Celem tego protokołu jest ocena ogólnoustrojowego ciśnienia krwi u świadomych, swobodnie poruszających się myszy za pomocą wszczepialnych urządzeń radiotelemetrycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Długoterminowy pomiar ciśnienia krwi u swobodnie poruszających się myszy za pomocą telemetrii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas opracowywania nowych środków wazoaktywnych, monitorowanie ciśnienia tętniczego krwi jest kluczowe dla oceny skuteczności nowych proponowanych leków. Rzeczywiście, badania koncentrujące się na odkryciu nowych potencjalnych celów terapeutycznych przy użyciu genetycznie zmienionych myszy wymagają wiarygodnej, długoterminowej oceny zmienności ogólnoustrojowego ciśnienia tętniczego. Obecnie złoty standard uzyskiwania długoterminowych pomiarów ciśnienia krwi u myszy ambulatoryjnych wykorzystuje wszczepialne nadajniki radiowe, które wymagają kaniulacji tętnic. Technika ta eliminuje potrzebę wiązania, krępowania lub znieczulania zwierząt, które wprowadzają stres i artefakty podczas próbkowania danych. Jednak monitorowanie ciśnienia tętniczego krwi u myszy za pomocą cewnikowania może być dość trudne ze względu na mały rozmiar tętnic. Poniżej przedstawiamy przewodnik krok po kroku, aby zilustrować kluczowe fragmenty dla udanej podskórnej implantacji nadajników radiowych i kaniulacji tętnicy szyjnej u myszy. Dołączamy również przykłady długoterminowej aktywności ciśnienia krwi pobranej od swobodnie poruszających się myszy po okresie rekonwalescencji po operacji. Postępowanie zgodnie z tą procedurą umożliwi wiarygodne bezpośrednie zapisy ciśnienia krwi od wielu zwierząt jednocześnie.
Wprowadzenie
Nadciśnienie jest jednym z głównych czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych, prawdopodobnie jest to poważny problem zdrowia publicznego zarówno w krajach rozwiniętych, jak i rozwijających się1. Opracowano kilka zwierzęcych modeli eksperymentalnego nadciśnienia tętniczego, aby naśladować reakcje nadciśnieniowe, takie jak te obserwowane u ludzi2. Mysz ambulatoryjna stanowi m.in. doskonały model do badania genezy i progresji nadciśnienia tętniczego, pozwalający na analizę in vivo konsekwencji przewlekłego narażenia na nadciśnienie.
Monitorowanie ciśnienia krwi (BP) u myszy pomogło naukowcom odkryć kilka mechanizmów związanych z fizjologią i patofizjologią chorób takich jak nadciśnienie i niewydolność serca 3,4. Rzeczywiście, manipulacja genomem myszy pozwoliła na wygenerowanie modeli transgenicznych lub ukierunkowanych na geny, odpowiednich do badania nadciśnienia 5,6. Jednak nawet delikatna manipulacja przytomnymi myszami wywołuje podniecenie, które może potencjalnie wprowadzić artefakty podczas pozyskiwania danych, podczas gdy stosowanie środków uspokajających lub uspokajających głęboko wpływa na ciśnienie krwi7. Aspekty te są szczególnie ważne i muszą być brane pod uwagę przy podejmowaniu prób długoterminowego monitorowania ciśnienia tętniczego.
Istnieje kilka sposobów na rejestrowanie ciśnienia tętniczego u myszy, a porównanie najpopularniejszych obecnie dostępnych technik zostało omówione gdzieindziej 8,9. Jednak w zaleceniach AHA dotyczących pomiaru ciśnienia tętniczego stwierdzono, że pomiar ciśnienia tętniczego jest ogólnie preferowany ze względu na jego zdolność do bezpośredniego pomiaru ciśnienia tętniczego przez dłuższy czas10. Radiotelemetria w połączeniu z bezpośrednim pomiarem ciśnienia tętniczego jest najnowocześniejszą metodą monitorowania funkcji fizjologicznych u obudzonych i swobodnie poruszających się zwierząt laboratoryjnychprzy jednoczesnej minimalizacji stresu i artefaktów związanych ze środowiskiem 9,11. Radiotelemetria oferuje możliwość automatycznego zbierania ciśnienia krwi, tętna, temperatury ciała i aktywności zwierząt od wielu świadomych zwierząt.
