Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Podsumowanie

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Streszczenie

Cyjanobakterie są ekologicznie ważnymi organizmami i potencjalnymi platformami do produkcji biopaliw i użytecznych produktów przemysłowych. Manipulacja genetyczna sinicami, zwłaszcza organizmami modelowymi, takimi jak Synechocystis sp. PCC6803 i Synechococcus sp. PCC7002, jest kluczowym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Wytwarzanie nieoznaczonych mutantów, w wyniku których zmiany chromosomowe są wprowadzane do szczepu poprzez wprowadzenie kasety oporności na antybiotyki (podatny na manipulację fragment DNA zawierającego jeden lub więcej genów), a następnie usunięcie tej kasety za pomocą ujemnego markera selekcyjnego, jest szczególnie skuteczną techniką. Nieoznaczone mutanty mogą być wielokrotnie manipulowane genetycznie, co pozwala na wprowadzenie do szczepu dowolnej liczby zmian. Ponadto pożądany jest brak genów kodujących białka oporności na antybiotyki w zmutowanym szczepie, ponieważ pozwala to uniknąć możliwości "ucieczki" organizmów opornych na antybiotyki do środowiska. Jednak szczegółowe metody powtarzających się rund manipulacji genetycznej sinicami nie są dobrze opisane w literaturze naukowej. W tym miejscu przedstawiamy wyczerpujący opis tej techniki, którą z powodzeniem wykorzystaliśmy do generowania mutantów z wielokrotnymi delecjami, mutacjami jednopunktowymi w obrębie genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz insercją nowych kaset genowych.

Wprowadzenie

Cyjanobakterie to ewolucyjnie starożytny i różnorodny typ bakterii, który można znaleźć w prawie każdym naturalnym środowisku na Ziemi. W ekosystemach morskich występują one szczególnie obficie i odgrywają kluczową rolę w wielu cyklach składników odżywczych, odpowiadając za około połowę wiązania^węgla1, większość wiązania^azotu2 i produkcję setek milionów ton węglowodorów^{3 w} oceanach rocznie. Chloroplasty, organelle odpowiedzialne za fotosyntezę w algach eukariotycznych i roślinach, prawdopodobnie wyewoluowały z cyjanobakterii, która została pochłonięta przez organizm gospodarza⁴. Sinice okazały się użytecznymi organizmami modelowymi do badania fotosyntezy^{, transportu} elektronów5 i szlaków biochemicznych, z których wiele jest zachowanych w roślinach. Ponadto sinice są coraz częściej wykorzystywane do produkcji żywności, biopaliw⁶, energii elektrycznej⁷ i związków przemysłowych⁸ ze względu na ich wysoce efektywne przekształcanie wody i CO₂ w biomasę przy użyciu energii słonecznej⁹ . Wiele gatunków może być uprawianych na gruntach nieornych z minimalną ilością składników odżywczych i wody morskiej, co sugeruje, że sinice mogą być potencjalnie uprawiane na dużą skalę bez wpływu na produkcję rolną. Niektóre gatunki są również źródłem produktów naturalnych, w tym związków przeciwgrzybiczych, przeciwbakteryjnych i przeciwnowotworowych^10,11.

Zdolność do generowania mutantów jest kluczem do zrozumienia fotosyntezy, biochemii i fizjologii cyjanobakteryjnych, a także niezbędna do rozwoju szczepów do celów przemysłowych. Większość opublikowanych badań generuje genetycznie zmodyfikowane szczepy poprzez wprowadzenie kasety oporności na antybiotyki w miejscu zainteresowania. Ogranicza to liczbę mutacji, które mogą zostać wprowadzone do szczepu, ponieważ tylko kilka kaset oporności na antybiotyki jest dostępnych do stosowania u cyjanobakterii. Szczepy zawierające geny nadające oporność na antybiotyki nie mogą być wykorzystywane do produkcji przemysłowej w otwartych stawach, która prawdopodobnie będzie jedynym opłacalnym sposobem produkcji biopaliw i innych produktów o niskiej wartości¹². Pokolenie nieoznakowanych mutantów pokonuje te ograniczenia. Nieoznaczone mutanty nie zawierają obcego DNA, chyba że są celowo włączone, i mogą być manipulowane wiele razy. W związku z tym możliwe jest wygenerowanie dowolnej liczby zmian w szczepie. Ponadto można zminimalizować wpływ biegunowy na geny znajdujące się za miejscem modyfikacji, co pozwala na bardziej precyzyjną modyfikację organizmu¹³.

