Artykuł metodologiczny

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

DOI:

10.3791/54024

⸱

15 czerwca 2016

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapis na całej komórce jest techniką elektrofizjologiczną, która pozwala na badanie właściwości elektrycznych znacznej części neuronu. W tej konfiguracji mikropipeta jest w ścisłym kontakcie z błoną komórkową, co zapobiega upływowi prądu, a tym samym zapewnia dokładniejsze pomiary prądu jonowego niż dotychczas stosowana wewnątrzkomórkowa metoda zapisu na ostrych elektrodach. Klasycznie, zapis całych komórek może być wykonywany na neuronach w różnych typach preparatów, w tym na modelach kultur komórkowych, zdysocjowanych neuronach, neuronach w wycinkach mózgu oraz u nienaruszonych znieczulonych lub obudzonych zwierząt. Podsumowując, technika ta w ogromnym stopniu przyczyniła się do zrozumienia biernych i aktywnych właściwości biofizycznych komórek pobudliwych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji o tym, w jaki sposób określone manipulacje (np. farmakologiczna, plastyczność wywołana przez eksperymentatora) mogą zmieniać określone funkcje lub kanały neuronalne w czasie rzeczywistym. Dodatkowo, znaczne otwarcie błony plazmatycznej pozwala na swobodną dyfuzję roztworu pipety wewnętrznej do cytoplazmy, zapewniając środki do wprowadzania leków, np. agonistów lub antagonistów określonych białek wewnątrzkomórkowych i manipulowania tymi celami bez zmiany ich funkcji w sąsiednich komórkach. W tym artykule skupimy się na zapisie całych komórek wykonywanym na neuronach w wycinkach mózgu, preparacie, który ma tę zaletę, że rejestruje neurony w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych, tj. w fizjologicznie istotnym kontekście. W szczególności, w połączeniu z odpowiednią farmakologią, technika ta jest potężnym narzędziem umożliwiającym identyfikację specyficznych neuroadaptacji, które wystąpiły po wszelkiego rodzaju doświadczeniach, takich jak uczenie się, narażenie na narkotyki i stres. Podsumowując, zapisy całokomórkowych klamer w wycinkach mózgu dostarczają środków do pomiaru w preparacie ex vivo długotrwałych zmian w funkcjach neuronalnych, które rozwinęły się u nienaruszonych obudzonych zwierząt.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika patch-clamp, technika elektrofizjologiczna, która została opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych1,2, jest podstawowym narzędziem do badania funkcji jednego lub wielu kanałów jonowych w żywej tkance. Wśród różnych konfiguracji łatek, które można uzyskać, nagrania z całych komórek pozwalają na badanie zachowania elektrycznego znacznej części neuronu. Klasycznie technika ta jest wykonywana in vitro na wycinkach mózgu, świeżo zdysocjowanych neuronach lub na modelach hodowli komórkowych3. Technika ta, wykonywana na neuronach w wycinkach mózgu, ma kilka zalet. W szczególności: (i) neurony są rejestrowane w stosunkowo zachowanych obwodach mózgowych, które do pewnego stopnia, w porównaniu z preparatami do hodowli komórkowych, zapewniają środowisko fizjologicznie istotne3. Pozwala to na wczesne, a nawet monitorowanie w czasie rzeczywistym zdarzeń komórkowych i molekularnych, które są wywoływane przez wszelkiego rodzaju ostre manipulacje farmakologiczne – rozdzielczość czasowa, której nie można osiągnąć w klasycznych warunkach in vivo; (ii) zdolność do wizualnej identyfikacji obszarów mózgu w wycinkach mózgu pozwala na wysoką swoistość regionalną 3 zarówno dla badanego regionu mózgu, jak i dla określonych neuronów, gdy wyrażają one markery fluorescencyjne; (iii) dostęp do przestrzeni wewnątrzkomórkowej komórki poprzez otwarcie znacznej części błony komórkowej (w przeciwieństwie do nakłuwania błony ostrą mikropipetą w przypadku zapisów wewnątrzkomórkowych)4. To z kolei pozwala na modyfikację zawartości lub stężenia określonych jonów wchodzących w skład roztworu wewnętrznego, dzięki czemu można badać cele molekularne lub mechanizmy komórkowe w różnych warunkach. Na przykład, po ustaleniu konfiguracji całej komórki, każdy specyficzny czynnik farmakologiczny (np. antagoniści), który można dodać do roztworu mikropipety rejestrującej (pipety z łatą), będzie bezpośrednio dyfundował do cytoplazmy i działał na jej domniemane cele wewnątrzkomórkowe bez zmiany funkcji docelowej w sąsiednich komórkach. Dodatkowo, w porównaniu z ostrym zapisem mikropipet, duży otwór na końcówce elektrody krosowej zapewnia niższą rezystancję, mniej konkurencyjnego hałasu, a tym samym lepszy dostęp elektryczny do wnętrza ogniwa4. Należy jednak pamiętać, że duży otwór na końcówce pipety może prowadzić do dializy komórek, a tym samym do utraty wewnątrzkomórkowej maszynerii molekularnej, która może mieć kluczowe znaczenie dla ekspresji badanych zjawisk biologicznych5,6. W takim przypadku bardziej odpowiednie mogą być nagrania z ostrymi elektrodami. Ten rodzaj zapisów wymaga mikropipet z porem znacznie mniejszym niż te używane do zapisów całych komórek, zapobiegając w ten sposób większości wymiany jonowej między przestrzenią wewnątrzkomórkową a wewnętrznym roztworem pipety.

