Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

DOI:

10.3791/54004

⸱

9 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla trójwymiarowa (3D) jest bardziej fizjologicznie istotną metodą modelowania zachowania komórek in vitro niż hodowla dwuwymiarowa. Raki, w tym rak piersi, to złożone tkanki 3D złożone z komórek nabłonka raka i składników zrębu, w tym fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Jednak większość modeli raka piersi in vitro składa się tylko z komórek nabłonka raka, z pominięciem zrębu, a tym samym architektury 3D guza in vivo. Odpowiednie modelowanie 3D raka jest ważne dla dokładnego zrozumienia biologii, zachowania i odpowiedzi na terapię guza. Jednak czas trwania hodowli i objętość modeli 3D jest ograniczony dostępnością tlenu i składników odżywczych w kulturze. W tym miejscu pokazujemy metodę, w której komórki nabłonkowe raka piersi i fibroblasty zrębu są włączane do ECM w celu wygenerowania substytutu 3D raka piersi, który obejmuje zrąb i może być hodowany jako stała struktura 3D lub przy użyciu systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po przygotowaniu i początkowym okresie wzrostu, surogaty mogą być używane do przedklinicznych testów leków. Alternatywnie, komponenty komórkowe i macierzowe surogatu mogą być modyfikowane w celu rozwiązania różnych problemów biologicznych. Po posiewie surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę, w sposób podobny do postępowania z klinicznymi próbkami raka piersi, w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości obecnych komórek, gdzie systemy oprogramowania do analizy obrazu ImageJ i CellProfiler są stosowane do mikrofotografii przekrojów histologicznych surogatów w celu ilościowego określenia liczby komórek jądrzastych na obszarze. Można to wykorzystać jako wskaźnik zmiany liczby komórek w czasie lub zmiany liczby komórek wynikającej z różnych warunków wzrostu i leczenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) modele hodowlane, które dokładniej naśladują architekturę guza i mikrośrodowisko in vivo, są ważne dla badań mających na celu analizę złożonych interakcji między komórkami a ich mikrośrodowiskiem oraz testowanie skuteczności potencjalnych terapii. Wymiarowość guza wpływa na gradienty tlenu i składników odżywczych, jednorodność ekspozycji na leki, ciśnienie śródmiąższowe/przepływ krwi oraz architekturę 3D1-4. Obecność odpowiedniego mikrośrodowiska zrębu przyczynia się do wymiarowości guza i wpływa na sygnalizację komórka-ECM oraz sygnalizację parakrynną między komórkami zrębu a złośliwymi komórkami nabłonka. Wpływ wymiarowości guza i mikrośrodowiska na funkcję komórkową jest dobrze znany, przy czym oba czynniki zmieniają odpowiedź na lek1,3,5-8. Ponadto kinetyka wzrostu komórkowego, tempo metabolizmu i sygnalizacja komórkowa różnią się między kulturą dwuwymiarową (2D) a hodowlą w 3D, przy czym czynniki te wpływają na odpowiedź komórkową1,3,8-10.

In vitro, mikrośrodowisko zastępcze guza może być modulowane poprzez włączenie reprezentatywnych składników ECM i populacji komórek zrębu. Złośliwe komórki nabłonkowe są pod wpływem ECM i komórek zrębu związanych z rakiem w sposób synergiczny/ochronny, aby promować progresję nowotworu, lub w sposób hamujący, aby zahamować dalszą propagację guza5,6,10. W obu przypadkach zrąb może wpływać na odpowiedź terapeutyczną i dostarczanie leków poprzez sygnalizację parakrynną i/lub poprzez zwiększenie ciśnienia śródmiąższowego w guzie, co skutkuje zmniejszonym dostarczaniem leku1,6. Dlatego dodanie ECM i komórek zrębu do modeli przedklinicznych pomoże podsumować aspekty guza, których nie można dobrze modelować w hodowli 2D.

Tutaj opisana jest metoda tworzenia substytutów raka piersi, które zawierają rekapitulacyjne mikrośrodowisko, w tym składniki ECM i komórki zrębu, w objętości 3D. W raku piersi populacja komórek zrębu składa się głównie z fibroblastów związanych z rakiem (CAF), a ECM zrębu składa się w dużej mierze z kolagenu typu I z mniejszym udziałem składników macierzy, które znajdują się w błonie podstawnej, w tym lamininy i kolagenu typu IV1,4,11-13. Dlatego te składniki mikrośrodowiska raka piersi (tj. CAF, kolagen I i błona podstawna) zostały włączone do surogatów. Metoda ta może być stosowana do generowania stałych, nieperfundowanych substytutów 3D (rysunek 1A) lub może być dostosowana do włączenia perfuzji pożywki przez substytut za pośrednictwem systemu bioreaktora (rysunek 1B). Oba podejścia zostały opisane tutaj. Metoda ta może być również zmodyfikowana w celu uwzględnienia innych elementów zrębu, takich jak makrofagi związane z nowotworem, lub w celu modelowania innych guzów litych poprzez odpowiednie dostosowanie komponentów komórkowych i ECM.