Aby wygenerować zmutowane szczepy, najpierw konstruowane są plazmidy samobójcze zawierające dwa fragmenty DNA identyczne z regionami w chromosomie cyjanobakteryjnym flankującym gen, który ma zostać usunięty (określane jako regiony flankujące 5' i 3'). Dwa geny są następnie wprowadzane między te flankujące regiony. Jeden z nich koduje białko oporności na antybiotyki; drugi koduje SacB, który wytwarza lewansukrazę, związek nadający wrażliwość na sacharozę. W pierwszym etapie procesu generowane są oznaczone mutanty, czyli szczepy zawierające jakieś obce DNA. Konstrukt plazmidowy jest mieszany z komórkami sinicowymi, a DNA jest naturalnie pobierane przez organizm. Transformanty są wybierane poprzez wzrost na płytkach agarowych zawierających odpowiedni antybiotyk i zmutowany genotyp weryfikowany metodą PCR. Plazmidy samobójcze nie mogą replikować się w obrębie szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. W związku z tym wszelkie kolonie oporne na antybiotyki będą wynikać ze zdarzenia rekombinacji, w wyniku którego gen będący przedmiotem zainteresowania zostanie wstawiony do chromosomu. Aby wygenerować nieoznaczone mutanty, oznaczony mutant jest następnie mieszany z drugim plazmidem samobójczym zawierającym tylko obszary flankujące 5' i 3'. Jeśli jednak wymagana jest insercja obcego DNA, można użyć plazmidu składającego się z regionów flankujących 5' i 3' z kasetą zawierającą interesujące geny wstawione między te fragmenty DNA. Selekcja odbywa się poprzez wzrost na płytkach agarowych zawierających sacharozę. Ponieważ sacharoza jest śmiertelna dla komórek, gdy produkt genu sacB ulega ekspresji, jedynymi komórkami, które przeżywają, są te, w których wystąpiło drugie zdarzenie rekombinacji, w wyniku którego gen wrażliwości na sacharozę, oprócz genu oporności na antybiotyki, został rekombinowany z chromosomu do plazmidu. W wyniku wymiany rekombinacyjnej do chromosomu wprowadzane są regiony flankujące i wszelkie DNA między nimi.

Z powodzeniem wykorzystaliśmy te metody do generowania wielu mutacji chromosomowych w tym samym szczepie Synechocystis sp. PCC6803 (dalej określanym jako Synechocystis)^13,14, do wprowadzenia mutacji jednopunktowych do interesującego genu¹³ oraz do ekspresji kaset genowych. Chociaż generowanie nieoznaczonych nokautów zostało zademonstrowane przed naszymi pracami w Synechocystis^15,16, szczegółowa metoda, wspomagana wizualną prezentacją krytycznych kroków, nie jest publicznie dostępna. Tę samą metodę zastosowaliśmy również do generowania oznaczonych nokautów w innym modelu cyjanobakterii, Synechococcus sp. PCC7002 (zwanym dalej Synechococcus). Protokół ten zapewnia jasną, prostą metodę generowania mutantów oraz szybki protokół walidacji i przechowywania tych szczepów.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych

1. Przygotować pożywkę BG11 zgodnie z Castenholz, 1988¹⁷.
   1. Przygotować roztwory podstawowe 100x BG11, pierwiastków śladowych i żelaza (Tabela 1).
   2. Przygotować oddzielne roztwory surowca fosforanowego, zapasu Na₂CO₃ , buforu kwasu N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-2-aminoetanosulfonowego (TES) i_NaHCO3 (Tabela 1).
   3. Autoklawować zapasy fosforanów i Na₂CO_{3 .} Filtrująco-sterylizowany bufor TES i NaHCO₃ z filtrami 0,2 μm.
   4. Przygotować BG11 łącząc 976 ml wody, 10 ml 100x BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml bulionu żelazowego, a następnie umieścić roztwór w autoklawie. Po schłodzeniu tego roztworu do temperatury pokojowej dodać 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na₂CO₃ i 10 ml NaHCO₃ .
   5. W przypadku pożywki stałej BG11 dodać 15 g agaru i 700 ml wody do jednej kolby. Do drugiej kolby dodać 3 g Na₂S₂O₃, 226 ml wody, 10 ml 100x BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml bulionu żelazowego. Autoklaw obu roztworów. Po schłodzeniu tych roztworów do temperatury pokojowej połącz je i dodaj 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na₂CO₃ , 10 ml buforu TES i 10 ml NaHCO₃.
      Uwaga: Roztwory przygotowuje się osobno, aby uniknąć wytrącania się niektórych soli.
2. Do selekcji na sacharozie przygotuj 50% (w/v) roztwór sacharozy. Przefiltrować, wysterylizować roztwór za pomocą filtrów 0,2 μm i dodać do BG11 (100 ml 50% sacharozy do 900 ml BG11), aby uzyskać płytki BG11/5% sacharozy.
   Uwaga: Nie dodawaj NaHCO₃ do płytek agarowych z sacharozą BG11/5%. Dodaj Na₂CO₃ jak zwykle.
3. Do hodowli Synechococcus dodać 10 ml 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego, kwasu N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(2-etanosulfonowego) (HEPES) i 1 ml witaminy B₁₂ (Tabela 1) do 1 l pożywki BG11.
   Uwaga: Transformacja szczepów hodowanych w dostępnych na rynku pożywkach BG11 jest znacznie mniej wydajna niż w opisanych tutaj recepturach pożywek BG11 i dlatego nie jest zalecana.