Każda forma doświadczenia (ostra lub przewlekła), w tym uczenie się7-10, narażenie na narkotyki11,12, stres13,14, itd., może zmienić różne aspekty funkcji neuronalnych w określonych obszarach mózgu. Ponieważ zmiany te często wymagają czasu, aby się rozwinąć (od godzin do dni), zapisy całych komórek w wycinkach mózgu zwierząt, które przeszły określone doświadczenie, pozwalają naukowcom zidentyfikować te zmiany. Zasadniczo, wiele (jeśli nie wszystkie) komponenty, które uczestniczą w funkcjach neuronalnych (np. kanały jonowe aktywowane ligandem, kanały jonowe bramkowane napięciem, transportery neuroprzekaźników), a tym samym aktywność i zachowanie obwodów mózgu, może być zmienionych przez doświadczenie (plastyczność zależna od doświadczenia)10,15-17. Na poziomie neuronalnym aktywność obwodów mózgowych wynika ze stałych interakcji między czynnikami synaptycznymi (np. przekaźnictwo glutaminianu) a wewnętrznymi czynnikami pobudliwości komórkowej (np. aksosomatyczno-dendrytyczne kanały jonowe: sód, Na+; potas, K+; i wapń,Ca2+). W określonych warunkach przy użyciu technik elektrofizjologicznych typu patch-clamp dla całych komórek można wyizolować zmiany sygnału pochodzące konkretnie ze zmian w pobudliwości synaptycznej i wewnętrznej.

W większości przypadków pobudliwość synaptyczna jest oceniana za pomocą techniki zacisków napięcia całego ogniwa. Ten tryb rejestracji umożliwia pomiar prądów jonowych [np. za pośrednictwem receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (receptory AMPA) i receptorów kwasu N-metylo-D-asparaginowego (receptory NMDA)] przez błonę plazmatyczną neuronów przy jednoczesnym utrzymywaniu potencjału błonowego przy ustalonym napięciu. W tym przypadku eksperymentatorzy używają wewnętrznych roztworów mikropipet, które zawierają cez (Cs+), szeroki bloker kanałów K+ (kluczowe wewnętrzne czynniki pobudliwości). Po ustaleniu konfiguracji całej komórki, dyfuzja Cs+ w przestrzeni wewnątrzkomórkowej zablokuje kanały K+, a tym samym umożliwi zarówno stosunkowo efektywne zaciskanie przestrzeni, jak i zapobiegnie wpływowi wewnętrznych czynników pobudliwości na inne pomiary. Problemy z zaciskiem przestrzennym, tj. trudności z napięciem zacisku całej komórki, pojawiają się podczas rejestrowania komórek o nieregularnych kształtach (np. neuronów), a zwłaszcza neuronów z rozległym i złożonym trzpieniem dendrytycznym18,19. Ponieważ somatyczne cęgi napięciowe słabo kontrolują napięcie w drzewie dendrytycznym neuronów, różne aspekty badanych dendrytycznych sygnałów elektrycznych są zniekształcone w sposób dendrytyczny zależny od odległości. W połączeniu z narzędziami farmakologicznymi, takimi jak piprotoksyna (kwas gamma-aminomasłowy, antagonista receptora GABAA) lub kwas kynureninowy (szeroki bloker receptorów glutaminianu) rozpuszczony w roztworze zewnątrzkomórkowym (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, ACSF), technika ta pozwala na pomiar odpowiednio prądów za pośrednictwem receptora glutaminianu i GABAAR.

Natomiast wewnętrzna pobudliwość jest zwykle oceniana w trybie nagrywania cęgowego. W przeciwieństwie do zapisu cęgowego napięcia, ten tryb zapisu umożliwia pomiar zmian potencjałów błonowych indukowanych przez prądy jonowe przepływające przez błonę plazmatyczną neuronów. Zazwyczaj zmiana wewnętrznej pobudliwości jest oceniana poprzez zmiany w zdolności neuronów do generowania potencjałów czynnościowych, co wymaga zarówno kanałów Na+, jak i K+. Dlatego podczas wykonywania nagrań cęgowych mikropipety są napełniane wewnętrznym roztworem, który zawiera K+ zamiast Cs+. W połączeniu ze środkami farmakologicznymi, które blokują prądy za pośrednictwem glutaminianu i receptora GABAA rozpuszczone w ACSF, ten eksperymentalny projekt pozwala na pomiar udziału czynników wewnętrznych (np. kanałów K+) w odpalaniu neuronów bez zanieczyszczenia potencjalnymi zmianami w czynnikach pobudliwości synaptycznej.

Ten artykuł opisze podstawowe niezbędne kroki proceduralne w celu (i) przygotowania zdrowych wycinków mózgu; (ii) osiągnąć konfigurację całej komórki oraz (iii) monitorować podstawowe parametry w celu oceny pobudliwości synaptycznej i wewnętrznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez UT Southwestern Institutional Animal Care and Use Committee i zostały wybrane tak, aby zminimalizować stres, dyskomfort i ból odczuwany przez zwierzęta doświadczalne.

1. Rozwiązania

Uwaga: Przygotuj wcześniej roztwory wewnętrzne mikropipet. Do najbardziej podstawowych celów eksperymentalnych powinny wystarczyć dwa rodzaje rozwiązań: rozwiązania oparte na Cs+ i oparte na K+.