Dla opisanego tutaj surogatu raka piersi, wykorzystaliśmy linię komórkową raka piersi MDA-MB-231 (231), CAF wcześniej wyizolowaną z ludzkiego raka piersi14, oraz ECM składający się z 90% kolagenu I (6 mg/ml) i 10% materiału błony podstawnej zredukowanego przez czynnik wzrostu (BM). Surogat jest hodowany w 8-dołkowym szkiełku komorowym (substytut stały) lub system bioreaktora jest wykorzystywany do zapewnienia ciągłej perfuzji składników odżywczych (perfekowany substytut). Można użyć dowolnego systemu bioreaktora perfuzyjnego, który może pomieścić objętość komórek zawierających ECM15. Jako przykład opisujemy przygotowanie substytutów tkanek w naszym systemie bioreaktora. Ten system został opracowany wewnętrznie i nie jest dostępny na rynku. Ponieważ skupiamy się tutaj na przygotowaniu i analizie substytutów tkanek 3D, nie wdaliśmy się w szczegółowe informacje dotyczące specyfiki produkcji i montażu naszego systemu bioreaktora. Szczegółowy opis tego systemu i jego rozwoju został jednak opublikowany16. W tym systemie bioreaktorów kanał przepływowy z polidimetylosiloksanu (PDMS) jest używany do przechowywania surogatu, który jest podtrzymywany przez piankę PDMS (utworzoną przy użyciu metod podobnych do tych opisanych przez Calcagnile i wsp.).17). Objętość ta jest penetrowana przez 4 mikrokanały (każdy o średnicy 400 μm), które są w sposób ciągły perfundowane przez pożywkę za pomocą pompy mikrofizjologicznej w celu dostarczenia tlenu i składników odżywczych do substytutu.

Właściwa analiza surogatów jest kluczowa, aby uzyskać istotne informacje na temat funkcji komórkowej w odpowiedzi na leczenie lub inne manipulacje. Surogaty można analizować różnymi metodami, w tym bezpośrednim obrazowaniem nienaruszonych substytutów za pomocą mikroskopii konfokalnej lub innych środków nieinwazyjnego obrazowania, pośrednią analizą komórkową poprzez oznaczanie kondycjonowanych pożywek lub perfugatu dla wydzielanych produktów lub analizę na skrawkach histologicznych po utrwaleniu i przetworzeniu na parafinę. Jednym z takich parametrów, który można ocenić na przekrojach histologicznych, jest gęstość komórek. Przedstawiamy jedno podejście do pomiaru gęstości komórek (tj. liczby komórek jądrzastych na obszar sekcji) przy użyciu półautomatycznych technik przetwarzania obrazu stosowanych do fotomikrofotografii zastępczych skrawków histologicznych barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). Gęstość komórek może być wykorzystana jako wskaźnik względnej zmiany liczby komórek w czasie lub wynikającej z różnych warunków wzrostu i zabiegów.

figure-introduction-1
Rysunek 1. 3D objętości i systemu bioreaktora. A) Schemat procesu generowania stałych substytutów 3D. U góry: karykatura przedstawiająca bryłę 3D zawierającą ECM (różowy), komórki raka nabłonkowego (żółty) i CAF (pomarańczowy); U dołu: widok z góry na szkiełko 8-dołkowe zawierające surogaty. B) Schemat procesu generowania perfuzjowanych surogatów 3D. U góry: rysunek objętości 3D z kanałami umożliwiającymi średnią perfuzję i zawierającymi ECM (różowy), komórki raka nabłonkowego (żółty) i CAF (pomarańczowy); Środek: obraz kanału przepływowego PDMS zawierającego piankę PDMS (strzałka), który ma być wstrzyknięty za pomocą ogniwa + ECM i przeniknięty przez druty ze stali nierdzewnej pokrytej polimerem (różowa strzałka) o średnicy 400 μm; U dołu: obraz kanału przepływowego PDMS zawierającego surogat i podłączonego do systemu bioreaktora, aby umożliwić ciągłą perfuzję medium (pompa perystaltyczna i zbiornik pożywki nie pokazano). C) Obrazy etapów przetwarzania zarówno dla stałych, jak i perfundowanych substytutów po hodowli. Po lewej: zdjęcie kriomoldu zawierającego żel do przetwarzania próbek i surogat; Środek: obraz bloku parafiny zawierającego utrwalony i przetworzony surogat; Po prawej: obraz szklanego preparatu z wycinkiem histologicznym surogatki wybarwionym H&E. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Składnik BM rozmrażać przez noc w temperaturze 4 °C na lodzie.
  2. Ciepłe podłoże do 37 °C. Aby wspomóc wzrost zarówno 231 komórek, jak i CAF, należy użyć zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    Uwaga: Użyte podłoże będzie zależeć od typu komórki i celów eksperymentalnych.
  3. Usunąć pożywkę z naczynia hodowlanego (10 cm) z prawie zlewającymi się 231 komórkami i dodać 1,5 ml trypsyny/EDTA. Inkubować przez 1–3 minuty w temperaturze 37 °C, monitorując pod kątem oderwania komórek. Gdy komórki zaczną się zaokrąglać i odchodzić od płytki, zatrzymaj reakcję, dodając 3 ml pożywki zawierającej surowicę. Odpipetować pożywkę i komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować pożywkę i komórki w temperaturze 150 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml pożywki.
  5. Policz liczbę komórek w objętości za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Żywotność komórek powinna być większa niż 90%.
  6. Powtórz ten proces z innymi typami komórek, które mają zostać uwzględnione w surogatze. W przypadku opisanego tutaj surogatu proces ten jest powtarzany z CAF.
  7. Określ odpowiednią objętość każdej zawiesiny komórek, aby uzyskać żądaną liczbę komórek.
    Uwaga: W przypadku opisanego tutaj substytutu stosuje się gęstość komórek 2,1 x 106 komórek na 100 μl ECM, przy stosunku komórek nabłonka do fibroblastów 2:1 (1,4 x 106 231 komórek i 7 x 105 CAF na 100 μl ECM). Ta gęstość komórek jest dobrym punktem wyjścia; Jednak optymalna gęstość komórek będzie zależeć od typu komórki, czasu trwania hodowli i celów eksperymentu.
  8. Umieścić odpowiednią objętość każdej zawiesiny komórkowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (jedna probówka dla każdego typu komórek). Odwirować pożywkę i komórki przy 150 x g przez 5 minut.
  9. Po odwirowaniu usunąć supernatant, ponownie zawiesić jeden typ komórek w wodzie o czystości do hodowli komórkowych (178,8 μl, patrz tabela 1), a drugi typ komórek w 10-krotnym DMEM (100 μl, patrz tabela 1, zawierający czerwień fenolową w celu monitorowania pH). Umieścić probówki zawierające komórki na lodzie i szybko przystąpić do przygotowania ECM poniżej. Ogranicz czas, w którym komórki pozostają w wodzie, aby zachować żywotność.
    Uwaga: Zarówno 10x DMEM, jak i woda klasy do hodowli komórkowych są wymaganymi składnikami ECM, dlatego zdecydowaliśmy się na ponowne zawieszenie komórek w obu. Tutaj arbitralnie zdecydowaliśmy się ponownie zawiesić 231 komórek w wodzie klasy hodowli komórkowej i CAF w 10x DMEM, chociaż każdy typ komórek może być ponownie zawieszony w dowolnym z tych dwóch składników.