2. Wzrost szczepów sinic

1. Hodować szczepy w stożkowych kolbach o maksymalnej objętości 50 ml o pojemności 100 ml i wstrząsać z prędkością 120 obr./min. Uszczelnij płytki BG11 za pomocą Parafilm i przebij trzy małe otwory z boku płyty, aby umożliwić wymianę gazową. Inkubować wszystkie szczepy w temperaturze 30 °C pod żarówkami fluorescencyjnymi w fotobioreaktorze przy natężeniu światła między 20-40 μmol fotonów ^{m-2 sec-1}.
2. Używaj najlepszych sterylnych technik. Radzić sobie ze wszystkimi szczepami sinic w okapie z przepływem laminarnym.
   Uwaga: Jest to szczególnie ważne, gdy szczepy są hodowane z pożywkami zawierającymi sacharozę, która może być łatwo zanieczyszczona.

3. Generowanie konstruktów plazmidowych

1. Zaprojektuj zestawy starterów, w tym wymagane miejsca enzymów restrykcyjnych, przy użyciu oprogramowania do projektowania starterów, takiego jak Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), w celu amplifikacji dwóch regionów ~1 kb 5' i 3' genu będącego przedmiotem zainteresowania. Zapoznaj się z sekwencją genomu gatunku sinic za pomocą Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase). Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze wszystkimi zastosowanymi tutaj podkładami. Podczas projektowania podkładów należy wziąć pod uwagę następujące czynniki:
   1. Upewnij się, że amplifikowane regiony obejmują regiony 5' i 3' genu, który zostanie zmutowany, np. Rysunek 1.
   2. Nie mutuj regionów międzygenowych, aby uniknąć niezamierzonej mutacji antysensownych i niekodujących RNA. Aby uzyskać informacje na temat generowania mutantów w Synechocystis, zapoznaj się z listą miejsc startowych transkrypcji udokumentowaną w Mitschke et al., 2011¹⁸, aby uniknąć mutacji antysensownych lub niekodujących RNA.
   3. Wybierając regiony flankujące, nie należy uwzględniać całej otwartej ramki odczytu sąsiednich genów, ponieważ ekspresja tych genów w Escherichia coli może zakłócać klonowanie.
2. Amplifikuj produkty metodą PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z instrukcjami producenta.
   Uwaga: Z naszego doświadczenia wynika, że ten enzym powoduje kilka błędów.
   1. Przygotuj 50 μl reakcji PCR zawierających bufor HF i 0, 1,5 lub 3 μl DMSO. Użyj 100 ng genomowego DNA na reakcję. Stosować program składający się z początkowego etapu denaturacji 98 °C przez 30 sekund, 35 rund 98 °C przez 10 sekund, 67 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund, a następnie końcowego etapu wydłużania 72 °C przez 5 minut. Zazwyczaj daje to spójne produkty.
3. Sprawdzić produkty PCR i próbki trawione enzymami endonukleazy pod kątem właściwej wielkości za pomocą elektroforezy żelowej. Uruchom 1% (w/v) żele agarozowe zawierające 0,02% (v/v) bromku etydyny przez 45 minut przy 100 V.
   UWAGA: Bromek etydyny jest potencjalnym mutagenem i należy się z nim obchodzić z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
4. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj również tego zestawu do oczyszczania fragmentów plazmidu, w tym kawałków wyciętych z żeli agarozowych. Elute oczyszczone DNA w 14 μl wody.
5. W przypadku etapów klonowania inkubować mieszaniny reakcyjne endonukleazy restrykcyjnej w temperaturze 37 °C przez >1 godzinę w całkowitej objętości 30 μl zgodnie z instrukcjami producenta.