  1. Użyj roztworów na bazie Cs+ (np. roztworu glukonianu Cs+, patrz Materiały) do eksperymentów z cęgami napięciowymi. Przygotuj się w RT.
    1. Przygotować 117 mM roztwór Cs-glukonianu mieszając 4,62 g kwasu D-glukonowego (~3,696 ml) z 3,54 g CsOH (~2,01 ml).
    2. Dodać ddH2O do 90 ml i pozostawić do równowagi przez 30 minut.
    3. Dodać składniki stałe (20 mM HEPES = 0,476 g; 0,4 mM EGTA = 15,2 mg; 2,8 mM NaCl = 16,4 mg; 5 mM chlorek tetraetyloamonu (TEA) = 83 mg).
    4. Dodać ddH2O do ~97 ml.
    5. Dostosować pH roztworu z 50% CsOH do 7,2 - 7,3.
    6. Sprawdź osmolarność i w razie potrzeby skoryguj za pomocą ddH2O.
      Uwaga: Dobry zakres to ~280 - 285 mOsm. Optymalna osmolarność powinna wynosić 15 - 20 mOsm poniżej osmolarności standardowego ACSF (zwykle 300 - 310 mOsm, 300 mOsm w naszym laboratorium). Osmolarność może się różnić w zależności od konkretnych kompozycji roztworów.
    7. Podwielokrotność do 1 000 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej.
    8. Przygotować, podsycić, zamrozić i dodać ATP/GTP do roztworu wewnętrznego w dniu rejestracji.
      1. Dodać 64,63 mg ATP do 10 mg GTP i rozpuścić w 637,11 μl ddH2O.
      2. Przygotować 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej. Każdą 100-krotną porcję zmieszać z 1 000 μl roztworu wewnętrznego w dniu eksperymentu. Po dodaniu ATP/GTP do roztworu wewnętrznego, należy go utrzymywać na lodzie, aby zapobiec degradacji ATP/GTP.
  2. Używaj roztworów opartych na K+ (np. Roztwór K-glukonianu, patrz Materiały) zarówno do eksperymentów cęgowych prądowych, jak i napięciowych, w których przewodnictwo K+ pozostaje funkcjonalne, aby można było ocenić odpalanie neuronów. Przygotuj się w RT.
    1. Zważ wszystkie materiały zgodnie z pożądaną objętością końcową. Do przygotowania 90 ml roztworu 120 mM K-glukonianu = 2,81 g; 20 mM KCl = 0,149 g; 10 mM TŁUSZCZ = 0,238 g; 0,2 mM EGTA = 0,008 g; 2 mM MgCl2 = 0,021 g.
    2. Użyj wystarczającej ilości ddH2O, aby osiągnąć 90% końcowej objętości roztworu. Powinno to zapewnić wystarczająco dużo miejsca na regulację pH i osmolarności.
    3. Po dodaniu i wymieszaniu wszystkich składników upewnij się, że roztwór jest klarowny przed pomiarem pH.
    4. Ciągle mieszając roztwór, dostosuj pH do 7,2 - 7,3 za pomocą wodorotlenku K+ (KOH).
    5. Po wyregulowaniu pH użyj osmometru i dostosuj osmolarność do 280 - 285 mOsm.
      Uwaga: Optymalna osmolarność powinna wynosić 15 - 20 mOsm poniżej osmolarności standardowego ACSF (zwykle 300 - 310 mOsm, 300 mOsm w naszym laboratorium). Osmolarność może się różnić w zależności od konkretnych kompozycji roztworów.
    6. Podwielokrotność do 1 000 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej.
    7. Przygotować, podwielokrotnić, zamrozić i dodać ATP/GTP do roztworu wewnętrznego w dniu rejestracji (patrz krok 1.1.8).
  3. Przygotuj 1 l standardowego ACSF (patrz Materiały).
    Uwaga: Używamy tego przepisu w naszym laboratorium podczas rejestrowania średnich neuronów kolczastych (MSN) w wycinkach mózgu, jednak przepisy mogą się różnić w zależności od laboratorium, dlatego zalecamy eksperymentatorowi użycie przepisu, który jest rutynowo używany podczas rejestrowania obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania.
  4. Przygotuj rozwarstwienie ACSF (roztwór do krojenia, ~125 ml. Uwaga: Dokładna objętość będzie zależeć od wielkości komory krojenia, ponieważ powinna ona całkowicie zanurzyć mózg) do użycia w krokach 2.2 - 2.8.
    1. Przygotuj 5 mM kwasu kynureninowego (w celu zablokowania procesów ekscytotoksycznych wywołanych receptorem glutaminianu) w standardowym ACSF w wystarczającej objętości, aby zanurzyć mózg podczas krojenia. Użyj sonikatora, aby pomóc rozpuścić kwas kynureninowy.
      Uwaga: Czas trwania sonikacji może się różnić w zależności od objętości i ilości ciał stałych w roztworze. Roztwory muszą być klarowne pod koniec procesu (około 1 - 2 minuty w naszych warunkach).
    2. Schłodzić podczas bulgotania 95% gazemO2, 5% CO2 w wiadrze z lodem, aż temperatura osiągnie 0 - 2 °C.
  5. Przygotuj ACSF do nagrywania.
    1. Pobrać 1 l wzorcowego ACSF (lub cokolwiek pozostałego z roztworu przygotowanego w kroku 1.3), do którego można dodać odpowiednie środki farmakologiczne, w zależności od planowanych doświadczeń.
      1. Na przykład, dodaj 100 μM pikrotoksyny podczas rejestrowania pobudzających prądów lub potencjałów postsynaptycznych (EPSC lub EPSP), antagonistów receptora glutaminianu (kwas kynureninowy, 2 mM; lub kombinację D-APV 50 μM z CNQX 10 μM) podczas rejestrowania hamujących prądów lub potencjałów postsynaptycznych (IPSC lub IPSP) oraz zarówno antagonistów receptora pikrotoksyny, jak i glutaminianu podczas oceny wypalania neuronów przy braku jakiegokolwiek wpływu zdarzeń synaptycznych.