2. Przygotowanie komórek w ECM (6 mg/ml Kolagen Bydlęcy typu I + 10% BM)

Uwaga: ECM złożony z 90% kolagenu I + 10% BM został wybrany do modelowania inwazyjnego raka piersi, ponieważ zrąb guza w tym nowotworze składa się głównie z kolagenu I ze składnikami BM, takimi jak laminina, kolagen IV i entaktyna, stanowiące mniejszą część ECM12,13,18,19.

  1. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml dodać kolejno składniki wymienione w tabeli 1 na lód.
    Uwaga: Ta ilość wystarcza na 8 stałych surogatów lub, przy użyciu opisanego tutaj systemu bioreaktorów, 4 perfuzjonowanych substytutów.
Przygotowanie komórek w ECM
(6 mg/ml kolagenu bydlęcego typu I + 10% BM)
178,8 μlWoda klasy hodowli komórkowej zawierająca pożądaną liczbę 231 komórek (określoną powyżej)
606 μl Kolagen I (10 mg/ml bydlęcy), dodawać kropla po kropli
100 μl Membrana podstawna, rozmrożona
100 μl10x DMEM (zawierający czerwień fenolową) o pożądanej liczbie CAF (określonej powyżej)
15,2 μl 7,5% (v/v) wodorowęglan sodu, dodawać kropla po kropli

Tabela 1. Przygotowanie komórek w ECM.

  1. Delikatnie wymieszać pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków. Monitoruj poziom pH za pomocą czerwieni fenolowej w 10x DMEM. Sprawdź, czy mieszanina ma pomarańczowo-różowy kolor wskazujący na pH ~7. Jeśli pH jest zbyt niskie (zbyt żółte), powoli dodawaj dodatkowe 7,5% wodorowęglanu sodu po jednej kropli na raz (~ 5 μl), aż do uzyskania odpowiedniego koloru.
    1. Utrzymuj mieszaninę na lodzie i pracuj szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji ECM.

