Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54002

⸱

13 maja 2016

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Streszczenie

Trwałe zwłóknienie wątroby z kontynuacją nagromadzenia białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) powoduje utratę kompetencji komórkowych wątroby, co prowadzi do marskości wątroby z dysfunkcją komórek wątroby. Wśród wielu urazów wątroby, nadużywanie alkoholu może prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, w tym niewydolności wątroby i raka wątrobowokomórkowego. Niemniej jednak tożsamość endogennych źródeł komórkowych, które regenerują hepatocyty w odpowiedzi na alkohol, nie została odpowiednio zbadana. Co więcej, niewiele badań skutecznie modelowało regenerację hepatocytów na podstawie uszkodzeń wywołanych alkoholem. Niedawno informowaliśmy o ustaleniu modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem (EtOH) u danio pręgowanego, u którego komórki progenitorowe wątroby (HPC) spowodowały powstanie hepatocytów po prawie całkowitej utracie hepatocytów w obecności bodźca fibrogennego. Co więcej, dzięki badaniom chemicznym wykorzystującym ten model zidentyfikowaliśmy wiele małych cząsteczek, które usprawniają regenerację hepatocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy procedury mające na celu opracowanie zwłóknieniowego modelu wątroby indukowanego przez EtOH oraz przeprowadzenie chemicznych badań przesiewowych przy użyciu tego modelu u danio pręgowanego. Protokół ten będzie kluczowym narzędziem do nakreślenia molekularnych i komórkowych mechanizmów regeneracji hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie. Co więcej, metody te ułatwią potencjalne odkrycie nowych strategii terapeutycznych w przewlekłych chorobach wątroby in vivo.

Wprowadzenie

Pomimo niezwykłej zdolności regeneracyjnej hepatocytów1, które są głównym typem komórek miąższowych wątroby, przewlekła niewydolność wątroby upośledza tę zdolność, prowadząc do regeneracji zależnej od komórek progenitorowych wątroby (HPC)2.

Przewlekłe uszkodzenie wątroby jest głównie wynikiem nadużywania alkoholu, przewlekłego zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV)3 i niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD)4. Prowadzi to do trwałego zwłóknienia wątroby, które jest związane z gromadzeniem się białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Utrzymująca się akumulacja ECM zniekształca nienaruszoną architekturę wątroby poprzez tworzenie włóknistej tkanki bliznowatej5, co w konsekwencji prowadzi do marskości wątroby z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Podjęto wiele prób złagodzenia odpowiedzi zwłóknieniowej, głównie poprzez skupienie się na hamowaniu cytokin profibrogennych i aktywowanych miofibroblastów6. Ten ostatni pochodzi głównie z komórek gwiaździstych wątroby (HSC), głównych komórek wątrobowych niemiąższowych odpowiedzialnych za tworzenie blizn wątrobowych4. Niemniej jednak terapie regeneracyjne, które stymulują endogenne źródła komórkowe, w tym HPC, do regeneracji hepatocytów w obecności utrzymujących się urazów fibrogennych, czekają na dalsze badania.

Wiele eksperymentalnych modeli zwłóknienia wątroby zostało opisanych u ssaków. Powtarzające się wstrzykiwanie czterochlorku węgla (CCl4) jest szeroko stosowane do wywoływania zwłóknienia wątroby w modelach mysich i szczurzych7. W połączeniu z dietą wysokotłuszczową (HF), alkohol doprowadził do znacznego zwiększenia ekspresji genów profibrogennych i zwłóknienia wątroby8. Podczas gdy stłuszczenie (nagromadzenie lipidów) wynika z ostrej ekspozycji na alkohol, sprawia, że wątroba jest podatna na cięższe uszkodzenie wątroby9.