2. Przygotowanie plastra

  1. Zbuduj lub zdobądź komorę do odzysku plastrów.
    Uwaga: Zasada działania komory odzysku jest prosta i można ją wykonać w laboratorium (rysunek 1). Krótko mówiąc, komora jest pojemnikiem, w którym wkładany jest kosz, aby utrzymać plastry mózgu na poziomie niższym niż powierzchnia ACSF. Różne firmy naukowe sprzedają również komory do odzysku plastrów.
    1. Jako przykład uzyskaj cztery pierścienie (o wysokości 4 - 6 mm) (Rysunek 1A, widok z boku; B, widok z góry), przecinając strzykawkę o pojemności 30 cm3. Następnie przyklej rozciągnięte siatki (np. wycięte z nylonowego węża) po jednej stronie pierścieni, aby przytrzymać plasterki mózgu (ryc. 1B) i sklej pierścienie ze sobą.
      Uwaga: Można użyć pistoletu do klejenia.
    2. Po sklejeniu czterech pierścieni przyklej zakrzywioną plastikową ściankę w kształcie trapezu równoramiennego do dwóch pierścieni (ryc. 1A i B), aby odprowadzić pęcherzyki tlenu z regenerujących się wycinków mózgu (ryc. 1C i D). Jak pokazano na rysunku 1D, umieść system dyfuzji tlenu (w tym przypadku rurkę dyspersji gazu) po tej samej stronie, co plastikowe ścianki.
  2. Przed krojeniem należy natlenić (95%O2/5% CO2) i schłodzić roztwór do krojenia (patrz krok 1.4) do temperatury 0 - 2 °C.
  3. Napełnij niestandardową komorę odzyskiwania standardowym ACSF w RT. Upewnij się, że ACSF jest dobrze natleniony (20 - 30 minut, czas może się różnić w zależności od objętości komory) przed umieszczeniem plastrów w komorze regeneracji. Upewnij się, że pęcherzyki gazu nie stykają się bezpośrednio z plastrami ani ich nie zakłócają.
  4. Wyłóż tackę na lód wibratomu lodem i napełnij zimną wodą, tak aby jedna trzecia do połowy komory krojenia była zanurzona. Ostrożnie umieść system dostarczania tlenu (np. kamień dyfuzyjny gazu) i sondę temperatury w komorze krojenia, aby żaden przedmiot nie przeszkadzał w ruchu ostrza lub manipulacji plastrami.
  5. Przygotuj obszar sekcji i narzędzia niezbędne do ekstrakcji mózgu i wypreparowania pożądanego obszaru mózgu.
    Uwaga: Dokładna przeprowadzona sekcja będzie zależeć od konkretnego badanego obszaru mózgu, ponieważ różne struktury mózgu będą wymagały krojenia w różnych płaszczyznach (np. Plasterki koronalne, strzałkowe lub poziome).
    1. Umieść następujące narzędzia na podkładzie: nożyczki do dekapitacji, skalpel, małe proste nożyczki z ostrą końcówką, kleszcze do kaniulacji naczyń (lub dowolne narzędzie chirurgiczne z szeroką końcówką, takie jak rongeurs, które jest bardziej odpowiednie dla czaszek szczurów), zakrzywione kleszcze hemostatyczne, pęseta, szpatułka, szpatułka do nabierania, bibuła filtracyjna, szalka Petriego, żyletka z pojedynczą krawędzią i klej cyjanoakrylowy.
  6. Gdy temperatura osiągnie 0 - 2 °C, przenieś roztwór do krojenia do komory krojenia (tacki buforowej).
  7. Znieczulić mysz w komorze osuszającej za pomocą izofluranu. Dokładna ilość może się różnić w zależności od wielkości użytej komory, ale w przypadku małej klatki na buty użyj kilku kropli (~3 - 4). Pozostaw mysz w klatce, dopóki nie stanie się nieruchoma (nie reaguje na bodźce dotykowe; około 15 sekund w opisanych tutaj warunkach). Wykonaj testy szczypania ogona i stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, a następnie odetnij głowę, zanim serce przestanie bić (zwiększa żywotność komórek).
