Method Article

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, wizualizacja tkanek wymagała, aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była seryjnie cięta i obrazowana, poddając każdą sekcję tkanki unikalnym nieliniowym deformacjom, co dramatycznie utrudniało zdolność do oceny morfologii, dystrybucji i łączności komórkowej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Jednak techniki oczyszczania optycznego zmieniają sposób wizualizacji tkanek. Podejścia te pozwalają na dogłębne zbadanie nienaruszonych preparatów narządowych, dostarczając ogromnego wglądu w strukturalną organizację tkanek w zdrowiu i chorobie. Techniki takie jak Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) osiągają ten cel poprzez zapewnienie matrycy, która wiąże ważne biomolekuły, jednocześnie umożliwiając swobodną dyfuzję lipidów rozpraszających światło. Usunięcie lipidów, a następnie dopasowanie współczynnika załamania światła, sprawia, że tkanka jest przezroczysta i łatwo obrazowana w 3 wymiarach (3D). Niemniej jednak elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC) zastosowane w pierwotnym protokole CLARITY może być trudne do skutecznego wdrożenia, a zastosowanie zastrzeżonego rozwiązania do dopasowywania współczynnika załamania światła sprawia, że rutynowe stosowanie tej techniki jest kosztowne. Raport ten demonstruje wdrożenie prostego i niedrogiego protokołu optycznego oczyszczania, który łączy pasywny CLARITY w celu poprawy integralności tkanek oraz 2,2′-tiodieetanol (TDE), wcześniej opisane rozwiązanie dopasowujące współczynnik załamania światła.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do obrazowania kompletnych struktur neuroanatomicznych jest niezwykle cenna dla zrozumienia mózgu w zdrowiu i chorobie. Tradycyjnie, obrazowanie 3D wymagało przekroju tkanek w celu zapewnienia rozdzielczości osiowej i wizualizacji głębokich struktur anatomicznych. Takie podejście może generować zestawy danych o wysokiej rozdzielczości, ale wymaga zaawansowanych technik rekonstrukcji obrazu i jest bardzo pracochłonne. W związku z tym ograniczono ją do obrazowania małych objętości tkanek1-3. Z drugiej strony sekcje optyczne dobrze nadają się do tworzenia obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości tkanek znakowanych fluorescencyjnie. Ponieważ przekrój optyczny jest z natury trójwymiarowy, nie wymaga rozległych obliczeń, aby uzyskać objętość obrazu 3D. Jednak rozpraszanie światła i zmętnienie tkanek ograniczają głębokość, na której można optycznie przeciąć tkanki. Głębokość obrazowania jest ograniczona do około 150 μm w laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej i do mniej niż 800 μm przy użyciu dwufotonowej mikroskopii wzbudzenia4-8.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, ostatnio opracowano kilka technik optycznego oczyszczania, a następnie udoskonalono je, aby umożliwić głębokie obrazowanie mikroskopowe nienaruszonych tkanek. Użycie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BABB) w celu utrwalenia tkanek stało się przezroczyste było jednym z najwcześniejszych podejść9. Podejście to było jednak ograniczone przez wygaszanie fluorescencji w próbkach i niepełne oczyszczanie silnie zmielinizowanych struktur10. Udoskonalenia tej techniki, takie jak obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem (3DISCO), doprowadziły do bardzo szybkiego i całkowitego oczyszczenia tkanek, ale nadal cierpią z powodu szybkiej utraty sygnałów fluorescencyjnych, zwłaszcza żółtego białka fluorescencyjnego (YFP)10. Roztwory czyszczące na bazie wody, takie jak Sca/e11 i SeeDB12, zachowują sygnały fluorescencyjne, ale nie usuwają całkowicie silnie zmielinizowanych tkanek. Clear, Untracted Brain Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) to obiecująca nowa technologia oczyszczania optycznego, która wydaje się przezwyciężać ograniczenia wcześniej opracowanych rozwiązań oczyszczania na bazie wody13. W przeciwieństwie do innych technik oczyszczania optycznego, Clear Lipid-exchanged Hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 osadza mózg w porowatej matrycy, która zapewnia integralność strukturalną białek, kwasów nukleinowych i małych cząsteczek, pozostawiając lipidy niezwiązane. Lipidy są następnie usuwane elektroforetycznie, czego kulminacją jest optycznie oczyszczony mózg, który można łatwo zobrazować i równie łatwo zbadać przy użyciu powszechnie dostępnych technik.

Elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC) służy do usuwania lipidów z tkanek zanurzonych w hydrożelu w CLARITY, jednak ETC może być trudne do konsekwentnego wdrażania, a tkanki poddawane elektroforezie mogą wykazywać zniekształcenia tkanek, brązowienie, utratę fluorescencji i reaktywność przeciwciał. Pasywne oczyszczanie lipidów pozwala uniknąć tych ograniczeń, ale wymaga wydłużenia czasu usuwania15-17. Oczyszczanie pasywne pozwala również na równoległe oczyszczanie dużej liczby próbek, ponieważ nie jest ograniczone liczbą dostępnych aparatów ETC. Zmniejszenie stężenia paraformaldehydu i wykluczenie bis-akrylamidu z hydrożelu doprowadziło do znacznego wzrostu szybkości usuwania kosztem większej ekspansji tkanek16. Opracowano tańsze alternatywy dla rozwiązania do dopasowywania indeksu refrakcji stosowanego w oryginalnej technice CLARITY17-19. 2,2'-tiodieetanol (TDE) jest niedrogim i szybkim środkiem oczyszczającym mózg, który odwraca część ekspansji tkanki, która zachodzi podczas usuwania lipidów18. W raporcie uwzględniono pasywne oczyszczanie tkanki osadzonej w hydrożelu oraz zastosowanie TDE jako rozwiązania dopasowującego współczynnik załamania światła do oryginalnej techniki CLARITY w celu uzyskania wysoce powtarzalnego i niedrogiego protokołu optycznego oczyszczania ośrodkowego układu nerwowego myszy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Do tych eksperymentów wykorzystano myszy THY1-YFP, PLP-EGFP i PV-TdTomato, ale wszystkie myszy wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych można z powodzeniem oczyścić i zobrazować.

1. Przygotowanie tkanek

Uwaga: Paraformaldehyd (PFA) i akrylamid są toksyczne i drażniące. Wykonuj eksperymenty z użyciem tych odczynników w dygestoriach i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).

  1. Zwierzę należy złożyć w ofierze w komorze eutanazyjnej z ~1 ml izofluranu do momentu ustania oddychania (~2 - 3 min).
  2. Użyć pompy perystaltycznej ustawionej na ~5 ml/min, aby wykonać dosercową perfuzję myszy roztworem perfuzyjnym (Tabela 1) w temperaturze 4 °C, aż krew zostanie usunięta z tkanek (5 - 10 min).
  3. Zmienić perfuzat na roztwór utrwalający (Tabela 1) w temperaturze 4 °C, aż szyja i ogon znacznie usztywnieją (5-10 min).
  4. Zakończ perfuzję i odetnij głowę zwierzęciu. Ostrożnie wypreparuj mózg z czaszki, najpierw usuwając tkankę łączną otaczającą czaszkę, a następnie usuwając kość z brzusznej powierzchni czaszki i podnosząc mózg (ryc. 1a), jak opisano w 20.
    Uwaga: Szczególną uwagę należy zwrócić na usunięcie kości otaczającej płaty kłaczkowate móżdżku i opuszki węchowe.
    1. Wypreparuj rdzeń kręgowy od kręgosłupa, delikatnie wkładając końcówkę cienkich, ostrych nożyczek między rdzeń kręgowy a kręgosłup i odcinając poszczególne segmenty kręgosłupa, jak opisano w 21.
  5. Hemisekcję mózgu, umieszczając go w plastikowej matrycy mózgu myszy i przecinając wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza matrycy.
  6. Dodać każdą półkulę i rdzeń kręgowy do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml z ~40 ml roztworu hydrożelu (Tabela 1). Od tego momentu przykryj probówki folią aluminiową, aby chronić fluorofory podczas wszystkich kolejnych kroków.
  7. Inkubować probówkę zawierającą próbkę w hydrożelu w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (~30 obr./min) przez 7 dni.

2. Polimeryzacja

  1. Wyrzucić ~25 ml hydrożelu, zachowując próbkę i ~25 ml hydrożelu w probówce wirówkowej.
  2. Odtlenić próbkę, zdejmując nakrętkę i umieszczając probówkę wirówkową w słoiku eksykatora i podłączając słoik do próżni. Stosować próżnię przez co najmniej 10 minut, aby rozpuszczone gazy wydostały się z roztworu i utworzyły pęcherzyki. Delikatnie wstrząśnij, aby usunąć bąbelki.
  3. Wymień próżnię w słoiku eksykatora na 100% azot gazowy w ciągu 2 - 3 minut. Gdy ciśnienie się wyrówna (po otwarciu górnej części słoika eksykatora), szybko zakryj rurkę, aby zapobiec ponownemu wprowadzeniu tlenu.
  4. Polimeryzować hydrożel, umieszczając probówkę z próbką w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 3 godziny, aż do zakończenia polimeryzacji. Spolimeryzowany hydrożel przyjmie konsystencję przypominającą żel (ryc. 1b). Uwaga: Dopuszczalna jest niewielka ilość niespolimeryzowanego hydrożelu na górze.
  5. Za pomocą szpatułki usuń spolimeryzowaną próbkę z probówki wirówkowej, a następnie odetnij nadmiar hydrożelu z próbki.
  6. Usuń pozostały hydrożel, umieszczając próbkę na niestrzępiącej się chusteczce i delikatnie pocierając i tocząc po niej tkankę, pozostawiając na próbce tylko cienką warstwę spolimeryzowanego hydrożelu.