6. W przypadku etapów ligacji należy podwiązywać fragmenty DNA w temperaturze pokojowej przez >1 godz. w całkowitej objętości 20 μl, zawierającej 5 μl oczyszczonego, strawionego plazmidu, 12 μl oczyszczonej, przefermentowanej insercji, 2 μl buforu i 1 μl ligazy.
7. Przygotować komórki transformacyjne Escherichia coli DH5α zgodnie z następującą metodą.
   1. Hoduj przez noc kulturę E. coli w 10 ml pożywki Luria Bertani (LB).
   2. Zaszczepić 400 ml LB w stożkowej kolbie o pojemności 1 l zawierającej 6 ml 1 M MgCl₂ (Tabela 1) 1 ml kultury na noc.
   3. Hoduj kulturę w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez około 4 godziny lub do momentu, gdy OD_{600 nm} osiągnie 0,4-0,6.
   4. Umieść komórki na lodzie na 1 godzinę.
   5. Wirować przy 2 800 x g przez 10 minut do osadzania komórek w temperaturze 4 °C.
   6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 160 ml roztworu A (tabela 1) i inkubować na lodzie przez 20 minut.
   7. Wirować przy 2 800 x g przez 10 minut do osadzania komórek w temperaturze 4 °C.
   8. Usunąć stężenie nadłatowe i ponownie zawiesić w 4 ml roztworu A + glicerol (Tabela 1).
   9. Przygotować 50 μl porcji, zamrozić w płynie N₂, przechowywać w temperaturze -80 °C.
   10. Wymieszać 5 μl mieszaniny ligacyjnej z 50 μl kompetentnych komórek i inkubować przez 1 godzinę na lodzie.
   11. Szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 90 sekund, a następnie inkubacja na lodzie przez 2 minuty.
   12. Dodać 950 μl pożywki LB (tabela 1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   13. Podwielokrotność 50 i 200 μl na płytkach z odpowiednim antybiotykiem, ampicyliną (100 μg/ml) i/lub kanamycyną (30 μg/ml).
       UWAGA: Zarówno kanamycyna, jak i ampicylina są toksyczne i należy się z nimi obchodzić z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
   14. Pobrać i inkubować pojedyncze kolonie w 2 ml pożywki LB zaszczepionej odpowiednim antybiotykiem.
8. Oczyść wszystkie plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów miniprep zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Wygeneruj plazmidy, w tym konkretnym przykładzie do wybijania genów cpcC1C2, zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Wzmocnij obszar flankujący 1,012 bp 5' (lewy fragment) za pomocą starterów cpcC1C2leftfor i cpcC1C2leftrev (patrz krok 3.2, Tabela 2). Usunąć niewielką ilość reakcji PCR i sprawdzić, czy produkt o właściwej wielkości został amplifikowany za pomocą elektroforezy żelowej (krok 3.3). Przetraw ten fragment i pUC19 za pomocą XbaI i BamHI (krok 3.5).
   2. Oczyścić oba preparaty (krok 3.4), podwiązać (krok 3.6), przekształcić (krok 3.7) i ustawić cztery płynne kultury o pojemności 2 ml LB z ampicyliną (100 μg/ml) z oddzielnych kolonii w celu oczyszczenia plazmidu za pomocą miniprepów (krok 3.8).
   3. Sprawdzić, czy fragment został wprowadzony do pUC19 poprzez mineralizację XbaI/BamHI i elektroforezę żelową (krok 3.3). Pasma 2,660 pz i 1,012 pz wskazują na prawidłowe wprowadzenie insertu do plazmidu.
   4. Wzmocnij obszar flankujący 1,016 bp 3' (prawy fragment) za pomocą starterów cpcC1C2rightfor i cpcC1C2rightrev (patrz krok 3.2, Tabela 2). Usunąć niewielką ilość reakcji PCR i sprawdzić, czy produkt o właściwej wielkości został amplifikowany za pomocą elektroforezy żelowej (krok 3.3). Przetraw ten fragment i pUC19 za pomocą SacI i EcoRI (krok 3.5).