Danio rerio, danio pręgowany, stał się nieocenionym modelem kręgowców do badania regeneracji. Chociaż inne niższe kręgowce, takie jak traszki i aksolotle, mają niezwykłą zdolność do regeneracji, danio pręgowany ma przewagę nad innymi systemami modelowymi w odniesieniu do manipulacji genami i strategii wizualizacji potrzebnych do manipulowania potencjalnymi czynnikami regeneracyjnymi10. Danio pręgowany stanowi również atrakcyjny model kręgowców do badania alkoholowej choroby wątroby (ALD) poprzez proste dodanie etanolu (EtOH) do ich wody. Ostra ekspozycja na EtOH larw i dorosłych danio pręgowanych powodowała stłuszczenie wątroby11-13. Gdy dorosłe danio pręgowane otrzymały przedłużoną ekspozycję na EtOH, zaobserwowano odkładanie się kolagenu z regulacją w górę genów związanych ze zwłóknieniem14. Istnieje jednak potrzeba opracowania modeli do badania regeneracji wątroby w odpowiedzi na EtOH jako bodziec fibrogenny.

Ostatnio opracowaliśmy model zwłóknieniowej wątroby indukowanej przez EtOH u danio pręgowanego15. Połączyliśmy system ablacji genetycznej specyficzny dla hepatocytów z leczeniem EtOH u larw i dorosłych danio pręgowanych. Wygenerowaliśmy dwie linie transgeniczne, Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1 i Tg(fabp10a:mCherry-NTR)gt2, w których nitroreduktaza E.coli (NTR) jest połączona odpowiednio z cyjanem i białkiem fluorescencyjnym mCherry, pod kontrolą specyficznego dla hepatocytów białka wiążącego kwasy tłuszczowe 10a, zasady wątroby (fabp10a) promotora. W tym systemie NTR przekształca nietoksyczny prolek metronidazol (MTZ) w czynnik sieciujący między niciami DNA16, indukując jawną śmierć hepatocytów. Korzystając z tego modelu, wykazaliśmy, że populacja komórek wątrobowych, które reagują na sygnalizację Notch, przekształciła się w hepatocyty w przypadku prawie braku hepatocytów i w nadmiarze ECM. Oznaczyliśmy te komórki jako HPC. Ponadto, za pomocą chemicznych badań przesiewowych, zidentyfikowaliśmy małocząsteczkowe aktywatory sygnalizacji Wnt i inhibitory sygnalizacji Notch, które wspomagają regenerację hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie. Dlatego nasz zwłóknieniowy model wątroby u danio pręgowanego stanowi doskonały system badań przesiewowych w porównaniu z systemem badań przesiewowych opartym na hodowlach komórkowych lub ssakach. Jest to system in vivo, który przynosi znaczne korzyści w zakresie oszczędności kosztów i czasu. Tutaj opisujemy szczegółowe procedury tworzenia zwłóknienionego modelu wątroby indukowanego przez EtOH oraz wykonywania chemicznych badań przesiewowych przy użyciu tego modelu u danio pręgowanego. Ponadto przeprowadzono analizy przebiegu w czasie, aby zbadać, w jaki sposób zachodzi regeneracja hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie. Protokół ten będzie stanowił nieocenione narzędzie do badania mechanizmów i