3. Usuwanie lipidów

Uwaga: Tkanka oczyszczona z lipidów jest delikatna, należy obchodzić się z nią ostrożnie. Podczas opróżniania probówki należy użyć sitka do komórek, aby uniknąć utraty próbki. Ponadto próbka będzie pęcznieć przez cały proces oczyszczania, jednak pęcznienie można odwrócić podczas procesu dopasowywania współczynnika załamania.

Uwaga: Dodecylosiarczan sodu (SDS) i kwas borowy są drażniące. Przeprowadzaj eksperymenty z ich użyciem w dygestorium i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).

  1. Przenieść spolimeryzowaną próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 45 ml buforu klarującego (tabela 1). Inkubować w temperaturze 45 °C z delikatnym wstrząsaniem (~30 obr./min). Zmieniaj bufor codziennie przez pierwsze 7 dni, wylewając zużyty bufor czyszczący do odpadów chemicznych i dodając ~45 ml świeżego buforu czyszczącego. Probówki wirówkowe zawierające próbki należy przechowywać przykryte folią aluminiową w celu ochrony fluoroforów.
  2. Po upływie pierwszych 7 dni inkubować próbkę w temperaturze 40 °C i wymieniać bufor czyszczący co 2-3 dni. Kontynuuj oczyszczanie, aż wszystkie lipidy zostaną rozpuszczone, a tkanka osiągnie przezroczystość (ryc. 1c). Będzie to 4 - 6 tygodni dla półkuli mózgu myszy i 2 - 4 tygodnie dla rdzenia kręgowego.
  3. Po oczyszczeniu tkanki przenieść próbkę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przemyć 4 razy w PBST (Tabela 1) w temperaturze 40 °C z delikatnym wstrząsaniem (~30 obr./min) przez 24 godziny w celu usunięcia pozostałości SDS.

4. Barwienie molekularne

Uwaga: Dichlorowodorek 4',6-Diamidino-2-Fenyloindolu (DAPI) jest substancją drażniącą i wszelkie eksperymenty z jego użyciem powinny być przeprowadzane w dygestoriach i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).

  1. Przenieść próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i napełnić 1 μg/ml DAPI w 1x PBST, pH 7,5. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 24 godziny. Probówki wirówkowe zawierające próbki należy przechowywać przykryte folią aluminiową w celu ochrony fluoroforów.
  2. Prać 3 razy w PBST w temperaturze pokojowej przez co najmniej 6 godzin/pranie.

5. Dopasowanie współczynnika załamania światła

Uwaga: 2,2′-tiodieetanol (TDE) jest substancją drażniącą i wszelkie eksperymenty z jego użyciem powinny być przeprowadzane pod wyciągiem i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu).

