Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów do modelowania nowotworów dostarczyło ważnych informacji na temat biologii nowotworów i reakcji na leki. Są one jednak czasochłonne, drogie i pracochłonne. Aby pokonać te przeszkody, wiele grup badawczych zwróciło się ku sferoidalnym kulturom komórek nowotworowych. Chociaż są użyteczne, sferoidy lub agregaty nowotworowe nie replikują interakcji komórka-macierz, jak stwierdzono in vivo. W związku z tym trójwymiarowe (3D) podejścia do hodowli wykorzystujące rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej zapewniają bardziej realistyczny system modelowy do badań. Począwszy od ksenoprzeszczepów podskórnych lub wewnątrzczaszkowych, tkanka nowotworowa jest dysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki, podobnej do neurosfer nowotworowych komórek macierzystych. Komórki te są następnie umieszczane w macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej od człowieka, biożelu 3D human, w celu wygenerowania dużej liczby mikroguzów. Co ciekawe, mikroguzy mogą być hodowane przez około miesiąc z wysoką żywotnością i mogą być wykorzystywane do testowania odpowiedzi na leki przy użyciu standardowych testów cytotoksyczności, takich jak bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT) i obrazowanie żywych komórek przy użyciu Calcein-AM. Co więcej, można je analizować za pomocą immunohistochemii lub zbierać w celu profilowania molekularnego, takiego jak wysokoprzepustowe profilowanie kinomiczne oparte na macierzyach, które również zostało tutaj szczegółowo opisane. Mikronowotwory 3D reprezentują zatem wszechstronny, wysokoprzepustowy system modelowy, który może dokładniej odwzorować biologię nowotworów in vivo niż tradycyjne podejścia.
Wprowadzenie
Najczęstszymi pierwotnymi złośliwymi nowotworami mózgu wewnątrzczaszkowymi są gwiaździaki III stopnia i glejak wielopostaciowy IV stopnia (glejak wielopostaciowy lub GBM). Guzy te oferują złe rokowania z medianą rocznego przeżycia wynoszącą od 12 do 15 miesięcy przy obecnych terapiach GBM w USA1-3. Terapie multimodalne obejmują chirurgię, radioterapię i chemioterapię, w tym temozolomid (TMZ) i leki ukierunkowane na kinazy. Sygnalizacja kinazy jest często rozregulowana w GBM, w tym podzbiory guzów z mutacjami amplifikacyjnymi lub aktywującymi w receptorze naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), wzrost sygnalizacji receptora płytkowego czynnika wzrostu (PDGFR), zwiększona kinaza fosfatydylo-inozytol-3 (PI3K) i sygnalizacja angiogenna wspierająca guz poprzez receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR), a także inne szlaki sterowane kinazą4-6. Obecne modele in vitro i in vivo często tracą te reprezentatywne zmiany7. Ponadto profilowanie genetyczne nie przyniosło oczekiwanych korzyści, które mogą odzwierciedlać fakt, że zmiany genetyczne i epigenetyczne nie zawsze przewidują zmiany na poziomie aktywności białek, gdzie większość środków ukierunkowanych na kinazy działa bezpośrednio, a terapie o innych mechanizmach działania mogą działać pośrednio.
Tradycyjna nieśmiertelnikowa linia komórkowa, która może być przenoszona w nieskończoność, od dawna jest standardem w testach narkotykowych ze względu na łatwość utrzymania i odtwarzalność. Jednak model ten cierpi z powodu bogatego w składniki odżywcze (i sztucznego) środowiska wzrostu, które selekcjonuje szybko rosnące komórki, które znacznie różnią się od pierwotnego guza. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowaniem bardziej realistycznych systemów modelowych, które odzwierciedlają bardziej złożony system biologiczny guza, jaki jest obecny u pacjenta. Ksenoprzeszczepy nowotworowe opracowane bezpośrednio z pierwotnego guza wyhodowanego u myszy ("ksenolina", ksenoprzeszczep pochodzący od pacjenta lub PDX) zapewniają bardziej refleksyjny system modelowy, szczególnie w przypadku terapii przeciwnowotworowych, ponieważ uważa się, że bardziej wiarygodnie przewidują sukces kliniczny. 8 Pomimo bardziej refleksyjnej biologii modele te są drogie oraz trudne do opracowania i utrzymania. Co więcej, nie są one podatne na badania wysokoprzepustowe. Potrzeba lepszego opracowania modeli biologicznych, które dokładniej odzwierciedlają zmiany molekularne w guzach pierwotnych, oraz profilowania i testowania tych modeli przy użyciu bezpośrednich pomiarów aktywności kinazy, a nie zastępczych markerów genetycznych, jest oczywista.