   5. Oczyścić oba preparaty (krok 3.4), podwiązać (krok 3.6), przekształcić (krok 3.7) i ustawić cztery płynne kultury o pojemności 2 ml LB z ampicyliną (100 μg/ml) z oddzielnych kolonii w celu oczyszczenia plazmidu za pomocą miniprepów (krok 3.8).
   6. Sprawdź, czy fragment został wprowadzony do pUC19 poprzez mineralizację SacI/EcoRI (krok 3.5) i elektroforezę żelową (krok 3.3). Pasma 2,660 pz i 1,016 pz wskazują na prawidłowe wprowadzenie insertu do plazmidu.
      Uwaga: Tam, gdzie jest to możliwe, stosuje się stanowiska XbaI/BamHI do klonowania regionu 5' oraz SacI/EcoRI do klonowania regionu 3' do pUC19. Jeśli to możliwe, zawsze dołączaj miejsce BamHI na odwrotnym starterze dla regionu 5' lub przednim starterze dla regionu 3', aby zapewnić, że późniejsze etapy klonowania są łatwiejsze do wykonania.
   7. Sekwencjonuj obie wstawki, aby określić, czy sekwencja jest prawidłowa, używając starterów obejmujących miejsce wprowadzenia, np. M13 do przodu i M13 do tyłu (Tabela 2). Sekwencja musi być poprawna, aby zapewnić, że żadne błędy nie zostaną wprowadzone do obszarów flankujących.
   8. Wyciąć lewy fragment z pUC19 poprzez mineralizację XbaI/BamHI. Przetrawić prawy fragment pUC19 + za pomocą XbaI/BamHI (krok 3.5).
   9. Oczyść lewy fragment o długości 1,012 pz i prawy fragment pUC19 + o długości 3,676 pz z żelu agarozowego (krok 3.3) poprzez wycięcie DNA za pomocą ostrza skalpela.
   10. Oczyścić oba preparaty (krok 3.4), podwiązać (krok 3.6), przekształcić (krok 3.7) i ustawić cztery płynne kultury o pojemności 2 ml LB z ampicyliną (100 μg/ml) z oddzielnych kolonii w celu oczyszczenia plazmidu za pomocą miniprepów (krok 3.8).
   11. Sprawdzić, czy fragment został wprowadzony do pUC19 + prawy fragment poprzez trawienie XbaI/BamHI (krok 3.5) i elektroforezę żelową (krok 3.3). Pasma 3,676 pz i 1,012 pz wskazują na prawidłowe wprowadzenie wstawki do plazmidu (patrz to jako plazmid B).
   12. Wyciąć kasetę npt1/sacB z pUM24cm¹⁹ przez mineralizację BamHI. Trawienie plazmidu B za pomocą BamHI (krok 3.5).
       Uwaga: Kaseta npt1/sacB nie musi być oczyszczana z żeli agarozowych, ponieważ pUM24cm koduje białko nadające odporność na chloramfenikol. Dlatego, jeśli kolonie są hodowane na płytkach agarowych LB / ampicylina / kanamycyna, jedyną możliwą kombinacją, która doprowadzi do powstania odpornych kolonii, jest włączenie kasety npt1 / sacB do plazmidu B.
   13. Oczyścić oba preparaty (krok 3.4), podwiązać (krok 3.6), przekształcić (krok 3.7) i ustawić cztery płynne kultury LB o pojemności 2 ml z ampicyliną (100 μg/ml) i kanamycyną (30 μg/ml) z oddzielnych kolonii w celu oczyszczenia plazmidu za pomocą minipreparatów (krok 3.8).
   14. Sprawdzić, czy kaseta npt1/sacB została wprowadzona do plazmidu B poprzez trawienie BamHI (krok 3.5) i elektroforezę żelową (krok 3.3). Pasma 4,688 pz i 3,894 pz wskazują na prawidłowe wprowadzenie insertu do plazmidu (patrz to jako plazmid A).
   15. Alternatywnie, koniec kasety npt1 / sacB i sklonowanie do innego miejsca endonukleazy restrykcyjnej między lewym i prawym fragmentem plazmidu B. Kaseta npt1/sacB musi być sklonowana między lewym i prawym fragmentem.
       Uwaga: Jeśli wymagana jest ekspresja obcej kasety, należy ją wprowadzić między lewy i prawy fragment plazmidu B. Ten plazmid jest następnie używany w nieoznaczonych etapach nokautu.