3. Przygotowanie surogatki

  1. W przypadku stałych kultur 3D (rysunek 1A):
    1. Pracując w kapturze do hodowli komórkowych przy użyciu sterylnej techniki, oznacz pokrywę sterylnego szkiełka z 8-dołkową komorą, aby wskazać wszelkie eksperymentalne zmiany w surogatach.
    2. Trzymając szkiełko komory na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji ECM, powoli pipetuj 100 μl mieszaniny komórka + ECM do każdego dołka szkiełka 8-dołkowego.
      Uwaga: Pipetowanie mieszaniny komórka + ECM wokół krawędzi studzienki pomaga lepiej rozprowadzić mieszaninę komórka + ECM w studzience.
    3. Inkubować surogaty w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 45 minut, aby umożliwić polimeryzację ECM.
    4. Po polimeryzacji ECM dodać 100 μl pożywki hodowlanej do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez czas trwania doświadczenia, zmieniając pożywkę co dwa dni.
  2. Dla perfundowanych kultur 3D w systemie bioreaktora (rysunek 1B):
    1. Wysterylizuj wszystkie elementy bioreaktora do konfiguracji hodowli 3D (tj. bioreaktor, rurki, kleszcze i złączki niezbędne do konfiguracji bioreaktora) przy użyciu procesu specyficznego dla bioreaktora, który ma być używany.
      1. W przypadku zastosowanego tutaj przykładowego systemu bioreaktora należy zastosować kombinację autoklawowania (np. 12-minutowa ekspozycja w temperaturze 121,1 °C z 15-minutowym suszeniem) i inkubacji w 70% etanolu przez 1 godzinę.
    2. Przygotuj i zmontuj część systemu bioreaktora, w której znajdzie się surogat.
      1. W przypadku przykładowego systemu bioreaktora zastosowanego w tym artykule, należy włożyć szkielet z pianki PDMS do rurki kanału przepływowego PDMS za pomocą kleszczy. Wciśnij cztery (400 μm) druty ze stali nierdzewnej pokrytej polimerem do pianki PDMS, aby wygenerować równoległe mikrokanały.
    3. W kapturze do hodowli komórkowej, stosując sterylną technikę i igłę o rozmiarze 26 ze strzykawką, wstrzyknąć mieszaninę komórka + ECM w obszar bioreaktora perfuzyjnego przeznaczonego do przechowywania komórek. Przejdź szybko do następnego kroku.
    4. Aby zapewnić bardziej równomierne rozmieszczenie komórek w substytutach, umieść element bioreaktora, w którym znajdują się surogaty, w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (pod kapturem hodowli komórkowej) i stale obracaj z prędkością ~18 obr./min podczas inkubacji w temperaturze 37 °C przez 45 minut, aby umożliwić polimeryzację ECM.
      Uwaga: Obrót można wykonać za pomocą rotatora w inkubatorze lub pieca z wbudowanym rotatorem, takiego jak piec do hybrydyzacji ustawiony na 37 °C.
    5. Podłączyć zespół bioreaktora zawierający substytut do pompy perfuzyjnej zgodnie z instrukcjami producenta.
      Uwaga: Specyfika tego procesu będzie się różnić w zależności od używanego bioreaktora i pompy.
      1. W przypadku przykładowego systemu bioreaktora zastosowanego w tym artykule, usuń przewody ze stali nierdzewnej przed podłączeniem zespołu bioreaktora do pompy.
    6. Rozpocznij perfuzję medium (natężenie przepływu objętościowego 167,1 μl/min; naprężenie ścinające ścianki mikrokanału: 1 dyn/cm2) w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      Uwaga: Szybkość perfuzji medium można regulować w zależności od konfiguracji bioreaktora oraz celów i projektu eksperymentu.
    7. Kontynuuj perfuzję pożywki przez czas trwania eksperymentu, zmieniając pożywkę co siedem dni.

4. Fiksacja i przetwarzanie surogatów (Rysunek 1C)

  1. Etykietowanie krioform i kaset na tkanki z tworzywa sztucznego do zastępczego utrwalania i przetwarzania.
  2. Następnie zamknij surogaty w żelu do przetwarzania próbek, który jest materiałem wodnym, który jest płynny w ciepłych temperaturach, ale krzepnie w temperaturze pokojowej. Żel do obróbki próbek pomaga w utrzymaniu surogatów w stanie nienaruszonym podczas przetwarzania i ułatwia cięcie histologiczne14,20-22.
    1. Rozpuść żel do przetwarzania próbki w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C w celu upłynnienia, utrzymując w tej temperaturze aż do użycia. Przenieś bioreaktor z surogatem do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Odpipetować około 300 μl żelu do przetwarzania próbek na dno oznakowanego kriomoldu (Rysunek 1C, lewy panel).
    3. Za pomocą ostrza skalpela (preferowany nr 10) i kleszczy ostrożnie wyjmij surogat z bioreaktora lub ze studzienki 8-dołkowego szkiełka komorowego i umieść go w kriomold zawierającym żel do przetwarzania próbek.
      Uwaga: Barwniki do znakowania tkanek (konkretny przykład można znaleźć w Wykazie materiałów/sprzętu) o różnych kolorach mogą być używane do oznaczania surogatów, umożliwiając w ten sposób włączenie wielu próbek do jednej kasety na tkanki w sposób rozpoznawalny.
    4. Odpipetować około 300 μl żelu do przetwarzania próbek, aby pokryć substytut w kriomold i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut do zestalenia.
    5. Gdy żel do przetwarzania próbek zastygnie, usuń żel do przetwarzania próbek zawierający surogat z krioformy i umieść go w kasecie na tkanki.
  3. Umieść kasetę z tkankami zawierającą surogat w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 10 do 12 godzin w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowite utrwalenie.
  4. Po utrwaleniu przesunąć kasetę z tkanką zawierającą surogat do 70% etanolu, aż do przetworzenia na parafinę.
    Uwaga: Przeniesienie substytutu z formaliny na etanol zapobiega nadmiernemu utrwaleniu formaliną, co może spowodować utratę immunoreaktywności niektórych epitopów23. Czas przebywania w etanolu nie jest krytyczny. Ta zmiana utrwalacza jest ważna, jeśli surogat będzie używany do immunohistochemii lub immunofluorescencji. Utrwalony substytut jest teraz gotowy do przetworzenia na parafinę (rysunek 1C, środkowy panel). Przetwarzanie to jest zwykle wykonywane w procesorze tkanek znajdującym się w odpowiednio wyposażonym laboratorium histologicznym. Zalecany jest krótszy program ze względu na wielkość i delikatny charakter surogatów. 24