Dobrze wiadomo, że w przeciwieństwie do dwuwymiarowych (2D) kultur jednowarstwowych, modele 3D lub testy wielokomórkowe mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotnych punktów końcowych9-11. Powszechne podejścia do hodowli 3D obejmują mikronośniki pokryte matrycą i tworzenie sferoidów komórkowych. Sferoidy guza można generować poprzez agregację komórkową przy użyciu kolby obrotowej, płytki pHEMA i technik wiszących kropli. Ograniczenia tych podejść obejmują: niezdolność niektórych komórek do tworzenia stabilnych sferoid, zmienność wzrostu i wyzwania związane z mieszanymi typami komórek. Alternatywnie, wiele syntetycznych (hydrożel, polimer) i matryc Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) pochodzenia zwierzęcego z mięsaków myszy, kolagenu bydlęcego) zostało opracowanych do badań kultur 3D12-14. Mysia matryca EHS jest szeroko stosowana, ale wiadomo, że wspomaga wzrost i różnicowanie komórek in vitro i in vivo15.
Aby odtworzyć biologię nowotworów w 3D, dr Raj Singh et al. opracowali ludzki system biomatrycowy.Lokal mieszkalny 16. Naturalny, wolny od czynników wzrostu ludzki biożel pozwala na tworzenie rusztowań hodowlanych 3D (kulki, krążki), które wspierają długotrwałą hodowlę wielu typów komórek. Stworzono serię projektów 3D ludzkich kultur biożelowych do badania wzrostu guza, adhezji, angiogenezy i właściwości inwazji. Zalety i właściwości biożelu ludzkiego w porównaniu ze zwykłymi mysimi żelami EHS podsumowano w Tabeli 1 i Tabeli 2.
| źródło: | Ludzkie amniony (tkanka zbiorcza) Wolne od patogenów, zwolnione z IRB/zatwierdzone |
| Charakter ECM: | Biożel niedenaturowany (produkcja GLP) |
| Klucz Składniki: | Col-I (38%), Laminina (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entaktyna i HSPG (< 3%) |
| Bez GF: | Niewykrywalny EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (nieangiogenny, nietoksyczny) |
Tabela 1: Właściwości ludzkiego biożelu w porównaniu do popularnych żeli EHS.
| Ludzki biożel | Żele EHS |
| Naturalna ludzka matryca | Odtworzona matryca myszy |
| Kontrolowany wzrost i różnicowanie komórek | Może promować wzrost i różnicowanie komórek |
| Fizjologiczna ekspresja genów | Zmienna ekspresja genów |
| Model hodowli tkankowej 3D | Model kultury oparty na talerzach |
Tabela 2: Zalety biożelu ludzkiego w porównaniu z powszechnie stosowanymi żelami EHS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie oceny terapii ksenoprzeszczepami zostały przeprowadzone przy użyciu ortotopowego modelu guza glejaka na protokole zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Izolacja komórek ksenoprzeszczepu GBM pochodzących od pacjenta
- Przygotowanie odczynników
- Kolagenazę-I należy rozpuścić w sterylnej wodzie do stężenia 5 mg/ml i przefiltrować jałowo. Przechowywać w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C (końcowe stężenie wynosi 50 μg/ml w 100 ml roztworu enzymatycznego).
- Rozpuścić 100 μg naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać w 100 μl (5 μg/100 μl) podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do końcowego stężenia 10 ng/ml.
- Rozpuścić 100 μg FGF-β w 2 ml sterylnego PBS. Przechowywać w 100 μl (5 μg/100 μl) podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do końcowego stężenia 10 ng/ml.
- Do jednej butelki o pojemności 500 ml pożywki neurobazalnej (NBM) dodać następujące ilości: 10 ml suplementu B-27 bez witaminy A, 5 ml suplementu N2, 100 μl EGF, 100 μl zasady czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), 5 ml amfoterycyny B, 0,5 ml gentamycyny, 5 ml L-glutaminy.
- Przygotować świeży roztwór enzymatyczny przez połączenie: 98,5 ml PBS, 1 ml kolagenazy-1, 0,5 ml 10x trypsyna/EDTA i wysterylizować przez filtrację przez filtr porowy 0,22 μm.
- Przygotować lub uzyskać sterylną pożywkę do hodowli komórkowych Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 o małej objętości z 7% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1x PBS bez wapnia i magnezu.