4. Generacja oznaczonych mutantów Synechocystis i Synechococcus

1. Przygotuj świeżą hodowlę, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30-50 ml pożywki BG11. Hoduj kulturę przez 2-3 dni do OD_750nm = 0,2 do 0,6,
   Uwaga: Zazwyczaj pojedyncze kolonie są zbyt małe, aby można je było wykorzystać do inokulacji, a wystawienie pojedynczych komórek nawet na niskie poziomy światła spowoduje fotoinhibicję i selekcję mutantów odpornych na światło.
2. Odwirować 1-2 ml kultury o stężeniu 2 300 x g przez 5 minut i wyrzucić sklarowany nad osadem. Nie należy odwirowywać żadnych kultur sinic w ilości >2,300 x g, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek. Umyj granulkę raz za pomocą BG11 medium.
   Uwaga: Nie należy ponownie zawieszać komórek przez wirowanie, ponieważ może to spowodować utratę pilusów, które są niezbędne do wychwytu DNA. Zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.
3. Dodać pożywkę BG11 do końcowej objętości 100 μl. Przenieść komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml.
4. Dodaj 1 μg plazmidu A do komórek i wymieszaj, delikatnie wklepując. Dodać <10 μl plazmidu.
   Uwaga: Najlepiej, aby plazmid miał stężenie >100 ng/μl, ale stężenia niższe niż te są odpowiednie do pomyślnej transformacji.
5. Połóż probówki poziomo w inkubatorze. Inkubuj kultury przez 4-6 godz.
   Uwaga: Komórki można na krótko mieszać, stukając co 1-2 godziny, ale nie jest to konieczne. Próbki można umieszczać w inkubatorze z wytrząsaniem, chociaż nie poprawia to znacząco wydajności.
6. Rozprowadzić podwielokrotności mieszaniny hodowli komórkowej i plazmidowego DNA na płytkach agarowych BG11 bez antybiotyków. Zazwyczaj podwielokrotności o objętości 20 μl i 80 μl rozprowadza się na oddzielnych płytkach.
7. ~24 godziny później dodaj 2,5-3 ml 0,6% roztworu agaru w wodzie zawierającej kanamycynę (na 20 ml: 0,12 g agaru, 100 μl 100 mg/ml kanamycyny) do płytki agarowej. Schłodzić ten roztwór do temperatury ~42 °C i dodać do krawędzi płytki agarowej. Przechyl płytkę tak, aby roztwór utworzył równą warstwę "górnego agaru" na powierzchni.
8. Inkubować płytki agarowe przez dalszy okres czasu. Kolonie powinny być widoczne po około 7 dniach.
   Uwaga: Płytki agarowe można układać w stosy o wysokości 3 w inkubatorze. Zazwyczaj na jedną transformację uzyskuje się setki kolonii.
9. Smugować poszczególne kolonie na płytkach agarowych BG11 + kanamycyna (30 μg/ml). Podziel płytkę agarową na 6 sektorów i użyj wykałaczki z końcem, aby rozprowadzić kolonie na każdym pojedynczym sektorze. Uzyskanie pojedynczych kolonii nie jest ważne, tylko wzrost transformantów.
10. Potwierdź oznaczony nokaut metodą PCR przy użyciu polimerazy DNA Taq zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 2 μl MgCl₂ (25 mM) na reakcję.
    1. Usuń niewielką część komórek i przenieś do probówki zawierającej 50 μl wody i ~20 425-600 μm szklanych kulek. Wstrząsaj wibratorem przez 5 minut z prędkością ~2,000 obr./min. Wirować przy 15 700 x g przez 5 minut i użyć 5 μl supernatantu na 50 μl reakcji PCR.
       Uwaga: Nie należy ponownie zawieszać roztworu. Resztki komórek muszą pozostać na dnie rurki.
11. Weryfikowanie mutantów
    1. Zaprojektuj podkłady, które obejmują obszar nokautu, korzystając z oprogramowania do projektowania podkładów (takich jak Primer3). Zaprojektuj podkłady zaczynające się od ~200 pz po obu stronach obszaru nokautu.
       Uwaga: Startery do weryfikacji mutanta cpcC1C2 są przedstawione w tabeli 2 i są określane jako cpcC1C2for i cpcC1C2rev.
    2. Wzmacniać produkty za pomocą programu składającego się z początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, 35 rund w temperaturze 95 °C przez 1 minutę, 60 °C przez 1 minutę, 72 °C przez 1 minutę na kb sekwencji, a następnie końcowego etapu wydłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Dołącz kontrolę typu dzikiego. Zazwyczaj daje to spójne produkty.
    3. Zweryfikuj genotyp za pomocą elektroforezy żelowej. Oznaczone transformatory z nokautem pokażą pasmo ~4 kb (0,2 kb zarówno z lewego, jak i prawego fragmentu plus kasety npt1/sacB) oraz brak pasma typu dzikiego (rysunek 2).
       Uwaga: W niektórych przypadkach nie obserwuje się pasma ~4 kb w oznaczonym mutancie ze względu na duży rozmiar tego produktu PCR. Jeśli jednak nie zaobserwuje się pasma odpowiadającego oczekiwanej wielkości dzikiego typu, zazwyczaj jest to wyraźny nokaut.
12. Jeśli prążek typu dzikiego jest nadal obecny, ponownie nałóż szczep na świeżą płytkę agarową BG11 + kanamycyna (30 μg/ml) i powtórz PCR. Powtarzaj proces ponownego smugowania, aż mutant zostanie oddzielony, tak aby w reakcji PCR nie zaobserwowano prążka typu dzikiego.
    Uwaga: Zwiększenie ilości kanamycyny do stężenia 50 μg/ml, a następnie 100 μg/ml jest czasami niezbędne w celu pełnej segregacji oznaczonego mutanta.
13. Jeśli szczep wykazuje wyraźny profil mutanta za pomocą PCR, należy ponownie nałożyć smugi na świeżą płytkę agarową BG11 + kanamycyna (30 μg/ml). Użyj tego szczepu, aby wygenerować nieoznaczony nokaut.
    Uwaga: Protokół może być używany do generowania oznakowanych mutantów za pomocą tylko kasety oporności na antybiotyki. tj. poprzez wymianę kasety npt1/sacB na samą kasetę npt1 z pUC18K²⁰ pomiędzy lewym i prawym fragmentem.