5. Podział na sekcje i barwienie H&E (Rysunek 1C, prawy panel)

  1. Po przetworzeniu surogatów na blok parafinowy, należy je wyciąć za pomocą standardowego mikrotomu do cięcia tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie24,25.
    Uwaga: Można to wykonać w wykwalifikowanym laboratorium histologicznym lub w laboratorium badawczym, jeśli jest odpowiednio wyposażone i doświadczone. Grubość przekrojów histologicznych może się różnić w zależności od przeznaczenia przekrojów; Zazwyczaj jednak używamy odcinków o grubości 5 μm. Piankę PDMS zastosowaną w perfuzjonowanych surogatach można łatwo podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu.
  2. Umieść sekcje na zwykłych szkiełkach histologicznych.
  3. Po podziale na sekcje wypiekać skrawki histologiczne w temperaturze 58 °C przez 10-12 godzin, aby przygotować się do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E). Pieczenie topi parafinę, a także pozwala na lepsze przyleganie sekcji do szkiełka.
  4. Barwienie H&E:
    1. Stacje opisane w tabeli 2 należy ustawić w słoikach do barwienia lub szklanych naczyniach do barwienia, w zależności od liczby szkiełek do barwienia. Po ustawieniu odczynników należy przesunąć sekcje przez każdą stację, w kolejności, inkubując przez czas wskazany poniżej24.
    2. Zamontuj szkiełko nakrywkowe do każdego szkiełka za pomocą nośnika montażowego.
    3. Poczekaj, aż nośnik montażowy wyschnie przed obrazowaniem.
Barwienie H&E
stacjarozwiązanieGodzina
1ksylenCzas trwania: 5 min
cyfra arabskaksylenCzas trwania: 5 min
3ksylenCzas trwania: 5 min
4100% etanol Czas trwania: 5 min
5100% etanol Czas trwania: 5 min
695% etanolu Czas trwania: 5 min
795% etanolu Czas trwania: 5 min
8kranówka Czas trwania: 5 min
9Woda dejonizowana Czas trwania: 5 min
10Hematoksylina 7211Czas trwania: 5 min
11kranówka Czas trwania: 5 min
12Odstojnik*10 zanurzeń
*Richard Allan #7401 lub 70% etanol + 0,5% HCl
13kranówka Czas trwania: 5 min
14Odczynnik do niebieszczenia30 sekund
15kranówkaCzas trwania: 5 min
1695% etanolu10 zanurzeń
17Eozyna-Y1 min
Rozdział 1895% etanolu10 zanurzeń
Rozdział 1995% etanolu10 zanurzeń
20100% etanol10 zanurzeń
21100% etanol10 zanurzeń
22 Rozdział 22100% etanolCzas trwania: 5 min
23ksylen10 zanurzeń
24ksylenCzas trwania: 5 min

Tabela 2. Barwienie H&E.

6. Pomiar gęstości komórek

  1. Zobrazuj co najmniej jeden cały wycinek histologiczny surogatu wybarwiony H&E za pomocą mikroskopii jasnego pola przy 400-krotnym powiększeniu, zapisując obrazy jako pliki .tif.
    Uwaga: Opisane przetwarzanie obrazu zostało zakończone tylko przy użyciu obrazów kolorowych. Chociaż nie zostało to przetestowane, uważamy, że to samo przetwarzanie powinno mieć zastosowanie do obrazów w skali szarości.
  2. Pobierz CellProfiler z Broad Institute26 (http://cellprofiler.org/download.shtml) i ImageJ z National Institutes of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), które są publicznie dostępne bez żadnych opłat.
  3. Aby zmierzyć obszar surogatu na każdym obrazie, otwórz ImageJ, wybierz "Ustaw pomiary" (w zakładce "Analizuj"), wybierz "Obszar", a następnie wybierz "W porządku".
  4. Otwórz obraz (plik .tif) surogatki. Korzystając z narzędzia wielokąta w ImageJ (patrz Rysunek 2), obrysuj obszar surogatu na obrazie, przeciągając myszą i klikając, aby utworzyć punkty kontrolne. Użyj krawędzi ECM jako prowadnicy. Po obrysowaniu wybierz "Zmierz" w zakładce "Analizuj".