strategii poprawy regeneracji hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Danio pręgowany został wyhodowany i wyhodowany przy użyciu standardowego protokołu, który spełnia kryteria National Institutes of Health i został zatwierdzony przez Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować 20 l wody z jaj (używanej zamiennie z "pożywką dla zarodków") w celu utrzymania zarodka/larwy danio pręgowanego. Rozpuść 1,5 gCaSO4 i 6 g rozpuszczalnej soli oceanicznej w 250 ml wody destylowanej. Wlać do gąsiora wypełnionego 20 l wody destylowanej i wymieszać.
  2. Przygotować 1 l roztworu podstawowego 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) (20x). Rozpuścić 0,6 g proszku PTU w 1 l wody destylowanej. Dodać 1 ml roztworu podstawowego na 20 ml pożywki zarodkowej do końcowego stężenia 0,003% jako roztwór roboczy.
    UWAGA: PTU może powodować toksyczność ogólnoustrojową po narażeniu przez drogi oddechowe lub skórę. Przygotować i stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
  3. Przygotować 1 l roztworu podstawowego metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy) (20x). Rozpuść 4 g trikainy w proszku w wodzie destylowanej. Doprowadzić pH do 7, dodając 1 M bufor Tris (pH 9) i doprowadzić końcową objętość do 1 l wodą destylowaną. Podwielokrotność rozpuścić w 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić przed użyciem.
    UWAGA: Trikaina może powodować utratę czucia. Przygotować i stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
  4. Przygotować 100 ml larwalnego roztworu roboczego metronidazolu (MTZ). Przygotować świeży 15 mM roztwór MTZ, rozpuszczając 0,25 g proszku MTZ w 0,1% dimetylosulfotlenku (DMSO) w 100 ml pożywki zarodkowej. Całkowicie rozpuść proszek MTZ przez energiczne potrząsanie. Przygotuj świeży roztwór MTZ i użyj folii aluminiowej, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji MTZ.
    UWAGA: MTZ może powodować podrażnienia. Przygotować i stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.
  5. Przygotować 100 ml roztworu roboczego etanolu z larw/metronidazolu (EtOH/MTZ). Przygotuj świeży roztwór MTZ i użyj folii aluminiowej, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji MTZ. Dodać 1,5 ml 100% etanolu do 100 ml roztworu MTZ do końcowego stężenia 1,5% tuż przed użyciem.
  6. Przygotować 500 ml roztworu roboczego MTZ dla dorosłych. Przygotować świeży roztwór MTZ o stężeniu 10 mM, rozpuszczając 0,83 g proszku MTZ w 0,1% DMSO w 500 ml wody systemowej. Całkowicie rozpuść proszek MTZ przez energiczne potrząsanie. Przygotuj świeży roztwór MTZ i użyj folii aluminiowej, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji MTZ.
  7. Przygotować 1 l buforu PEM. Rozpuść 30,2 g FAJKI, 0,74 g EGTA i 0,12 gMgSO4 w wodzie destylowanej. Dostosuj pH do 7 za pomocą NaOH. Doprowadzić końcową objętość do 1 l wodą destylowaną.