5. Generacja nieoznaczonych mutantów Synechocystis

1. Ustawić świeżą hodowlę oznaczonego nokautu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30-50 ml pożywki BG11. Hoduj kulturę przez 2-3 dni do OD_750nm = 0,2 do 0,6.
2. Odwirować 10 ml kultury o stężeniu 2 300 x g przez 5 minut i odrzucić sklarowany osad. Umyć raz BG11 medium.
   Uwaga: Nie należy ponownie zawieszać komórek przez wirowanie, ponieważ może to spowodować utratę pilusów, które są niezbędne do wychwytu DNA. Zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.
3. Dodać BG11 do końcowej objętości 200 μl. Przenieść komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml.
4. Dodaj 1 μg plazmidu B DNA do komórek i wymieszaj, delikatnie stukając.
5. Inkubować próbki przez 4-6 godzin. Ułożyć probówki poziomo w dół.
   Uwaga: Komórki można na krótko mieszać, stukając co 1-2 godziny, ale nie jest to konieczne. Próbki można umieszczać w inkubatorze z wytrząsaniem, chociaż nie poprawia to wydajności.
6. Dodać 1,8 ml pożywki BG11 i inkubować próbki przez łącznie 4 dni z wytrząsaniem. Jest to wystarczający czas, aby umożliwić rekombinację w wielu kopiach chromosomów.
7. Płytki podwielokrotności mieszaniny transformacyjnej na płytkach z agarem BG11/5% sacharozy. Płytka 50 μl, 10 μl i 1 μl na płytkę agarową. Jeśli na wszystkich tych płytkach agarowych pojawi się trawnik kolonijny, rozcieńczyć roztwór dalej i porcjować na świeżych płytkach. Kolonie powinny być widoczne po około 7 dniach.
8. Najpierw nałacz 30-50 pojedynczych kolonii na płytkach agarowych BG11 + kanamycyna (30 μg/ml), a następnie na płytkach agagowych BG11/5% sacharozy, używając wykałaczki z końcem. Wszelkie bakterie, które rosną na płytkach BG11/5% sacharozy, ale nie na płytkach BG11 + kanamycyna, są potencjalnymi nieoznaczonymi nokautami. Bakterie rosnące na obu płytkach mogą być odporne na sacharozę z powodu mutacji w genie sacB.
9. Sprawdź nieoznaczone nokauty przy użyciu tych samych starterów i metody, które zostały użyte do sprawdzenia oznaczonych nokautów. np. cpcC1C2for i cpcC1C2rev (Tabela 2) w celu sprawdzenia nieoznaczonego nokautu cpcC1C2. Nieoznaczone nokautowanie pokaże prążek na żelu agarozowym odpowiadający rozmiarowi typu dzikiego minus usunięty obszar (ryc. 2).
10. Jeśli szczep wykazuje nieoznaczony profil mutanta za pomocą PCR (krok 4.11.2) i elektroforezy żelowej (Figura 2), należy ponownie nałożyć smugi na świeżą płytkę agarową BG11 bez antybiotyków.