  1. Przenieść próbkę do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i napełnić 30% (v/v) TDE w 1x PBS, pH 7,5. Inkubować w temperaturze 40 °C z delikatnym wstrząsaniem (~30 obr./min) przez 24 godziny.
  2. Zamień 30% TDE na 63% (v/v) TDE w 1x PBS, pH 7,5. Inkubować w temperaturze 40 °C z delikatnym wstrząsaniem przez 24 godziny
    Uwaga: Próbka zmniejszy się z powrotem do mniej więcej oryginalnego rozmiaru.
  3. Na płaskiej, czystej powierzchni rozwałkuj kawałek kleju wielokrotnego użytku do cylindra o jednolitej średnicy nieco większej niż grubość próbki.
  4. Połóż samoprzylepny cylinder wielokrotnego użytku w otwartym okręgu (średnica wewnętrzna ~25 mm z małym otworem u góry) na szklanym naczyniu o średnicy 40 mm. Jeśli konieczne jest wprowadzenie poprawek, wyjmij cylinder ze szkła i przetnij żyletką.
  5. Użyj końcówki do pipety p1000, aby utworzyć uszczelnienie między klejem wielokrotnego użytku a szkłem, owijając go wokół zewnętrznej krawędzi cylindra.
  6. Umieść ~100 μl 63% TDE na szklanym naczyniu i rozprowadź dookoła, aby pokryć szklaną powierzchnię w kręgu kleju wielokrotnego użytku.
  7. Za pomocą szpatułki ostrożnie umieść próbkę na środku koła, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków.
  8. Odpipetować kolejne 100 μl 63% TDE bezpośrednio na próbkę, a następnie natychmiast umieścić okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 40 mm na kleju wielokrotnego użytku.
  9. Używając palca wskazującego, środkowego i serdecznego obu rąk, ostrożnie dociśnij obwód koła, aż szkło nakrywkowe zetknie się z próbką.
  10. Powoli ustaw naczynie ze szklanym dnem w pozycji pionowej, opierając się o powierzchnię, a następnie dodaj 63% TDE za pomocą pipety, aż roztwór dotrze do małego otworu u góry. Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby osuszyć końcówkę pipety, aby roztwór nie kapał na szkło. Aby uniknąć pęcherzyków w komorze, nigdy nie opróżniaj pipety do końca.
  11. Do małego otworu dodaj elastomer silikonowy, aby zamknąć okrąg i stworzyć zamkniętą komorę. Odczekaj 5 minut, aż wyschnie przed obrazowaniem.

6. Mikroskopia

Uwaga: Lasery używane w konfokalnej, jednopłaszczyznowej oświetleniu i mikroskopii świetlnej są bardzo silne i mogą powodować ślepotę. Wszelkie eksperymenty z użyciem laserów powinny być wykonywane po intensywnym szkoleniu oraz z dużą ostrożnością i odpowiednią ochroną oczu.

  1. Umieść komorę obrazowania z próbką w środku na stoliku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
  2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Aby włączyć laser wzbudzenia argonem, kliknij zakładkę konfiguracji u góry programu, a następnie ikonę lasera. Zaznacz pole obok argonu, aby zasilić laser i przesuń skalę slajdów do 30%. Obserwuj, jak wskazówka powoli rozgrzewa się do wybranej pozycji.
    1. Wróć do zakładki pobierania u góry. W dużym polu "Ustawienia ścieżki wiązki" przejdź do pola ustawień ładowania/zapisywania i wybierz menu rozwijane, aby wybrać odpowiedni kanał długości fali do obrazowania YFP (527 nm).
  3. Wybierz odpowiednie cele do obrazowania, znajdując czerwone hiperłącze oznaczone "cel: bieżący obiekt" w polu ustawień kanału. Kliknięcie na zakładkę otworzy wszystkie dostępne cele, a wybrany wybór automatycznie obróci wieżyczkę.
    1. Używaj obiektywów (np. 10X) o dużej odległości roboczej (większej niż grubość obrazowanej tkanki, np. 11 mm) i dużej aperturze numerycznej (np. 0,3), aby zmaksymalizować rozdzielczość obrazu w płaszczyźnie i zminimalizować grubość przekroju optycznego.
  4. W lewej kolumnie menu rozwijanych otwórz okno "XY: rozdzielczość", aby ustawić macierz akwizycji, zwaną "formatem", na 1,024 x 1,024 lub wartość odpowiednią dla limitu rozdzielczości bocznej celu. Ustaw współczynnik powiększenia tak niski, jak to możliwe (np. 1.7).
  5. W tym samym oknie ustaw parametry średniej z 8 wierszy i średnią z 1 klatki, odpowiednio rozwijając indywidualnie oznaczone menu. Używaj dużych wartości dla wysokiego stosunku sygnału do szumu i małych wartości dla szybkiej akwizycji.
    Uwaga: Średnia z 8 linii i średnia z 1 klatki pozwolą uzyskać wysokiej jakości obrazy półkuli mózgu myszy w ciągu około 4 godzin.
  6. Zlokalizuj próbkę za pomocą elementów sterujących stolika. Gdy reprezentatywne pole jest widoczne, ustaw wzmocnienie i offset.
    Uwaga: Wzmocnienie i przesunięcie będą się znacznie różnić w zależności od typu tkanki, fluoroforów i/lub obrazowanych cech anatomicznych. W przypadku YFP ustaw wartości od 760 do 780 dla wzmocnienia i od -1,0 do -1,5 dla przesunięcia.
  7. Wybierz "skanowanie kafelków" i wybierz granice interesującego Cię regionu. Ustaw górny i dolny limit stosu z, który ma zostać pobrany. Ustaw grubość przekroju optycznego w oparciu o limit rozdzielczości przekroju optycznego obiektywu.
    Uwaga: Limit rozdzielczości przekroju optycznego obiektywu jest określany przede wszystkim przez jego aperturę numeryczną. Większość programów do sterowania mikroskopem automatycznie oblicza wartość odpowiednią dla używanego obiektywu. W przypadku obiektywu 10X z aperturą numeryczną 0,3 byłoby to około 11 μm.
  8. Rozpocznij pobieranie.
    Uwaga: Może to potrwać kilka godzin.
  9. Zbieraj obrazy o wyższej rozdzielczości przy użyciu obiektywów o większym powiększeniu z określonych obszarów zainteresowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja strukturalnej organizacji mózgu jest kluczowa dla zrozumienia, jak morfologia i łączność wpływają na funkcjonowanie mózgu w zdrowiu i chorobie. Techniki oczyszczania optycznego umożliwiają obrazowanie populacji komórek w 3D w nienaruszonych tkankach, co pozwala nam na spójne badanie morfologii i łączności.