figure-protocol-1
Rysunek 2. Analiza ImageJ. Zrzut ekranu przedstawiający przetwarzanie ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Powtórz te czynności dla każdego obrazu substytutu tkanki. Zapisz pomiary i odpowiadające im identyfikatory obrazów w programie arkusza kalkulacyjnego.
  2. Prześlij pliki obrazów używane do pomiaru obszaru w ImageJ do CellProfiler, przeciągając pliki obrazów do "Listy plików". Przypisz nazwę do obrazów zaimportowanych w module wejściowym "NamesAndTypes" i wybierz typ obrazu (np. "Obraz kolorowy").

figure-protocol-2
Rysunek 3. Przykładowy potok CellProfiler. Zrzut ekranu przedstawiający potok przeznaczony do pomiaru liczby komórek jądrzastych w programie CellProfiler. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Utwórz potok analizy, który zawiera następujące moduły, aby obliczyć liczbę komórek na obrazie, klikając znak "+" obok opcji "Dostosuj moduł" (Rysunek 3, u dołu lewego panelu). Dodaj każdy z poniższych modułów.
    1. Wybierz opcję "ColorToGray" (Rysunek 4).
      1. Wybierz nazwę obrazu wejściowego z menu rozwijanego, nazwij obraz wyjściowy i wybierz oryginalny typ obrazu (np. RGB, jeśli obraz wejściowy jest kolorowy).
        Uwaga: Ten moduł nie będzie potrzebny w przypadku korzystania z obrazów w skali szarości
    2. Wybierz "ImageMath" (Rysunek 5).
      1. Wybierz operację "Odwróć", nazwij obraz wyjściowy i wybierz obraz w skali szarości w zakładce "wybierz pierwszy obraz".
    3. Wybierz pozycję "IdentifyPrimaryObjects" (Rysunek 6).
      1. Wybierz obraz wejściowy (obraz po korekcji matematycznej), nazwij główny obiekt, który ma być zidentyfikowany (jądra) i wprowadź zakres średnic dla obiektów, które mają być mierzone, w jednostkach pikseli (około 25 do 65). Wybierz "adaptacyjną" strategię progową z metodą progowania "Otsu" z "trzema klasami". Nie zmieniaj żadnych innych parametrów z ustawień domyślnych.
        Uwaga: Optymalny zakres średnic należy określić, otwierając obraz w module obrazu wejściowego i mierząc średnicę jąder (tj. obiektu pierwotnego) za pomocą narzędzia do pomiaru długości.
    4. Wybierz opcję "IdentifySecondaryObjects" (Rysunek 7).
      1. Wybierz obraz wejściowy (obraz po korekcie matematycznej), wybierz obiekty wejściowe (jądra) i nazwij obiekty, które mają być identyfikowane (komórki). Wybierz metodę "propagacji" do identyfikacji obiektów drugorzędnych, użyj strategii progowej "adaptacyjnej" i metody "Otsu" z "dwiema klasami" minimalizującymi "wariancję ważoną". Wybierz "bez wygładzania" i progowy współczynnik korekcji równy 1, dolną i górną granicę 0 i 1 oraz współczynnik regularyzacji 0,05. Nie zmieniaj żadnych innych parametrów w stosunku do ustawień domyślnych.
    5. Wybierz opcję "MeasureObjectSizeShape" (Rysunek 8).
      1. Wybierz komórki (obiekt drugorzędny) i jądra (obiekt podstawowy) jako obiekty do zmierzenia.
    6. Wybierz pozycję "FilterObjects" (Rysunek 9).
      1. Nazwij obiekty wyjściowe i wybierz jądra (obiekt podstawowy) jako obiekt do filtrowania.
      2. Zachowaj kolejne dwa parametry zgodnie z ustawieniami domyślnymi. Wybierz "AreaShape" jako miarę, aby filtrować według kategorii, i "FormFactor" jako miarę.
      3. Wybierz "Tak", aby filtrować przy użyciu minimalnej wartości pomiaru i dodać minimalną wartość 0,52.
      4. Wybierz "Nie", aby filtrować przy użyciu maksymalnego pomiaru.
      5. Wybierz "Tak", aby zachować kontury filtrowanych obiektów i nazwać obraz konturu.
    7. Wybierz opcję "Eksportuj do arkusza kalkulacyjnego" (Rysunek 10)
      1. Wybierz miejsce, w którym chcesz zapisać plik i nazwij "Pliki wyjściowe".
    8. Po wygenerowaniu potoku analizy (kroki od 6.7.1 do 6.7.7.1) uruchom "Tryb testowy" w CellProfiler i oceń każdy krok, w tym to, czy jądra na obrazie testowym są odpowiednio filtrowane, aby upewnić się, że wybrano optymalne parametry do identyfikacji komórek. Rysunek 11 przedstawia obraz wyjściowy z CellProfiler po filtrowaniu, w którym jądra są prawidłowo identyfikowane (zakreślone na zielono), a tło jest odfiltrowywane.
    9. Gdy parametry zostaną ocenione i określone jako wystarczające, zapisz projekt, a następnie kliknij "Analizuj obrazy". Ten projekt może być wielokrotnie wykorzystywany do przyszłych analiz.
      Uwaga: Po ustaleniu parametrów program jest ustawiany tak, aby sekwencyjnie analizować wszystkie obrazy na "Liście plików". Spowoduje to otwarcie wielu okien dla każdego analizowanego obrazu, co spowoduje wydłużenie czasu przetwarzania.
      1. Aby uniknąć dłuższego czasu przetwarzania, kliknij ikonę oka we wszystkich modułach z wyjątkiem "Eksportuj do arkusza kalkulacyjnego" w sekcji "Moduły analizy".
    10. Gdy wszystkie obrazy zastępcze zostaną przetworzone przez CellProfiler, otwórz arkusz kalkulacyjny zawierający dane obrazu wygenerowane przez CellProfiler oraz arkusz kalkulacyjny zawierający obszar zmierzony za pomocą ImageJ. Skopiuj przefiltrowane dane jądrowe (kolumna D w arkuszu kalkulacyjnym CellProfiler) oraz identyfikatory obrazów (kolumna R) i wklej je do arkusza kalkulacyjnego zawierającego zmierzone dane powierzchniowe.
    11. Obliczyć sumę wszystkich pomiarów uzyskanych dla liczby jąder na obraz surogatu.
    12. Oblicz sumę pomiarów uzyskanych dla obszaru zastępczego z każdego obrazu surogatu. Podziel całkowitą powierzchnię mierzoną przez 1x106.
    13. Podziel całkowitą liczbę jąder przez całkowity pomiar powierzchni w powyższym kroku, aby uzyskać wartość liczby komórek na 1x106 pikseli2.