    Uwaga: Przy odpowiednim uzasadnieniu niektóre laboratoria uzyskują zezwolenie na wykonanie dekapitacji żywym organizmem w celu zminimalizowania w jak największym stopniu procesów ekscytotoksycznych i zwiększenia żywotności komórek.
  8. Wykonaj sekcję.
    Uwaga: Mózg musi zostać usunięty szybko (<45 sek.).
    1. Za pomocą skalpela przetnij powierzchowną skórę na szczycie czaszki od rostralnej do ogonowej.
    2. Obierz skórę głowy z każdej strony głowy.
    3. Za pomocą małych prostych nożyczek z ostrą końcówką przetnij płytkę międzyciemieniową wzdłuż szwu lambdoidalnego, aby usunąć móżdżek. Usuń kość potyliczną.
    4. Za pomocą tych samych nożyczek przetnij szew strzałkowy.
    5. Wsuń kleszcze do kaniulacji naczyń (lub rongeurs w przypadku złamania czaszki szczura) poniżej każdej kości ciemieniowej i pociągnij, aby odsłonić mózg.
    6. Za pomocą zakrzywionych kleszczy hemostatycznych uszczypnij kości czołowe, aby je złamać, a następnie użyj pęsety lub kleszczy kaniulacyjnych naczyń, aby usunąć złamane kości. Wytnij i usuń oponę twardą tak delikatnie, jak to możliwe, ponieważ może to przeszkadzać w rozwarstwieniu.
    7. Wsuń szpatułkę pod mózg i delikatnie wyciągnij mózg z czaszki, aby umieścić go w komorze krojenia (tacce buforowej) uprzednio wypełnionej lodowatym ACSF. Pozwól mózgowi ostygnąć przez 1-2 minuty.
    8. Przygotuj platformę preparacyjną, wypełniając szalkę Petriego lodem i odrobiną lodowatej wody, aby umożliwić większy kontakt powierzchniowy, przykryj ją pokrywką i umieść na niej bibułę filtracyjną. Zwilż bibułę filtracyjną zimnym ACSF.
    9. Gdy mózg zostanie schłodzony, umieść go na wypełnionej lodem szalce Petriego i szybko wykonaj odpowiednią sekcję, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę krojenia.
    10. Aby uzyskać strzałkowe plastry zawierające jądro półleżące (NAc), użyj żyletki o pojedynczej krawędzi, aby przeciąć i usunąć guzki węchowe i móżdżek, jeśli są nadal obecne. Następnie wykonaj cięcie strzałkowe w odległości 2 - 3 mm od bocznej granicy prawej półkuli, aby uzyskać płaską powierzchnię, która zostanie przyklejona do płytki przytrzymującej próbkę (patrz krok 2.8.11).
      Uwaga: Odcięcie tylko 2 - 3 mm od bocznej granicy półkuli pozwoli na zebranie plastrów zawierających NAc z obu półkul. Właściwa sekcja będzie zależeć od badanego obszaru mózgu. W tym przypadku przeprowadza się sekcję, aby neurony NAc można było zarejestrować w strzałkowych wycinkach mózgu.
    11. Szybko przyklej (za pomocą kleju cyjanoakrylowego nałożonego na płytkę przytrzymującą próbkę) płaską powierzchnię cięcia mózgu do płytki zgodnie z pożądaną płaszczyzną krojenia. Aby uzyskać strzałkowe wycinki mózgu, patrz krok 2.8.10.
    12. Natychmiast umieść i zabezpiecz płytkę przytrzymującą próbkę w komorze krojenia, tak aby mózg był krojony doogonowo (ze względów bezpieczeństwa uchwyt ostrza należy ustawić tylko wtedy, gdy płytka próbki jest zabezpieczona).
    13. Ustaw wibratom z odpowiednimi parametrami krojenia (parametry używane w laboratorium dla wibratomu wymienionego w materiałach: prędkość 3 - 4, wibracje 9-10 i grubość plastra 250 μm).
    14. Po pokrojeniu w plastry użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść wycinki mózgu do komory regeneracyjnej (przy RT) (patrz krok 2.3). Czas rekonwalescencji może się różnić w zależności od typu neuronu, który jest badany (zwykle 30 - 90 min).