Myszy, które wyrażają białka fluorescencyjne napędzane przez promotory specyficzne dla subpopulacji komórek, po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pasywne oczyszczanie tkanek zanurzonych w hydrożelu (pasywne CLARITY) jest prostą i niedrogą metodą usuwania dużych fragmentów tkanki. Takie podejście nie wymaga dedykowanego sprzętu i można je łatwo wykonać w wytrząsarce o kontrolowanej temperaturze. W ciągu kilku tygodni nawet duże, silnie zmielinizowane tkanki, takie jak cały mózg lub rdzeń kręgowy, staną się przezroczyste i będą nadawały się do mikroskopii. Mimo że raport ten koncentruje się na oczyszczaniu tkanek OUN, pasywna CLARITY może być stosowana do każdej tka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była hojnie wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) grant 1R01NS086981 oraz Fundację Conrada N. Hiltona. Dziękujemy dr Laurentowi Bentolili i dr Matthew Schiblerowi za ich nieocenioną pomoc w mikroskopii konfokalnej. Dziękujemy tym, którzy przyczynili się do powstania forum CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). Szczególnie dziękujemy dr Karlowi Deisserothowi za otwarcie swojego laboratorium, w którym można uczyć tej fascynującej techniki. Autorzy są wdzięczni za hojne wsparcie ze strony Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace Foundation, The Ahmanson Foundation, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. and Linda R. Dietel Philanthropic Fund oraz Northstar Fund. Badania przedstawione w tej publikacji były również częściowo wspierane przez National Center for Research Resources oraz przez Biuro Dyrektora National Institutes of Health pod numerami nagród C06RR012169, C06RR015431 i S10OD011939. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)FisherBP399-1
32% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowaSciences 15714-5perfuzja i hydrożel
2,2'-tiodieetanol (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Groztwór dopasowujący współczynnik załamania światła
40% akryloamidBio-Rad161-0140hydrożel
2% bis-akryloamidBio-Rad161-0142hydrożel
VA-044 inicjatorWako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044
hydrożel Kwas borowySigma-AldrichB7901bufor oczyszczający
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Bufor oczyszczającyFisherBP166-5
Wodorotlenek soduFisher55255-1
Azydek soduSigma-Aldrich52002-100GKonserwant
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500G
HeparynaSigma-AldrichH3393-50KUperfuzja
Azotan soduFisherBP360-500perfuzja
Sondy molekularneDAPID1306barwienie jądrowe
99,9% izofluranPhoenix57319-559-06znieczulający
kwas hydrocholorowyFisher A1445-500
Naczynie ze szklanym dnemWillcoHBSB-5040Naczynia Willco
Klej wielokrotnego użytkuBostick371351Blu-Tack
Elastomer silikonowyWorld PrecisionInstruments KWIK-CAST Kwik-Cast
Niestrzępiąca się chusteczkaKimberly-Clark34120KimWipe
Matryca mózgu myszyRobozSA-2175tkanka
do cięciaOstrza matrycyRobozRS-9887sekcja tkanki
Pompa perystaltycznaCole-Parmer77122-24pefuzja
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyMikroskopia LeicaSP5
Oprogramowanie do obrazowaniaMikroskopia LeicaLAS AF

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
  3. MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
  4. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
  5. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
  6. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
  7. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  8. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
  9. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  12. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  15. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
  16. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
  17. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  18. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808(2015).
  19. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  20. Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848(2012).
  21. Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580(2015).
  22. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
  23. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles