Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Summary

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Abstract

Tradycyjnie, wizualizacja tkanek wymagała, aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była seryjnie cięta i obrazowana, poddając każdą sekcję tkanki unikalnym nieliniowym deformacjom, co dramatycznie utrudniało zdolność do oceny morfologii, dystrybucji i łączności komórkowej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Jednak techniki oczyszczania optycznego zmieniają sposób wizualizacji tkanek. Podejścia te pozwalają na dogłębne zbadanie nienaruszonych preparatów narządowych, dostarczając ogromnego wglądu w strukturalną organizację tkanek w zdrowiu i chorobie. Techniki takie jak Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) osiągają ten cel poprzez zapewnienie matrycy, która wiąże ważne biomolekuły, jednocześnie umożliwiając swobodną dyfuzję lipidów rozpraszających światło. Usunięcie lipidów, a następnie dopasowanie współczynnika załamania światła, sprawia, że tkanka jest przezroczysta i łatwo obrazowana w 3 wymiarach (3D). Niemniej jednak elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC) zastosowane w pierwotnym protokole CLARITY może być trudne do skutecznego wdrożenia, a zastosowanie zastrzeżonego rozwiązania do dopasowywania współczynnika załamania światła sprawia, że rutynowe stosowanie tej techniki jest kosztowne. Raport ten demonstruje wdrożenie prostego i niedrogiego protokołu optycznego oczyszczania, który łączy pasywny CLARITY w celu poprawy integralności tkanek oraz 2,2′-tiodieetanol (TDE), wcześniej opisane rozwiązanie dopasowujące współczynnik załamania światła.

Introduction

Zdolność do obrazowania kompletnych struktur neuroanatomicznych jest niezwykle cenna dla zrozumienia mózgu w zdrowiu i chorobie. Tradycyjnie, obrazowanie 3D wymagało przekroju tkanek w celu zapewnienia rozdzielczości osiowej i wizualizacji głębokich struktur anatomicznych. Takie podejście może generować zestawy danych o wysokiej rozdzielczości, ale wymaga zaawansowanych technik rekonstrukcji obrazu i jest bardzo pracochłonne. W związku z tym ograniczono ją do obrazowania małych objętości tkanek^1-3. Z drugiej strony sekcje optyczne dobrze nadają się do tworzenia obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości tkanek znakowanych fluorescencyjnie. Ponieważ przekrój optyc....

Protocol

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Do tych eksperymentów wykorzystano myszy THY1-YFP, PLP-EGFP i PV-TdTomato, ale wszystkie myszy wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych można z powodzeniem oczyścić i zobrazować.

1. Przygotowanie tkanek

Uwaga: Paraformaldehyd (PFA) i akrylamid są toksyczne i drażniące. Wykonuj eksperymenty z użyciem tych odczynników w dygestoriach i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).

1. Zwierzę należy złożyć w ofier....

Results

Wizualizacja strukturalnej organizacji mózgu jest kluczowa dla zrozumienia, jak morfologia i łączność wpływają na funkcjonowanie mózgu w zdrowiu i chorobie. Techniki oczyszczania optycznego umożliwiają obrazowanie populacji komórek w 3D w nienaruszonych tkankach, co pozwala nam na spójne badanie morfologii i łączności.

Myszy, które wyrażają białka fluorescencyjne napędzane przez promotory specyficzne dla subpopulacji komórek, po.......

Discussion

Pasywne oczyszczanie tkanek zanurzonych w hydrożelu (pasywne CLARITY) jest prostą i niedrogą metodą usuwania dużych fragmentów tkanki. Takie podejście nie wymaga dedykowanego sprzętu i można je łatwo wykonać w wytrząsarce o kontrolowanej temperaturze. W ciągu kilku tygodni nawet duże, silnie zmielinizowane tkanki, takie jak cały mózg lub rdzeń kręgowy, staną się przezroczyste i będą nadawały się do mikroskopii. Mimo że raport ten koncentruje się na oczyszczaniu tkanek OUN, pasywna CLARITY może być stosowana do każdej tka.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Fisher	BP399-1
32% paraformaldehyd (PFA)	Mikroskopia elektronowa	Sciences 15714-5	perfuzja i hydrożel
2,2'-tiodieetanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła
40% akryloamid	Bio-Rad	161-0140	hydrożel
2% bis-akryloamid	Bio-Rad	161-0142	hydrożel
VA-044 inicjator	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044
hydrożel Kwas borowy	Sigma-Aldrich	B7901	bufor oczyszczający
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Bufor oczyszczający	Fisher	BP166-5
Wodorotlenek sodu	Fisher	55255-1
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	52002-100G	Konserwant
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G
Heparyna	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfuzja
Azotan sodu	Fisher	BP360-500	perfuzja
Sondy molekularne	DAPI	D1306	barwienie jądrowe
99,9% izofluran	Phoenix	57319-559-06	znieczulający
kwas hydrocholorowy			Fisher A1445-500
Naczynie ze szklanym dnem	Willco	HBSB-5040	Naczynia Willco
Klej wielokrotnego użytku	Bostick	371351	Blu-Tack
Elastomer silikonowy	World Precision	Instruments KWIK-CAST Kwik-Cast
Niestrzępiąca się chusteczka	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matryca mózgu myszy	Roboz	SA-2175	tkanka
do cięciaOstrza matrycy	Roboz	RS-9887	sekcja tkanki
Pompa perystaltyczna	Cole-Parmer	77122-24	pefuzja
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Mikroskopia Leica	SP5
Oprogramowanie do obrazowania	Mikroskopia Leica	LAS AF