3. Nagrywanie mikropipet i przygotowanie sprzętu

  1. Zapoznaj się ze szczegółowymi wytycznymi zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza, aby uzyskać pożądane właściwości mikropipety.
    Uwaga: W przypadku MSN używamy zakresu rezystancji pipet 3,2-4,0 MΩ.
  2. Natlenić ACSF i dostosować przepływ do 2 ml/min. Podkurzyć ACSF za pomocą pompy perystaltycznej lub przewodów próżniowych zainstalowanych w obiekcie.
  3. Włączyć regulator grzałki perfuzyjnej i wyregulować ustawienia temperatury, aby uzyskać żądaną temperaturę (np. 31.8 - 32.2 °C).
    Uwaga: Stabilność temperatury zależy od stałego poziomu ACSF i stałej prędkości przepływu w komorze. Ponieważ kilka właściwości biofizycznych neuronów (np. opór wejściowy, Ri, zwany również rezystancją błony, Rm) jest wrażliwych na temperaturę, ważne jest utrzymanie stabilnej temperatury.
  4. Włącz sterowany komputerowo wzmacniacz, kamerę, mikromanipulator i światło tła mikroskopu. Jeśli wykonujesz eksperyment, który wymaga elektrycznej stymulacji tkanki, włącz kontroler bodźca i jednostkę izolacyjną.
    Uwaga: Niektóre amppodgrzewacze innych producentów zalecają "rozgrzewkę" przed użyciem, dlatego zaleca się zapoznanie się z instrukcją w celu uzyskania dokładnej procedury obsługi.
  5. Uruchom oprogramowanie do przechwytywania kamery, akwizycji sygnału i wzmacniacza.
  6. Rozmieszczenie plasterków i wizualizacja:
    1. Za pomocą plastikowej pipety transferowej z przyciętą końcówką delikatnie pobrać jeden wycinek mózgu z komory regeneracyjnej.
    2. Umieścić pipetę transferową w komorze rejestracyjnej i delikatnie wycisnąć plasterek z pipety na szkiełko nakrywkowe wyściełające dno komory.
      Uwaga: Dopóki nie dochodzi do przepełnienia, nieszkodliwe jest rozlanie się ACSF z komory rekonwalescencji do wanny.
    3. Użyj kleszczy, aby zmienić położenie plasterka, tak aby żądany obszar został umieszczony dokładnie na środku komory nagrywającej. Użyj soczewki obiektywu mikroskopu o małej mocy (4X) i okularu, aby uzyskać pomoc w ustawieniu.
    4. Po osiągnięciu żądanej pozycji zabezpiecz pozycję wycinka mózgu za pomocą przycisku dociskowego (znanego również jako "harfa") w komorze.
    5. Przełącz się na soczewkę obiektywu o dużej mocy (40X) i delikatnie ją opuść, aż dojdzie do kontaktu z ACSF w komorze.
    6. Użyj pokrętła precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość tkanki. W kontakcie z ACSF nie należy używać pokrętła regulacji zgrubnej na mikroskopie, ponieważ nadmierne opuszczenie soczewki obiektywu może zmiażdżyć plasterek lub nawet złamać szkiełko nakrywkowe wyściełające dno komory, co może spowodować rozlanie się ACSF na kondensator i jego uszkodzenie.
    7. Gdy fokus znajduje się na poziomie tkanki, obserwuj komórki w docelowym regionie pod kątem kształtu. Martwe komórki można łatwo zidentyfikować po ich spuchniętej błonie plazmatycznej i jądrze (ryc. 1E). Zdrowe komórki powinny wyglądać jak okrągłe, jajowate lub eliptyczne jednorodne struktury (ryc. 1E).
    8. Poszukaj komórki docelowej. Zaznacz go na ekranie komputera, aby ułatwić prowadzenie mikropipety rejestrującej. Jeśli używasz oprogramowania, takiego jak QCapture, narysuj kwadrat wokół komórki docelowej, przytrzymując lewy przycisk myszy.
    9. Podnieś soczewkę obiektywu tak, aby w stożku utworzonym przez soczewkę obiektywu stykającą się z ACSF było wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić i przesunąć mikropipetę rejestrującą.
  7. Umieszczanie i pozycjonowanie mikropipet
    1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, niemetalowej igły do mikrostrzykawki i dedykowanego filtra, napełnij mikropipetę roztworem wewnętrznym przygotowanym wcześniej zgodnie z planowanym eksperymentem (roztwór wewnętrzny na bazie K+ lub Cs+, patrz kroki 1.1., 1.2 i Materiały dotyczące składu). Użyj wystarczającej ilości roztworu, aby roztwór wewnętrzny zetknął się z pokrytą chlorkiem srebrną elektrodą drucianą w uchwycie na mikropipety.
      Uwaga: Elektrodę z drutu srebrnego można chlorować, mocząc ją w wybielaczu domowym. Trifosforany nukleozydów (ATP i GTP) można dodać do roztworu wewnętrznego przed użyciem. Strzykawkę zawierającą roztwór należy przechowywać na lodzie, aby zapobiec degradacji ATP/GTP.
    2. Upewnij się, że w mikropipecie nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wydostać się na zewnątrz, gdy mikropipeta znajduje się w chusteczce i zasłaniać plasterek.
    3. Umieść mikropipetę w uchwycie elektrody tak, aby roztwór zetknął się z drutem elektrodowym pokrytym chlorkiem srebra.
    4. Dokręć nasadkę pipety tak, aby podkładka stożkowa utworzyła uszczelkę wokół mikropipety.
    5. Przed zanurzeniem mikropipety w ACSF należy zastosować nadciśnienie, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do pipety.
    6. Ustaw stopień główny w pozycji zablokowanej (przodem do komory) i za pomocą mikromanipulatora poprowadź go w dół w kierunku komory tak, aby znajdował się mniej więcej pod środkiem zanurzonego obiektywu.
    7. Przesuwając mikropipetę za pomocą mikromanipulatora (ustawionego na średnią lub wysoką prędkość), użyj ekranu komputera, aby zlokalizować mikropipetę i skierować ją w kierunku położenia celi na osi XY.
    8. Zmierz rezystancję mikropipety, stosując krok napięcia (np. 4 mV przez 100 ms), który można wykonać ręcznie lub automatycznie za pomocą specjalnego oprogramowania, takiego jak tryb kąpieli, w przypadku korzystania z "testu membrany" w oprogramowaniu Clampex (patrz również krok 4). Aby upewnić się, że mikropipeta nie ma pęcherzyków powietrza ani żadnych innych ciał obcych, należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem (np. strzykawki o pojemności 30 cm3) połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej.
    9. Po wyczyszczeniu mikropipety należy wykonać przesunięcie napięcia, aby zredukować prąd pipety do zera, co można osiągnąć ręcznie lub za pomocą specjalnego oprogramowania, takiego jak "przesunięcie pipety" w sterowanym komputerowo sterowniku wzmacniacza.
      Uwaga: Ta funkcja kompensuje wszelkie napięcia spowodowane różnicami stężeń między roztworami kąpieli i mikropipet (tj. potencjał złącza cieczy20).

4. Test membranowy

Uwaga: Ten krok dotyczy wzmacniacza wymienionego w materiałach.