figure-protocol-3
Rysunek 4. Potok CellProfiler: zmiana obrazu na skalę szarości. Zrzut ekranu modułu "ColortoGray". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 5. Potok CellProfiler: odwracanie obrazu. Zrzut ekranu modułu "ImageMath". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 6. Potok CellProfiler: identyfikacja jąder. Zrzut ekranu modułu "IdentifyPrimaryObjects". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-6
Rysunek 7. Potok CellProfiler: identyfikacja komórek. Zrzut ekranu modułu "IdentifySecondaryObjects". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-7
Rysunek 8. Potok CellProfiler: pomiar obiektów. Zrzut ekranu modułu "MeasureObjectSizeShape". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-8
Rysunek 9. Potok CellProfiler: filtrowanie obiektów. Zrzut ekranu modułu "FilterObjects". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-9
Rysunek 10. Potok CellProfiler: eksport danych. Zrzut ekranu modułu "ExportToSpreadsheet". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-10
Rysunek 11. Dane wyjściowe CellProfiler po filtrowaniu. Zrzut ekranu wyjściowego w profilerze komórek po filtrowaniu obiektów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno stałe, jak i perfundowane surogatki raka piersi 3D zostały przygotowane zgodnie z powyższym opisem i hodowane przez 7 dni. Następnie surogatki zostały utrwalone, przetworzone na parafinę, pokrojone i wybarwione hematoksyliną i eozyną, jak opisano powyżej. Zmierzono liczbę komórek jądrzastych na obszar (zarówno 231 komórek, jak i CAF) każdego surogatu. Jak widać na rycinie 12, reprezentatywne mikrofotografie skrawków barwionych H&E wykazują wyższą koncentrację ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisano metodę hodowli 3D, która obejmuje składniki mikrośrodowiska tkankowego, w tym macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i ludzkie fibroblasty zrębu, w objętości, która dokładniej modeluje ludzkiego raka piersi, aby umożliwić rozwój rekapitulacyjnej morfologii 3D. Opisana metoda hodowli 3D jest bardziej reprezentatywna dla choroby ludzkiej niż tradycyjna hodowla komórkowa 2D, ponieważ wiele typów komórek jest włączanych do objętości 3D ECM. Zauważono, że parametry te (tj. wiele typów komórek, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