2. Przygotowanie larw danio pręgowanego

  1. Ustaw kojarzenie [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]15,17 dorosłe danio pręgowane z Tg(hand2:EGFP)pd24 13 dorosłych zebry w zbiornikach godowych. Użyj dzielników, aby przeprowadzić krycie na czas.
  2. Usuń przegrodę następnego ranka i pozwól rybom łączyć się w pary bez zakłóceń. Zbierz zarodki 2 godziny później, odcedzając wodę systemową i przenosząc zarodki na 100-milimetrowe szalki Petriego z pożywką dla zarodków.
  3. Trzymaj nie więcej niż 100 zarodków na szalce Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń niezapłodnione jaja za pomocą szklanej pipety. Hodować zarodki w temperaturze 28 °C i dodać fenylotiomocznik (PTU) do końcowego stężenia 0,003% po 10 godzinach po zapłodnieniu (hpf), aby zahamować rozwój pigmentu.

3. Leczenie etanolem, metronidazolem i regeneracja wątroby u larw danio pręgowanego

  1. Przygotować świeży roztwór EtOH, dodając etanol do pożywki zarodkowej do końcowego stężenia 1,5%. Nie dodawaj PTU.
  2. Traktować zarodki 20 ml roztworu etanolu na szalkę Petriego od 56 do 80 hpf. Przykryj szalki Petriego folią, aby zapobiec parowaniu etanolu.
  3. Sortuj [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mWiśnia)jh11; Larwy Tg(hand2:EGFP)pd24] o podobnej wielkości wątroby, określonej przez ekspresję CFP, przy 80 hpf. Nie należy używać trikainy podczas sortowania larw poddanych działaniu EtOH, ponieważ spowoduje to wysoką śmiertelność przy kolejnym leczeniu EtOH/MTZ. Utrzymuj posortowane larwy w zagęszczeniu 30 zarodków na szalkę Petriego.
  4. Przygotować świeże 15 mM MTZ w pożywce zarodkowej w 0,1% DMSO. Dodaj odpowiednią ilość EtOH do roztworu MTZ, aby uzyskać końcowe stężenie 1,5%. Inkubować larwy w 20 ml roztworu EtOH/MTZ na szalkę Petriego przez 24 godziny w temperaturze 28 °C. Przykryć szalki Petriego folią w celu utrzymania stężenia EtOH oraz folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
  5. Pod koniec leczenia należy usunąć roztwór EtOH/MTZ, przenosząc larwy na nowe szalki Petriego ze świeżą pożywką dla zarodków. Umyj larwy 3 razy pożywką dla zarodków i trzymaj je w 20 ml pożywki dla zarodków bez PTU.
  6. Aby oddzielić larwy z prawie całkowitą ablacją hepatocytów, obserwuj fluorescencję pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem CFP przy powiększeniu 80X. Udana ablacja skutkuje minimalną fluorescencją CFP w wątrobie i znacznie zmniejszoną objętością wątroby.
  7. Aby uniknąć śmierci larw poddanych działaniu EtOH/MTZ, nie należy używać Trikainy do sortowania. Utrwalić larwy do barwienia immunologicznego (patrz sekcja 5) lub przechowywać posortowane larwy na szalkach Petriego w temperaturze 28 °C w celu dalszych analiz.

4. Ekrany chemiczne u larw danio pręgowanego leczonych EtOH/MTZ

  1. Przynieść 96-dołkowe płytki zawierające 10 mM zapasów chemicznych do DMSO (szczegółowe informacje na temat komercyjnych bibliotek chemicznych znajdują się na liście materiałów) z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Przykryj folią aluminiową, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji chemikaliów. Rozmrozić roztwory podstawowe w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc.
  2. Przygotować roztwory chemiczne, rozcieńczając 10 mM roztwory podstawowe z pożywką zarodkową do końcowego stężenia 50 μM (na płytkach 96-dołkowych: badanie wstępne; w probówkach 1,5 ml: ponowne badanie). Larwy kontrolne traktowano równymi stężeniami DMSO w pożywce zarodkowej.
  3. Przenieś larwy z prawie całkowitą ablacją hepatocytów, które potraktowano 1,5% EtOH / 15 mM MTZ i posortowano w sposób opisany powyżej, na 96-dołkowe (wstępne badanie) lub 24-dołkowe (ponowne testowanie) płytki wstępnie wypełnione pożywką zarodkową o gęstości 5 larw na dołek. Użyj zduplikowanych studzienek dla każdej substancji chemicznej.
  4. Usunąć pożywkę z zarodków i dodać 250 μl (płytki 96-dołkowe) lub 500 μl (płytki 24-dołkowe) roztworów chemicznych do każdego dołka. Przykryj płytki folią aluminiową i traktuj larwy przez 50 godzin w temperaturze 28 °C. Codziennie sprawdzaj larwy nasączone chemikaliami i usuwaj martwe larwy z poszczególnych studzienek.
  5. Pod koniec obróbki chemicznej należy obserwować liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem CFP w powiększeniu 80X. Sfotografować żywe larwy wykazujące zwiększoną lub zmniejszoną liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP za pomocą aparatu cyfrowego w celu dokumentacji.
  6. Zachować larwy przez wiązanie formaldehydu do obrazowania konfokalnego, jak opisano w punkcie 5.
  7. W celu ponownego zbadania substancji chemicznych ułatwiających regenerację hepatocytów w początkowym badaniu przesiewowym, należy zbadać ich siłę działania przy wyższych i niższych stężeniach, aby znaleźć najbardziej skuteczne stężenie zgodnie z procedurami opisanymi w punktach 4.1-4.5 ("ponowne badanie").

5. Fiksacja larw danio pręgowanego, barwienie immunologiczne i obrazowanie konfokalne

  1. Znieczulenie larw należy dodać Trikainę do końcowego stężenia 0,02%. Przenieść 10-15 larw do probówki o pojemności 1,5 ml i przemyć raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usunąć PBS i dodać 1 ml świeżo przygotowanego 2% formaldehydu do buforu PEM w celu ustalenia O/N na poziomie 4 °C.
    UWAGA: Formaldehyd powoduje podrażnienie i jest znany jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Uchwyt w dygestoriach chemicznych.
  2. Roztwór utrwalający należy odpowiednio wyrzucić, a następnie przemyć 3 razy PBS w temperaturze pokojowej (RT). Utrwalone larwy można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do kilku dni. Szybkie przejście do następnego kroku daje lepsze wyniki barwienia immunologicznego.
  3. Ostrożnie usuń żółtko i skórę pokrywającą obszar wątroby za pomocą kleszczy #55 pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Przepuszczalność i blokowanie larw w buforze blokowym (4% albuminy surowicy bydlęcej i 0,3% Triton X-100 w PBS) O/N w temperaturze 4 °C.
  5. Inkubować z króliczym przeciwciałem anty-Kolagen I w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy przez 15 minut za każdym razem buforem do przemywania (0,3% Triton X-100 w PBS).
  6. Inkubować z AlexaFluor 647 sprzężonym przeciwciałem przeciwko królikowi osła w rozcieńczeniu 1:200 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy przez 15 minut każdy z buforem do mycia. Następnie umyj raz PBS.
  7. Delikatnie przenieś larwy na szklane szkiełka za pomocą szklanej pipety i ustaw zamocowane larwy lewą boczną stroną skierowaną do góry. Usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczek Kimwipes. Dodaj kroplę podłoża montażowego i uszczelnij szkło nakrywkowe lakierem do paznokci. Zdecydowanie zaleca się natychmiastowe wykonanie obrazowania konfokalnego.
  8. Użyj systemu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejny 40X/1.3 do robienia zdjęć. Użyj siły lasera na poziomie 20-50%. Przechwytywanie obrazów stosu Z w odstępach co 1 μm.

6. Przygotowanie dorosłego danio pręgowanego

  1. Ustaw kojarzenie [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]15,17 dorosłe danio pręgowane w zbiornikach godowych. Zbierz zarodki następnego ranka, odcedzając wodę systemową i przenosząc zarodki na 100-milimetrowe szalki Petriego z pożywką dla zarodków.
  2. Trzymaj nie więcej niż 100 zarodków na szalce Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń niezapłodnione jaja za pomocą szklanej pipety. Hoduj zarodki w temperaturze 28 °C i dodaj PTU do końcowego stężenia 0,003% po 10 hpf, aby zahamować rozwój pigmentu.
  3. Przy 4 dpf użyj Trikainy do znieczulenia larw i sortowania [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11] larwy. Wypłucz Trikainę, kilkakrotnie zmieniając pożywkę na świeżą pożywkę zarodkową. Pozwolić larwom dojść do siebie w temperaturze 28 °C, aż osiągną normalną częstość akcji serca wynoszącą 120–180 uderzeń na minutę18.
  4. Podnieś posortowane larwy do wieku 6-12 miesięcy w oparciu o standardową procedurę19.