  1. W przypadku korzystania ze sterowanego komputerowo sterownika wzmacniacza, zawsze ustawiaj go w trybie zaciskowym, aby wykonać test membrany.
    Uwaga: Gdy test membranowy jest ustawiony w trybie "Kąpiel", test membranowy umożliwia pomiar rezystancji mikropipety i rezystancji uszczelnienia podczas formowania uszczelki.
  2. Po pęknięciu membrany (patrz krok 5.8) przełącz test membranowy w tryb "Komórka", aby można było uzyskać rezystancjęszeregową (R s) (zwaną również rezystancją dostępu, Ra), Ri i pojemnością membrany (C.p).

5. Końcowe podejście, formowanie pieczęci i uzyskiwanie konfiguracji całej komórki

  1. Za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości zacznij ustawiać ostrość w dół, stopniowo opuszczając mikropipetę. Zawsze najpierw ustaw ostrość w dół, a następnie opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości. Zapewni to, że końcówka mikropipety nie wniknie gwałtownie w plasterek.
  2. Gdy mikropipeta zetknie się z powierzchnią plasterka, zmniejsz prędkość mikromanipulatora do trybu średnio-niskiego.
  3. Delikatnie zastosuj lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem podłączonej do uchwytu pipety, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki podejścia.
  4. Zbliżyć się do celi albo na przemian za pomocą pokręteł sterujących X-Y-Z, albo zbliżając się po przekątnej (jeśli pozwala na to model mikromanipulatora), gdzie obie osie X-Z są zmieniane wraz z obrotem pokrętła osi Z. Ta ostatnia metoda zapobiegnie pionowej kompresji tkanki.
    Uwaga: Tutaj celem jest zbliżenie się do komórki poprzez zadanie minimalnych obrażeń plasterkowi. Gdy mikropipeta znajdzie się wystarczająco blisko komórki, pojawia się wgłębienie (okrągłe odbarwienie powierzchni komórki spowodowane nadciśnieniem wywieranym przez końcówkę mikropipety) (ryc. 2).
  5. Gdy pojawi się wgłębienie (Rysunek 2-1), przyłóż słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do rurki ssącej uchwytu pipety, aby uzyskać uszczelnienie (Rysunek 2-2). Kontynuuj monitorowanie testu membrany.
    Uwaga: Jeśli powstaje częściowe uszczelnienie (<1 GΩ), wstrzykiwanie prądów ujemnych poprzez obniżenie potencjału podtrzymania (na sterowanym komputerowo sterowniku wzmacniacza) może ułatwić formowanie uszczelnienia i osiągnąć rezystancję gigaomów ("uszczelnienie gigaomowe" lub "gigauszczelnienie" >1 - 5 GΩ). Wysoka rezystancja uszczelki (>1 GΩ) zarówno ograniczy zanieczyszczenie hałasem rejestrowanego sygnału, jak i przyczyni się do stabilności mechanicznej łaty.
  6. Podczas tworzenia się gigaseal użyj sterowanego komputerowo sterownika wzmacniacza, aby zbliżyć potencjał utrzymywania komórki do fizjologicznego potencjału spoczynkowego (Vrest), aby zapobiec nagłym zmianom po pęknięciu błony. Na przykład MSN są zwykle napięte na poziomie -70 lub -80 mV (fizjologicznyspoczynek V: -70 do -90 mV).
  7. Po uformowaniu się gigaseal skompensuj szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Jeśli używasz sterowanego komputerowo amplifier sterownik, taki jak Multiclamp commander, naciśnij "Auto" dla "Cp Fast" i "Cp Slow".
  8. Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne i przekracza 1 GΩ (lub wstrzykuje mniej niż 10 - 20 pA, aby utrzymać komórkę na pożądanym potencjale błonowym), zastosuj krótkie i mocne ssanie przez tę samą rurkę, co w 5,5, aby rozerwać błonę plazmatyczną (Rysunek 2-3).
    Uwaga: Może to wymagać kilku prób. Dobre pęknięcie membrany uzyskuje się, gdy ssanie jest wykonywane na tyle mocno, aby pęknięta membrana nie zatykała mikropipety (co może prowadzić do wzrostu Rs podczas nagrywania), ale na tyle słabo, aby nie zasysać dużej części błony lub komórki.
  9. Po pomyślnym skonfigurowaniu całej komórki należy regularnie monitorować położenie mikropipety, aby ocenić i skorygować znaczny dryft, ponieważ może to prowadzić do utraty łaty. Amplituda dryfu może się różnić w zależności od kilku czynników, np. jakości montażu zestawu i sił ciągnących działających na scenę główną. Idealnie byłoby, gdyby dryf prawie nie istniał.
  10. Przełączając się w tryb "Komórka" w teście membranowym, view różne parametrykomórki, takie jak R, i, Rs iCp . Monitoruj te parametry podczas nagrywania.
    Uwaga: Wszystkie te parametry mogą pomóc w ocenie początkowego stanu zdrowia komórek i typów komórek (patrz sekcja "Test błonowy", krok 4).
  11. Po wykonaniu powyższych kroków pozostań w trybie cęgów napięciowych, aby mierzyć prądy (np. EPSC, IPSC) lub przełącz się na tryb cęgów prądowych, jeśli planujesz mierzyć zmiany napięcia membrany (np. wyzwalanie potencjału czynnościowego). W tym drugim przypadku wstrzyknij dodatni lub ujemny prąd, aby utrzymać ogniwo na żądanym napięciu membrany (aby wykonać ten krok, zapoznaj się z instrukcją obsługi wzmacniacza).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temperatura, czynnik, który może łatwo kontrolować przez eksperymentatora, wpływa na właściwości biofizyczne kanałów jonowych i receptorów, a tym samym na kształt fal prądów postsynaptycznych (PSC) (EPSC i IPSC) oraz zdolność neuronów do wywoływania skoków. Rycina 3 i Rycina 4 pokazują odpowiednio wpływ temperatury na odpalanie neuronów i nachylenie wywołanych EPSC (eEPSC). Wzorzec wyzwalania (rysunek 3) (tj. opóźnienie do 1. sko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje podstawową procedurę przeprowadzania eksperymentów z klamrą krosową całej komórki na neuronach w wycinkach mózgu. Jednak złożoność, potencjał i wrażliwość tej techniki nie mogą być w pełni opisane w tym artykule. W tym miejscu staraliśmy się nakreślić najbardziej podstawowe kroki i podkreślić ważne parametry, które muszą być kontrolowane, aby osiągnąć udane i rygorystyczne nagrania całych komórek. W celu dalszej wiedzy teoretycznej opublikowano wiele książek i artykułów na temat zarówno zapisu krosów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez fundusze startowe UT Southwestern (SK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izolowany generator bodźców impulsowychA.M.P.IMaster-8