University of Alabama w Birmingham Center for Metabolic Bone Disease przeprowadziło przetwarzanie histologiczne i sekcję surogatów. Firma Southern Research (Birmingham, AL) zapewniła wsparcie w produkcji systemu bioreaktora. Finansowanie zostało zapewnione przez Program Badań nad Rakiem Piersi (BC121367) Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM)Corning CellGro10-014-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
0,25% trypsyna + 2,21  mM EDTA 1xCorning25-053-CI
Płytki do hodowli tkankowych, 100  mmCellTreat Scientific Products229620Sterylne
płytki do hodowli tkankowych, 35  mmCellTreat Scientific Products229638Do tworzenia piany PDMS 
Pipeta szklana 9"Fisher 13-678-20DSterylna
pipeta 10 mlCellTreat Scientific Products229210BSterylna
1,000 µ l końcówki do pipetFisherBrand02-717-166Sterylne filtrowane
200 i mikro; l końcówki do pipetFisherBrand02-717-141Sterylne filtrowane
10 i mikro; l końcówki do pipetFisherBrand02-717-158Sterylne probówki
stożkowe 15 mlCellTreat Scientific Products229410Sterylne
probówki stożkowe 50 mlCellTreat Scientific Products229422Sterylne
probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisherBrand05-408-129Sterylny
niebieski trypanCorning Cellgro25-900-CIsterylny
Sylgard 184Mikroskopia elektronowa Sciences24236-10Elastomer PDMS i utwardzacz. Używany w naszym wewnętrznym bioreaktorze.
PiankaProdukowana we własnym zakresie do użytku w naszym wewnętrznym bioreaktorze.
Kolagen bydlęcy o wysokim stężeniuZaawansowany Biomatrix5133-AFibriCol ~ 10 mg / ml
Zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (membrana podstawna)Corning354230Materiał membrany podstawnej
Wodorowęglan soduSigmaS8761
Biologia molekularna klasy wodnejFisherBP2819-1
DMEM 10x Sigma-AldrichD2429
System prowadnic komorowych Nunc Lab-Tek Thermo Scientific1774028-dołkowy
bioreaktorwykonany we własnym zakresie.
Sprężyna ze stali nierdzewnej 304— Pokryte polimerem PTFEMcMaster-Carr1749T19Druty ze stali nierdzewnej do generowania mikrokanalików w naszym wewnętrznym systemie bioreaktorów. Rurka
silikonowa utwardzana platyną BioPharm PlusMasterflexEW-96440-14Do stosowania w naszym wewnętrznym systemie bioreaktorów. Średnica wewnętrzna wężyka: 1.6 mm, Rozmiar króćca węża: 1/16 in.
Zestawy przewodów z 2 odpływami, PVC niekielichowe, 1.52  mm IDCole-Parmer EW-74906-36Do stosowania w naszym wewnętrznym systemie bioreaktorów (z pompą mikroperystalityczną). 
Sześciokanałowa precyzyjna mikropompa perystaltycznaCole-ParmerEW-74906-04Do użytku z naszym wewnętrznym systemem bioreaktorów
Strzykawki tuberkulinoweBD Medical30962526 gauge 3/8 cala igły; Sterylne
kleszcze do tkanek preparacyjnychFisherBrand13-812-365,5-calowy
mini rotator rurkowyBoekel Scientific260750Opcja wyposażenia do rotacji zastępczej. Używany z karuzelą do probówek 50 ml (numer modelu 260753)
Karuzela w probówkach 50 mlBoekel Scientific260753Używany z rotatorem mini probówek
Bambino  Piec do hybrydyzacjiBoekel Scientific230301Opcja wyposażenia do rotacji surogatów
HistoGel Żel do przetwarzania próbekThermo ScientificHG-4000-012Żel do przetwarzania próbek opisany w kroku 5.2
CryomoldAndwin Scientific456615 mm x 15 mm x 5 mm
Znakowanie tkanek DyeCancer Diagnostics, inc. 03000PMoże być używany do oznaczania surogatów,  umożliwiając włączenie wielu próbek do jednej kasety na tkanki 
Kasety na chusteczki higieniczne na zawiasach FisherBrand22-272-416
FormalinFisher23-245-685
GoldSeal Zwykłe szklane szkiełkaThermo Scientific3048-002
XyleneFisherX3P-1GAL
Etanol, 200 proof (100%), USPDecon Laboratories, Inc.2805M
HematoxylinThermo Scientific Richard-Allan Scientific7211
ClarifierThermo Scientific Richard-Allan Scientific7401
Roztwór do niebieszczeniaThermo Scientific Richard-Allan Scientific7301
Eosin YThermo Scientific Richard-Allan Scientific7111
Cytoseal XYL mediaThermo Scientific Richard-Allan Scientific83124
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-548-5G
z filtrem PDMS typu I o średnicy 0,016", L/S 14

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
  2. Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
  3. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  4. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).
  5. Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).
  6. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  7. Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).
  8. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).
  9. Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).
  10. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
  11. Bergamaschi, A., et al. Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome. J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).
  12. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, S66-S72 (2013).
  13. Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies. JBC. 204 (3), 291-301 (2014).
  14. Sadlonova, A., et al. Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 4, (2004).
  15. Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity. Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).
  16. Marshall, L. E., et al. Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
  17. Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. Polymeric foams with functional nanocomposite cells. RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).
  18. Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, (2014).
  19. Lochter, A., Bissell, M. J. Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer. Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).
  20. Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).
  21. Varsegi, G. M., Shidham, V. Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells. J Vis Exp. (29), e1316(2009).
  22. Sadlonova, A., et al. Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease. Am J Pathol. 170 (3), (2007).
  23. Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol. Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).
  24. Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering. J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).
  25. Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies. J Vis Exp. (11), (2008).
  26. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  27. Kwon, Y. -J., et al. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines. Clin Exp Metastasis. (28), (2011).
  28. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J Vis Exp. (99), e52293(2015).
  29. Pal, A., Kleer, C. G. Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells. J Vis Exp. (86), e51311(2014).
  30. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088(2014).
  31. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  32. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), e52526(2015).
  33. Sadlonova, A., et al. Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts. Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).
  34. Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels. Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).
  35. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).
  36. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  37. Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).
  38. Caruso, R. A., et al. Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review). Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).
  39. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).
  40. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
  41. Ogino, S., et al. Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease. Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).
  42. Otali, D., et al. Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition. Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla tr jwymiarowafibroblasty zr bumacierz zewn trzkom rkowasystem bioreaktora perfuzyjnegopolimeryzacja ECMsekcjonowanie histologiczneanaliza w programie ImageJoprogramowanie CellProfilerpomiar g sto ci kom rek

Powiązane artykuły