Chociaż ta metodologia staje się bardzo popularna w wielu laboratoriach, implantacja radiotelemetrii u myszy może być technicznie trudna. Tutaj pokazujemy protokół krok po kroku, który ilustruje, jak wszczepić przetwornik ciśnienia myszom. Technika polega na podskórnym wprowadzeniu sondy do ciała myszy, skierowaniu cewnika do szyi i do przodu w pobliżu łuku aorty przez lewą tętnicę szyjną. Zdalnie przechwycone dane są wyświetlane na żywo na monitorze komputera. Dane są również przechowywane do analizy "off-line".
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury na zwierzętach wymienione w tym artykule wideo zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee.
Uwaga: Używaj sterylnych narzędzi mikrochirurgicznych przez cały zabieg chirurgiczny. Narzędzia chirurgiczne można sterylizować za pomocą sterylizatora na podczerwień w optymalnej temperaturze sterylizacji 1,500 °F (815.6 °C). Telemetry mogą być ponownie użyte, jednak przed włożeniem go do zwierzęcia należy upewnić się, że cały nadajnik został wysterylizowany zgodnie z instrukcjami producenta oraz że końcówka cewnika została ponownie napełniona specjalnym żelem dostarczonym przez producenta.
1. Zwierzęta doświadczalne
- Uzyskanie zgody IACUC na wszystkie eksperymenty, które zostaną przeprowadzone. Zdecydowanie zaleca się konsultację z IACUC w sprawie wymagań dotyczących pooperacyjnego stosowania leków przeciwbólowych po tej procedurze.
- Trzymaj zwierzęta w klimatyzowanych pomieszczeniach o temperaturze otoczenia 21 °C, wilgotności względnej 60% i 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
Uwaga: Ponieważ korpus myszy musi pomieścić sondę telemetryczną (około 1 cm średnicy x 2 cm długości), zaleca się używanie myszy o wadze 20 g lub większej.
2. Znieczulenie i przygotowanie operacyjne
- Zważ mysz za pomocą precyzyjnej wagi i zapisz jej wagę. Upewnij się, że obchodzisz się ze zwierzęciem delikatnie i cicho.
- Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i zamknij ją. Ustaw natężenie przepływu tlenu na 0,5 l/min i ustaw stężenie izofluranu na 4 - 5% .
- Gdy mysz straci przytomność, umieść ją na płycie do rozgrzewania ciała utrzymywanej w temperaturze 36 - 37 °C. Utrzymuj znieczulenie za pomocą nosa z izofluranem ustawionym na 2% (utrzymuj natężenie przepływu na poziomie 0,5 l/min).
- Przygotuj obszary operacji, usuwając włosy z tyłu szyi i brzusznej części szyi, nakładając krem do depilacji.
- Oczyść miejsce nacięcia 3 aplikacjami peelingu chirurgicznego (roztwór betadyny) na przemian z 70% alkoholem izopropylowym.
3. Chirurgia
- Umieść mysz w pozycji leżącej. Sprawdź, czy nie ma odruchów, ściskając stopę, i dostosuj znieczulenie, aż nie będzie żadnej reakcji. Wykonaj około 1-centymetrowe nacięcie w linii środkowej poniżej szyi myszy za pomocą skalpela. Po lewej stronie nacięcia stwórz przestrzeń podskórną, ostrożnie oddzielając skórę od leżącej pod nią tkanki łącznej.
- Odwróć mysz i za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry o długości około 1,5 cm po lewej stronie grzbietowej za łopatką. Stwórz podskórną kieszeń wzdłuż boku zwierzęcia, wystarczająco dużą, aby pomieścić urządzenie. Włóż nadajnik do kieszeni.