Jednostka izolacyjna (ISO-Flex)A.M.P.IISO-Flex
Wzmacniacz sterowany komputerowo Urządzenia molekularneMulticlamp 700B
Cyfrowy system akwizycjiUrządzenia molekularneDigidata 1500
Mikroskop OlympusBX-51
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-200
Grzałka komorowa i liniowaWarner InstrumentsTC-344B
VibratomeSlicer Leica VT1000 S
Ściągacz do mikropipetNarishigePC-10
Kamera obrazującaQ ObrazowanieQIClick-F-M-12
Ściągacz do pipet Narishige PC-10NarishigePC-10
Kapilary szklaneWPITW150F-3
Slice docisk (harfa)Warner Instruments64-0255
Slice ChamberWarner InstrumentsRC-26
Niemetalowa igła strzykawkowaWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Filtry strzykawkoweNalgene176-0045
Pistolet do klejeniaHome Depotróżne
rurki dyspersyjne gazuAce Glass Inc.różne
nożyczki do dekapitacjiHome Depot100649198
Rękojeść skalpela #3World Precision Instruments500236
Małe proste ostre końcówki NożyczkiWorld Precision Instruments14218
Kleszcze do kanalikowania naczyń World Precision Instruments500453
Zakrzywione kleszcze hemostatycznePrecision Instruments501288
Pęseta ekonomiczna #3World Precision Instruments501976-6
SzpatułkaFisher Scientific14357Q
SzpatułkaFisher Scientific14-357Q
Szalka PetriegoFisher Scientific08-747B
Bibuła filtracyjnaLab DepotCFP1-110
Solutions
Cs-Glukonian roztwór wewnętrzny (pH 7,2– 7.3, 280– 290 mOsm)
Kwas D-glukonowy 50% Sigma Aldrich/różneG1951
Cez-OH (CsOH) 50% Sigma Aldrich/różne232041
NaCl, 2.8 mMSigma Aldrich/różneS7653
HEPES, 20 mMSigma Aldrich/różneH3375
EGTA, 0.4 mMSigma Aldrich/różneE4378
tetraetyloamon-Cl, 5 mMSigma Aldrich/różneT2265
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/różneG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/różneA9187
K-roztwór wewnętrzny glukonianu (pH 7,2– 7.3, 280– 290 mOsm)
K D-glukonian, 120 mMSigma Aldrich/różneG4500
KCl, 20 mMSigma Aldrich/różneP3911
HEPES, 10 mMSigma Aldrich/różneH3375
EGTA, 0,2 mMSigma Aldrich/różneE4378
MgCl2Sigma Aldrich/różneM8266
Na2GTP, 0,3 mMSigma Aldrich/różneG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/różneA9187
Standardowy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, osmolarność i asymp; 300-310 mOsm)
KCl, 2,5 mMSigma Aldrich/różneP3911
NaCl, 119 mMSigma Aldrich/ różneS7653
NaH2PO4• H2O, 1 mMSigma Aldrich/różneS9638
NaHCO3, 26,2 mMSigma Aldrich/różneS8875
Glukoza, 11 mMSigma Aldrich/różneG8270
MgSO4-7H2O, 1,3 mMSigma Aldrich/różne230391
CaCl2- 2H2O, 2.5 mMSigma Aldrich/różneC3881
Dodatkowe związki używane do przygotowania roztworów
KOHróżne
Kwas kynureninowySigma Aldrich/różneK3375
World

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  3. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  4. Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
  5. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  6. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
  7. Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
  8. Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , Oxford University Press. (2013).
  9. Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
  10. Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
  11. Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
  12. Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
  13. McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
  14. Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
  15. Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
  16. Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  17. Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. Plasticity of inhibition. Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).
  18. Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
  19. Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
  20. Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
  21. Defelice, L. J. Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , Plenum Press. (1997).
  22. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
  23. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  24. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).
  25. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
  26. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  27. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  28. Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
  29. Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
  30. Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
  31. Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
  32. Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
  33. Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
  34. Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
  35. Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
  36. Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
  37. Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja z przekroju m zgutechnika elektrofizjologicznaanaliza funkcji neuronalnychprzygotowanie mikropipetytworzenie giga uszczelnienia giga sealprzerwanie b onymonitorowanie oporno ci szeregowejpomiar oporno ci wej ciowejocena wywo anych EPSC

Powiązane artykuły