6. Długoterminowe przechowywanie szczepów

1. Stwórz świeżą kulturę szczepu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30-50 ml pożywki BG11. Hoduj kulturę przez 3-4 dni do OD_750nm = 0,4 do 0,7.
2. Umyj komórki raz BG11 i ponownie zawieś w ~2 ml BG11.
3. Dodać 0,8 ml skoncentrowanych komórek do jednej probówki. Następnie dodaj 0,2 ml 80% wysterylizowanej glicerolu filtrowanego.
4. Opcjonalnie: Dodaj 0,93 ml skoncentrowanych komórek do innej probówki. Dodać 0,07 ml DMSO do tej probówki.
   UWAGA: DMSO jest toksyczny i należy się z nim obchodzić z odpowiednią ochroną.
5. Obie probówki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby ożywić szczepy, wyjmij rurkę i zeskrob niektóre komórki wykałaczką na płytkę agarową bez antybiotyków. Rozprowadź jak zwykle za pomocą sterylnej pętli.

Ryc. 1: Budowa plazmidu do generowania oznaczonych i nieoznaczonych nokautów, np. cpcC1 i cpcC2 w Synechocystis. (A) Region genomu Synechocystis, w którym znajdują się (B) cpcC1 i cpcC2 oraz sąsiednie geny. Na czarno zaznaczony jest region genomu, który ma zostać usunięty w mutancie. (C) Miejsca genomu, które są amplifikowane metodą PCR. Obszar flankujący 5' (zaznaczony na niebiesko) i obszar flankujący 3' (zaznaczony na czerwono) są amplifikowane miejscami endonukleazy restrykcyjnej do klonowania do pUC19. Obszar flankujący 5' (lub 3') jest wycinany z pUC19 i wprowadzany do plazmidu obszaru flankującego pUC19 + 3' (lub 5') w celu wytworzenia plazmidu B. (D) Kaseta npt1/sacB z pUM24 jest wycinana przez trawienie BamHI i umieszczana między regionami flankującymi 5' i 3' w celu wytworzenia plazmidu A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Konstrukcja plazmidu jest kluczowa dla pomyślnego generowania zarówno oznaczonych, jak i nieoznaczonych mutantów. Rycina 1 przedstawia przykład plazmidu A i B użytego do wygenerowania mutanta delecji w genach Synechocystis cpcC1 i cpcC2¹³. W każdym przypadku obszary flankujące 5' i 3' wynoszą około 900-1000 pz. Można zastosować zredukowane regiony flankujące, chociaż najmniejszy, który z powodzeniem przetestowaliśmy, wynosił około 500...

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi etapami generowania nieoznakowanych mutantów są: 1) staranne projektowanie plazmidu, aby zapewnić, że zmieniony zostanie tylko region docelowy; 2) zapewnienie, że próbki pozostają akseniczne, zwłaszcza gdy są hodowane na sacharozy; 3) posiew przekształconych komórek w celu wytworzenia znaczonego mutantu początkowo na płytkach agarowych BG11 bez antybiotyków, a następnie dodanie agaru i antybiotyków 24 godziny później; 4) hodowla oznakowanych mutantów przez 4 pełne dni przed posiewem na płytkach BG...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
kwas cytrynowy	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	Sigma	331058
CuSO4.5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2.6H2O	Sigma	239267
Cytrynian żelazowo-amonowy	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
cyjanokobalamina	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Agar bakto	BD	214010
Sacharoza	Fisher	SUC001
Szalka Petriego 90 mm potrójnie wentylowana	Greiner	633185
0,2 µ m filtry	Sartorius	16534
100 ml kolby stożkowe	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  m	Bemis	FIL003
Phusion polimeraza DNA o wysokiej wierności	Phusion	F-530
Agaroza	Melford	MB1200
zestaw do oczyszczania DNA	MoBio	12100-300
Endonukleazy restrykcyjne	Ligaza NEB
T4	Thermo Scientific	EL0011
Bulion Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Siarczan kanamycyny	Sigma	60615
Ampicylina	Sigma	A9518
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu GeneJET	Thermo Scientific	K0503
14 ml probówka okrągłodenna	BD falcon	352059
Polimeraza DNA GoTaq G2 Flexi	Promega	M7805
425-600 µ m koraliki szklane	Sigma	G8772
Glicerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Żarówki fluorescencyjne	Gro-Lux	69
HT multitronowy fotobioreaktor	Infors