- Włóż mały zacisk hemostatu w tylne nacięcie i manewruj nim podskórnie w kierunku przedniego otworu szyi. Za pomocą włożonego zacisku hemostatu delikatnie chwyć nietoksyczną rurkę polietylenową (4 cm długości x 1 mm średnicy).
- Przeciągnij hemostat z powrotem przez tunel przez boczne nacięcie z tyłu, aż rurka wystaje zarówno z nacięcia brzusznego, jak i grzbietowego, zwolnij rurkę z hemostatu. Od tyłu włóż czujnik cewnika do rurki, aby przeciąć końcówkę cewnika wykrywającego ciśnienie przez szyję. Od przedniej części szyi pociągnij i wyjmij rurkę polietylenową i zamknij nacięcie grzbietowe za pomocą metalowych klipsów.
- Ostrożnie oddziel gruczoły żuchwowe za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką i schuj lewy gruczoł żuchwowy za pomocą elastycznego haczyka podtrzymującego. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków z cienką końcówką zlokalizuj tętnicę szyjną wzdłuż lewej strony tchawicy. Utrzymuj sterylność pola operacyjnego, umieszczając i zabezpieczając sterylną obłożnicę.
- Ostrożnie odizoluj naczynie od otaczającej tkanki i delikatnie oddziel nerw błędny (białawy), który znajduje się wzdłuż tętnicy szyjnej z dala od tętnicy. Uważaj, aby nie przeciąć ani nie uszkodzić nerwu lub tętnicy.
- Przełóż trzy kawałki niewchłanialnego szwu 7-0 pod izolowanym odcinkiem tętnicy szyjnej. Zawiąż szew czaszkowy, aby zamknąć przepływ krwi. Pociągnij szew, który znajduje się najbliżej mostka, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi z aorty.
- Zrób luźny węzeł za pomocą środkowego szwu. Zostanie on wykorzystany do zabezpieczenia cewnika w naczyniu. Wytnij małe nacięcie w tętnicy między szwami czaszkowymi i mostkowymi za pomocą mikronożyczek.
- Chwyć cewnik specjalnymi kleszczami do kaniulacji naczyń, uważając, aby nie ścisnąć cewnika, aby zapobiec utracie żelu z sondy. Delikatnie chwyć tętnicę cienką końcówką zakrzywioną pęsetą, wyjmij cewnik i wprowadź go do naczynia przez małe nacięcie.
- Zaciśnij środkowy węzeł szwu wokół tętnicy i delikatnie przesuń cewnik. Delikatnie zwolnij szew, który jest bliższy mostkowi i kontynuuj przesuwanie cewnika w kierunku aorty poprzecznej.
- Zwróć uwagę na znak na cewniku, który podaje przybliżony wskaźnik tego, jak daleko należy wprowadzić cewnik. Po osiągnięciu punktu delikatnie zaciśnij zarówno dolny, jak i górny szew wokół cewnika. Cewnik jest przymocowany do tętnicy szyjnej za pomocą węzłów szwowych.
- Zamknij nacięcie skóry niewchłanialnym szwem 5-0. Po zamknięciu uszczelnij nacięcie klejem tkankowym.
4. Rekonwalescencja chirurgiczna i pomiary ciśnienia krwi
- Uważnie monitoruj zwierzę pod kątem powrotu normalnych postaw i zachowań. W ciągu 24 godzin po operacji należy podawać środek przeciwbólowy zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii.
- Gdy zwierzęta wyzdrowieją (5-7 dni po operacji), trzymaj je pojedynczo w zwykłej klatce dla myszy umieszczonej na górze płytki odbiornika telemetrii.
