson, M. Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf (2013).
  27. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  28. Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).
  29. Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy. 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).
  30. Ströhl, F., Kaminski, C. F. A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data. Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).
  31. Mudry, E., et al. Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).
  32. Ayuk, R., et al. Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).
  33. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Sci. Rep. 5, 15915(2015).
  34. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
  35. Li, D., et al. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
  36. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia strukturalnego o wietleniafluorescencja ca kowitego wewn trznego odbiciaobrazowanie wysokiej szybko ciprzestrzenny modulator wiat akontrola polaryzacjiobrazowanie wielokolorowewyr wnanie systemuobrazowanie superrozdzielczeobrazowanie ywych kom reksekcjonowanie optyczne

Powiązane artykuły