7. Etanol, leczenie metronidazolem i regeneracja wątroby u dorosłych danio pręgowanych

  1. Transfer w wieku 6-12 miesięcy [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11] dorosłego danio pręgowanego do krycia zbiorników za pomocą sieci. Utrzymuj ryby w zagęszczeniu nie większym niż 10 ryb na zbiornik.
  2. Przygotować świeży roztwór EtOH, dodając EtOH do wody systemowej do końcowego stężenia 1%. Dorosłe ryby należy potraktować 500 ml roztworu EtOH w każdym zbiorniku i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28 °C.
  3. Codziennie przenoś dorosłe ryby do świeżego roztworu EtOH, odpowiednio wyrzucaj martwe ryby jako zagrożenie biologiczne. Traktuj zwierzęta w sposób ciągły przez 72 godziny przed podaniem MTZ.
  4. Przygotować świeży roztwór 10 mM MTZ w wodzie systemowej w 0,1% DMSO. Roztwór MTZ należy wstępnie ogrzać w inkubatorze o temperaturze 28 °C. Potraktuj ryby 500 ml roztworu MTZ w 1 litrowym zbiorniku krzyżowym przez 8 godzin w temperaturze 28 °C, chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
  5. Podczas zabiegu należy przestrzegać co godzinę i natychmiast usuwać martwe ryby. Usuń martwe ryby w odpowiedni sposób jako zagrożenie biologiczne. Pod koniec zabiegu MTZ należy wypłukać MTZ, dwukrotnie przenosząc zwierzęta do świeżej wody z układu.
  6. Pozwolić zwierzętom na powrót do zdrowia i utrzymać je w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Ryby należy codziennie karmić i przenosić do wody w systemie słodkim, aż do momentu przeprowadzenia analiz.

