Method Article

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka (EC) pokrywające ściany naczyń krwionośnych in vivo są stale narażone na przepływ, ale hodowane EC są często hodowane w warunkach statycznych i wykazują fenotyp prozapalny. Chociaż rozwój urządzeń mikroprzepływowych został przyjęty przez inżynierów w ciągu dwóch dekad, ich biologiczne zastosowania pozostają ograniczone. Bardziej istotny fizjologicznie model mikronaczyń in vitro, zwalidowany przez zastosowania biologiczne, jest ważny dla postępu w tej dziedzinie i wypełnienia luk między badaniami in vivo i in vitro. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe procedury rozwoju sieci mikronaczyń hodowlanych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego o długotrwałej zdolności perfuzyjnej. Pokazujemy również jego zastosowania do ilościowych pomiarów indukowanych przez agonistów zmian w produkcji EC [Ca2+]i i tlenku azotu (NO) w czasie rzeczywistym przy użyciu konfokalnej i konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Utworzona sieć mikronaczyń z ciągłą perfuzją wykazała dobrze rozwinięte połączenia między EC. Dystrybucja VE i kadheryny była bliższa tej obserwowanej w nienaruszonych mikronaczyniach niż w statycznie hodowanych monowarstwach EC. Indukowany ATP przejściowy wzrost produkcji EC [Ca2+]i i NO mierzono ilościowo na poziomie poszczególnych komórek, co potwierdziło funkcjonalność hodowanych mikronaczyń. To urządzenie mikroprzepływowe pozwala EC rosnąć pod dobrze kontrolowanym, fizjologicznie istotnym przepływem, co sprawia, że środowisko hodowli komórkowej jest bliższe in vivo niż w konwencjonalnych, statycznych hodowlach 2D. Projekt sieci mikrokanałowej jest bardzo wszechstronny, a proces produkcji jest prosty i powtarzalny. Urządzenie można łatwo zintegrować z konfokalnym lub konwencjonalnym systemem mikroskopowym, umożliwiając obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Co najważniejsze, ponieważ hodowana sieć mikronaczyń może być tworzona przez pierwotne ludzkie EC, podejście to posłuży jako użyteczne narzędzie do zbadania, w jaki sposób patologicznie zmienione składniki krwi z próbek pobranych od pacjentów wpływają na ludzkie EC i zapewni wgląd w problemy kliniczne. Może być również rozwijany jako platforma do badań przesiewowych leków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka (EC) pokrywające ściany naczyń krwionośnych in vivo są stale narażone na przepływ, ale hodowane EC są często hodowane w warunkach statycznych i wykazują prozapalny fenotyp1,2. Technologia mikrofluidyczna umożliwia precyzyjnie kontrolowane przepływanie płynu przez geometrycznie ograniczone kanały w mikroskali (submilimetrowe)3, co daje możliwość wzrostu hodowanym komórkom, zwłaszcza naczyniowym EC, w pożądanych warunkach przepływu. Cechy te sprawiają, że warunki hodowli komórkowej są bliższe in vivo niż konwencjonalne, statyczne hodowle komórkowe 2D. Są one niezwykle ważne, gdy urządzenia mikroprzepływowe są uż....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

  1. Standardowe wykonanie fotolitografii formy wzorcowej SU-8 50
    1. Oczyść płytkę silikonową przed wirowaniem. Opłucz gołą 2-calową płytkę silikonową acetonem przez 15 minut, a następnie alkoholem izopropylowym (IPA) przez 15 minut. Odwodnić wafel, umieszczając go na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C na 1 godzinę. Po odwodnieniu schłodzić wafel w temperaturze pokojowej.
    2. Pokryj płytkę krzemową za pomocą fotorezystu SU-8. Dodać 2 ml fotorezystu SU-8 na płytkę. Zwiększ prędkość płytki do 500 obr./min przy 100 obr./min/s, przyspieszając przez 10 sekund, a następnie 1,000 obr./min przy 300 obr./s, prz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja pokazuje niektóre z wyników uzyskanych za pomocą sieci mikronaczyń hodowlanych opracowanych za pomocą tego protokołu. Wzorzec mikrokanałów to trzypoziomowa sieć rozgałęziająca się (rysunek 1A). W tym projekcie kanał macierzysty o szerokości 159 μm rozgałęzia się na dwa kanały o szerokości 126 μm i ponownie rozgałęzia się na cztery kanały potomne o szerokości 100 μm. Przeprowadzono symulację numeryczną 3D w celu oszacowania rozkładu naprężeń ścinających przy natę.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły rozwoju sieci mikronaczyń hodowlanych, charakterystykę połączeń EC i dystrybucji F-aktyny w cytoszkielecie oraz pomiary ilościowe produkcji EC [Ca2+]i i NO za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Perfuzyjne urządzenie mikroprzepływowe zapewnia model in vitro , który umożliwia ścisłą symulację geometrii mikronaczyń in vivo i warunków przepływu ścinającego. Ponieważ hodowana sieć mikronaczyń może być tworzona przez pierwotne ludzkie EC,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi HL56237, Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowego i Nerek DK97391-03, Narodowej Fundacji Nauki (NSF-1227359 i EPS-1003907).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
AcetonFisher ScientificA929
Stempel do biopsjiMiltex33-31 AA
Albumina bydlęcaMP Biomedicals810014
Ekstrakt z mózgu bydlęcego (BBE)LonzaCC-4098
Szkiełko nakrywkoweFisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Donkey anty-kozioł IgG (H+L) Przeciwciało wtórneTechnologie życiaA-11055
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190-250
DRAQ5 (barwienie jąder) Technologia sygnalizacji komórkowej4084
Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000-044
FibronektynaGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
Żelatyna ze skóry świniSigma-AldrichG1890-100G
Gentamycyna (50 mg / ml)Gibco15750-078
Szkiełko nakrywkoweFisher Scientific12-548B
Szklana pipeta PasteuraVWR14672
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES Buforowany roztwór solifizjologicznej LonzaCC-5024
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)LonzaCC-2517
Alkohol izopropylowy (IPA)VWR89125
L-glutamina (200 mM)Gibco25030-081
Składnik
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4,6 mM)Fisher NaukowyP217-500
CaCl2 · 2H2O (2,0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 · 7H2O (1,2 mM)Fisher ScientificM63-500
Glukoza (5,5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5,0 mM)Fisher ScientificS233-500
Sól Hepes (9,1 mM)Research Organics6007H
Kwas Hepes (10,9 mM)Research Organics6003H
MCDB 131 Hodowla MediumTechnologie życia10372-019
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Nauki15710
Falloidyna (barwienie F-aktyny)Sigma-AldrichP1951
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Technologie życiowe14040-133
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
SkalpelExel Int29552
Taśma klejąca3M 34-8711-3070-3
Wafel silikonowyVWR14672
SU-8 fotorezystorMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 wywoływaczMicroChemY020100
kolby do hodowli tkankowychSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Książka chemicznaT6878
Roztwór neutralizatora trypsynyGibcoR-002-100
Roztwór trypsyny/EDTA (TE)GibcoR-001-100
RurkaCole-ParmerRurka z mikrootworem PTFE, 0,012" ID x 0,030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiotechnologySC-6458
Nazwa sprzętuFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
Bezpieczeństwo biologiczne Kaptur laminarnyNuAireNU-425 Klasa II, Typ A2
Kamera CCDHamamatsuORCA
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SL
EksykatorBel-ArtF42022
Płyta grzejnaInkubator WenescoHP-1212
Forma Scientific3110
Piec izotempowyBarnstead3608-5
Litografia ławkaKarl SussMA6 Litografia
Mikroskop optycznyNikonL200 ND & Membrana 300
Migawka do kamery CCDSutter InstrumentLambda 10-2
Myjka plazmowaPVA TePla/Harrick plazmaM4L/PDC-32G
Powlekarka wirowaBrewer ScienceCee 200X
System pomp strzykawkowychAparat Harvard703005
Nazwa oprogramowania FirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
CAD oprogramowanieAutodeskAutoCAD 2015
Oprogramowanie symulacyjne CFDCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Pozyskiwanie i analiza obrazów pod kątem NIE produkcja Uniwersalne obrazowanieMetafluor
roztworu Ringera u ssakówkontaktowa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

Related Articles