- Włącz i wyłącz wszczepione nadajniki za pomocą urządzenia magnetycznego umieszczonego na krótko blisko zwierzęcia z zewnątrz klatki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dane mogą być pozyskiwane zdalnie przez odbiornik; ślady są wizualizowane na ekranie komputera w celu kontroli jakości (Rycina 1a). Wyświetlane są również szczegóły, takie jak identyfikator zwierzęcia, ciśnienie krwi rozkurczowe i ciśnienie krwi skurczowe (Rycina 1b). Tętnicze ciśnienie krwi może być rejestrowane w sposób ciągły (24/7) lub w krótkich, zaprogramowanych odstępach czasu (t.j. akwizycja trwająca 60 s co godzinę). Dane mogą być automa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wszczepialna radiotelemetria uległa znacznej poprawie w ciągu ostatniej dekady; Mniejszy rozmiar sondy sprawia, że implant jest mniej traumatyczny dla zwierzęcia, wydłużona żywotność baterii pomaga obniżyć koszty, a niezależne częstotliwości telemetru eliminują przesłuchy między odbiornikami. Telemetria jest uważana za najnowocześniejszą metodę zbierania szerokiej gamy parametrów fizjologicznych od swobodnie poruszających się zwierząt bez artefaktów związanych z użyciem ograniczenia, interakcji z człowiekiem lub znieczul...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH/NHLBI) [Grant no. HL114869] oraz wsparcie ze strony UTHSC dla SM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System znieczulenia małych zwierząt | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | System znieczulenia małych zwierząt o niskim przepływie | |
| Podgrzewacz do padów i termometr dla myszy | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | umożliwia monitorowanie temperatury ciała i kontrolę homeotermiczną u małych zwierząt | |
| Mikroskop lornetkowy | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | Korpus lornetki KSCXTS-1121 | z wysięgnikiem, stojakiem, słupkiem i górną diodą LED |
| Kleszcze do hemostatów | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | służy do zaciskania naczyń krwionośnych lub szycia znaczników |
| Małe metalowe klipsy, 7 mm, stal nierdzewna | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | używane do zamykania skóry |
| Roztwór Betadine | Purdue Products L.P., Stamford, CT, Stany Zjednoczone | NDC-67618-150-01 | 10% roztwór miejscowy jodu powidonu |
| Normalny roztwór soli fizjologicznej | Abott Laboratories | 04930-04-10 | potrzebny do zapobiegania wysuszeniu tkanek. |
| Nair (Balsam do usuwania włosów) | potrzebny do usuwania sierści z miejsca nacięcia/operacji | ||
| Jedwabny szew warkocz | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Rozmiar 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Etanol | 2716 | 70% etanol do dezynfekcji | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tool | 15000-10 | do drobnych rozwarstwień |
| Nożyczki (ustawione pod kątem na bok) | Fine Science Tool | 14063-011 | Rękojeść nr 3 |
| Ostrze | 2976-0 | Kleszcze nr 10 | |
| (zakrzywione) | Fine Science Tool | 11150-10 | do trzymania tkanek |
| Kleszcze (proste) | Fine Science Tool | 11151-10 | do trzymania tkanek |
| Uchwyt igły | Fine Science Tool | 12002-12 | do szycia |
| Kleszcze z cienką igłą | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, Nowy Jork, USA | ogólny wziewny środek znieczulający | |
| Sterylizator Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterylizuje narzędzia chirurgiczne w 5-10 sekund za pomocą ogrzewania na podczerwień | |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, Nowy Brunszwik, NJ, USA | JJ8513 | do stosowania do oczyszczania, przygotowywania, szorowania lub opatrywania ran |
| Urządzenie telemetryczne | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA DSI-PA-C10 | do rejestrowania ciśnienia krwi u swobodnie poruszających się myszy | |
| System odbiornika telemetrii połączony z komputerem Data | Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Rurki | Instech Laboratories, Plymouth Spotkanie, PA USA | BTPE-90 | |
| Kleszcze do kaniulacji naczyń, 13 cm, 0,5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | specjalne kleszcze do kaniulacji naczyń |
| Klej tkankowy | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NR: NAC:   11380041 | stosować do zamykania drobnych ran, często eliminując potrzebę zakładania szwów i/lub bandaży |
| Waga | Precyzyjna analityczna waga laboratoryjna | BB300 |
Bibliografia
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058(2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al. Arterial Pressure Monitoring in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 105-122 (2011).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