8. Fiksacja wątroby dorosłego danio pręgowanego, barwienie immunologiczne i obrazowanie konfokalne

  1. Dorosłe ryby znieczulić 0,02% trikainą i poddać eutanazji w lodowatej wodzie przez 15 minut. Osusz rybę na ręczniku papierowym i połóż na macie sekcyjnej.
  2. Odsłoń narządy żołądkowo-jelitowe, usuwając skórę i mięśnie, jak opisano wcześniej20. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i leżący pod nią mięsień wzdłuż brzucha od płetwy odbytowej do wieczka, a następnie z tyłu wzdłuż boku ryby z powrotem do płetwy odbytowej.
  3. Umieść rybę w stożkowej tubie o pojemności 15 ml i umyj raz PBS. Usunąć PBS i dodać 4 ml świeżo przygotowanego 2% formaldehydu do buforu PEM w celu ustalenia O/N w temperaturze 4 °C.
  4. Roztwór utrwalający należy właściwie wyrzucić i przemyć 3 razy PBS w temperaturze pokojowej at. Utrwalone próbki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Natychmiastowe przejście do następnego kroku daje lepsze wyniki barwienia immunologicznego.
  5. Wypreparuj całe jelito z wątrobą z jamy ciała ryby, przecinając przełyk. Osadź narządy żołądkowo-jelitowe z 4% niskotopliwą agarozą w formie do cięcia.
  6. Użyj wibratomu, aby pociąć próbki na przekroje poprzeczne w odstępach 50 μm w lodowatym PBS, zaczynając od przedniego końca. Przenieś skrawki na 6-dołkową płytkę z PBS za pomocą pędzla #1.
  7. Przepuszczalność i blokowanie odcinków w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C.
  8. Inkubować z króliczym przeciwciałem anty-Kolagen I w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy po 15 minut buforem do mycia.
  9. Inkubować z AlexaFluor 647 sprzężonym przeciwciałem przeciwko królikowi osła w rozcieńczeniu 1:200 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy po 15 minut buforem Wash i raz PBS.
  10. Delikatnie przenieś skrawki na szkiełka za pomocą pędzla #1. Usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczek Kimwipes, dodaj kroplę podłoża montażowego i uszczelnij szkło nakrywkowe lakierem do paznokci. Zdecydowanie zaleca się natychmiastowe wykonanie obrazowania konfokalnego.
  11. Użyj systemu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejny 40X/1.3 do robienia zdjęć. Użyj siły lasera na poziomie 20-50%. Przechwytywanie obrazów stosu Z w odstępach co 1 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia rozwój modelu włóknienia wątroby indukowanego EtOH u larw zebrafish. Aby zoptymalizować protokół ekspozycji larw zebrafish na EtOH, najpierw oceniono toksyczność EtOH. Larwy w 2,5 dniu po zapłodnieniu (dpf) poddano działaniu EtOH w stężeniach 1%, 1,5% lub 2% przez 24 h, po czym zastosowano jednoczesną 24-godzinną terapię EtOH/MTZ. Ekspozycja na 2% EtOH spowodowała wysoką śmiertelność, natomiast niemal wszystkie larwy poddane działaniu 1% EtOH lub mni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaobserwowaliśmy regenerację hepatocytów za pośrednictwem HPC w regenerujących wątrobach leczonych EtOH / MTZ, co sugeruje, że nawet w obecności znacznej ilości białek ECM, w tym fibrylarnego kolagenu typu I, HPC zachowują swoją zdolność do regeneracji jako hepatocyty. Leczenie wyłącznie MTZ nie zwiększyło znacząco odkładania się białek ECM, podczas gdy leczenie tylko EtOH nie indukowało aktywacji HPC15. Wykorzystując skojarzone leczenie EtOH/MTZ, byliśmy w stanie zbadać regenerację zwłóknieniowej wątroby ster...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z GTEC (2731336 i 1411318), NIH (K01DK081351) i NSF (1354837) dla C. H. S. Dziękujemy Alemowi Giorgisowi za krytyczną lekturę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan wapnia półwodny (CaSO4)AcrosAC385355000
siarczan magnezu (MgSO4)EMDMX0075
Kwas 1,4-piperazynodienonesulfonowy (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)-
N,N,N′,N′ Kwas -tetraoctowy (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EtanolSigma-AldrichE7023200-proof
FormaldehydFisher ScientificF79-500
Metronidazol (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)Sigma-AldrichP7629
ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina)Sigma-AldrichA5040
Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)AmrescoE404Rozpuścić jedną tabletkę w 100 ml wody destylowanej
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Albumina surowicy bydlęcejFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Niskotopliwy Agaroza AmrescoBP165
Biblioteka związków sygnalizacyjnych komórek macierzystychSelleck ChemicalsL210010  Kolba mM w bibliotece DMSO
ActiProbe-1KTimtecActiProbe-1K10  Zapas mM w DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Rozpuścić w DMSO do 10  mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Rozpuścić w DMSO do 10  mM
Przeciwciało anty-kolagenowe IAbcamab23730Stosować w stosunku 1:100 do barwienia immunologicznego, reaguje z rybami
AlexaFluor 647 Sondy molekularne przeciw królikom IgG (H+L) osłaA31573Stosować w stosunku 1:200 do barwienia immunologicznego
Podłoża montażowe (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm szalka PetriegoVWR25384-088
24-dołkowa talerzVWR10062-896
KleszczeFine Science Tools11255-20Dumont #55
Szkiełko szklaneVWR48312-00375x25 mm
Szkło osłonoweVWR48366-04518 mm
Folia plastikowaFisher Scientific22305654
Folia aluminiowaFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
WibrotomLeicaVT1000 S
Mikroskop stereoskopowyLeicaM80
Mikroskop epifluorescencyjnyLeicaM205 FA
Mikroskop ConfocolZeissLSM700

Bibliografia

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137(2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja hepatocyt w u danio pr gowanegokom rki progenitorowe w trobyprotok przesiewowy substancji chemicznychodk adanie kolagenu typu Imikroskopia epifluorescencyjnaanaliza obrazowania konfokalnegobia ko wi ce kwasy t uszczoweprotok leczenia MTZmodel w troby danio pr gowanego
Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.