- Dezagregacja guza
UWAGA: Do tej procedury niezbędna jest mysz atymyczna nu / nu, której wcześniej wstrzyknięto komórki nowotworowe w prawą flankę i pozwolono jej z wyczuwalnej masy guza. W przedstawionych tutaj przykładach użyliśmy komórek GBM ksenoprzeszczepu pochodzących od pacjenta, JX10 i JX1217.- Wysterylizuj obszar roboczy, rozpylając 2% chlorheksydyny i ustaw obszar roboczy z niezbędnymi instrumentami/materiałami, w tym jednorazowym uchwytem, kleszczami, skalpelem, szklaną szalką Petriego, roztworem enzymu, PBS i chlorheksydyną (patrz rysunek 2A).
- Eutanazja myszy/myszy z guzem boku. Dążyć do osiągnięcia wskaźnika wypierania CO20%/min przy użyciu 30% CO2 . Po zatrzymaniu oddechu u myszy utrzymuj przepływ CO2 przez około 1 minutę (zwykle łącznie 3 minuty). Myszy są usuwane z komory, a zwichnięcie szyjki macicy jest wykonywane jako wtórne potwierdzenie eutanazji. Spryskaj zwierzę 3% chlorheksydyną, aby zdezynfekować skórę.
- Trzymając mysz stabilnie, wykonaj półkoliste nacięcie skóry ~ 1,5 cm od masy guza (guz wszczepiony z boku) za pomocą sterylnego jednorazowego skalpela z ostrzem #11, zaczynając od czaszki do masy guza i nacinając w kierunku brzucha myszy i wokół końca ogonowego.
- Odbij skórę nad masą guza za pomocą palców z delikatnym pociągnięciem na ogonowym końcu nacięcia, a następnie popchnij powierzchnię skóry, aby podnieść guz, aby mieć najlepszy dostęp bez dotykania guza (patrz ryc. 2B).
- Użyj rozwarstwienia za pomocą kleszczy, aby delikatnie uwolnić masę nowotworową ze ściany otrzewnej i ze skóry (patrz ryc. 2C).
- Przenieś masę guza za pomocą kleszczy na sterylną szklaną szalkę Petriego (NIE WOLNO używać plastikowych naczyń, aby zapobiec pękaniu podczas mielenia) i odpowiednio wyrzuć tuszę i odłóż te narzędzia na bok.
- Użyj nowego zestawu sterylnych narzędzi (skalpel z ostrzem #11, półzakrzywione kleszcze) do oczyszczenia tkanki nowotworowej z tkanki martwiczej i błoniastej tkanki łącznej gospodarza pokrywającej guz.
- Umieścić 15 ml roztworu enzymatycznego w sterylnej kolbie trypsynizującej z mieszadłem i zacząć powoli mieszać w kapturze.
- Na sterylnej szklanej szalce Petriego umyj pobrane guzy 3 - 5 razy sterylnym PBS, aby usunąć nadmiar krwi (można wlać lub użyć strzykawki, aby przepłukać je PBS). Delikatnie przechyl naczynie i odpipetuj lub odessaj materiał do mycia. Drobno zmielić za pomocą dwóch ostrzy skalpela #11 (patrz rysunek 2D).
- Dodaj 14 ml roztworu enzymatycznego do zmielonego guza i delikatnie pipetuj w górę iw dół 2-3 razy. Przenieść mieszaninę do kolby z odpowietrzoną trypsynizacją i powoli mieszać przez 20 minut. Przygotować 5 stożkowych probówek o pojemności 50 ml, dodając do każdej po 1,5 ml FBS w celu zneutralizowania trypsyny w kroku 1.2.11.
- Po 20 minutach zebrać 14 ml roztworu komórkowego z kolby trypsynizującej i dodać do jednej probówki z FBS. Dodać 14 ml świeżego roztworu enzymatycznego do kolby i kontynuować mieszanie.
- Odwirować zebrane komórki o masie 150 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Dodać 45 ml kompletnego NBM do granulatu, delikatnie wymieszać i powtórzyć wirowanie, aby wypłukać surowicę. Ponownie zawieś pelet w 5 ml pełnego NBM i przytrzymaj na lodzie.
- Powtórz etapy zbierania komórek, aby uzyskać w sumie 5 zbiorów, łącząc wszystkie zebrane komórki w jednej stożkowej probówce na lodzie.
- Umieść sitko o wielkości 40 μm na wierzchu stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przygotuj sitko do komórek, przepuszczając przez nie 10 ml DMEM/F12 + 7% FBS, a następnie przemywając 10 ml PBS.
- Powoli dodaj zawiesinę komórkową do sitka, pozwalając jej spłynąć (patrz rysunek 2M). Delikatnie podnieś wypustkę sitka komórkowego pomiędzy każdym nowym dodatkiem, aby przerwać podciśnienie i umożliwić swobodny przepływ zawieszonych komórek (patrz rysunek 2N).
- Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową jak powyżej. Ponownie zawiesić w 10 ml kompletny NBM i policzyć, aby określić całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą 0,04% błękitu trypanowego i hemocytometru. Trzymaj komórki na lodzie do momentu wytworzenia mikroguza.
2. Protokół Alternatywnej Dezagregacji Tkanek
- Zautomatyzowany system dysocjacji i dezagregacji tkanek.
- Umieścić probówkę dezagregacyjną w dysocjatorze komórkowym, wybrać program "Guz _02_02" i nacisnąć start i uruchomić przez 32 sek. Przenieść probówkę do rotatora, umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 40 min.
- Odwirować zawieszone komórki o sile 150 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Podczas wirowania komórek należy ustawić odczynniki do przetwarzania zawiesiny komórek. Dodać 10 ml NBM bez surowicy i delikatnie rozprowadzić zawiesinę.
- Po odwirowaniu otrzymać osad komórkowy zawierający ~ 10 - 30 x 106 żywotnych komórek (~ 0,3 ml). Ponownie zawiesić osad w 10 ml NBM bez surowicy (patrz rysunek 2O). Określ żywotne komórki za pomocą testu wykluczania (patrz krok 3.2.2).
3. Generacja mikronowotworów
- Przygotowanie odczynników
- Przygotować kompletny NBM, jak w ppkt 1.1.4 i przygotować zneutralizowany biożel ludzki o wysokiej gęstości (HuBiogel) (HDHG w dawce 3 mg/ml) zgodnie z protokołem wewnętrznym. Można również stosować podobne matryce biożelowe.
- Produkcja i hodowla mikronowotworów
- Otrzymać świeżo zdysocjowane komórki PDX w postaci zawiesiny pojedynczej komórki w pełnym NBM, na lodzie.
- Wymieszać zawiesinę komórek z równą objętością roztworu błękitu trypanowego (0,4% w PBS) i przeanalizować za pomocą hemacytometru w celu określenia liczby komórek i żywotności przez wykluczenie błękitu trypanowego18. Usuń objętość niezbędną do wytworzenia 50 000 komórek/mikroguz, gdzie objętość = (50 000 komórek/guz * # guzów)/(liczba żywych komórek / 1 ml) i umieść w świeżej stożkowej probówce.
- Zagęścić komórki przez odwirowanie w temperaturze 150 x g przez 8 minut, w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym roztworze HDHG w końcowym stosunku 1 część komórek w FBS i 4 części HDHG.
- Użyj elektronicznej pipety wielokanałowej, aby dozować 10 μl na mieszaninę komórek szpilkowych i HDHG na 96-pinową stalową płytkę (z powłoką hydrofobową) w celu wytworzenia mikroguzów (kulki o średnicy 2 mm, z których każdy zawiera 50 000 komórek).
- Umieść kulki nowotworowe 3D w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2, nawilżone) na 15 minut w celu zżelowania kulek.
- Po żelowaniu przenieś mikroguzy (10 μl) do niestandardowej komory hodowlanej zawiesiny (50 ml) lub naczynia hodowlanego o dużej objętości (10 cm) zawierającego kompletny NBM za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej i niestandardowego urządzenia szpilkowego.
- Po 1-2 dniach w inkubatorze do hodowli tkankowych przenieś mikroguzy na 96-dołkowe płytki hodowlane zawierające 50 μl NBM / studzienka za pomocą pipety dozującej z szeroką szyjką i wykonaj różne protokoły testowe i analityczne.
- Leczenie farmakologiczne i utrzymanie mikronowotworów
- Wybierz końcowe stężenia do testów narkotykowych.
UWAGA: Jeśli lek ma znaną skuteczność w hodowli 2D, wybierz 2x IC50 jako środkowe stężenie dawki i wybierz 3-krotne seryjne rozcieńczenia powyżej i poniżej, aby uzyskać łącznie 5 poziomów dawki. Na przykład, jeśli IC50 wynosi 9 μM dla leku w hodowli 2D, wybierz 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM i 162 μM jako końcowe stężenie do testowania leków. - Przygotować 2x roztwór dozujący lek w kompletnym NBM z zapasu dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć roztwór dozujący w 1% pożywce DMSO, aby przygotować 5 dawek, 3-krotne seryjne rozcieńczenie.
- Dodać 50 μl roztworu dozującego do studzienki mikroguza, zawierającej 50 μl na płytkach testowych, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO 0,5%. Powtórzyć dla każdej kontrpróby (np. 4) dla każdej dawki leku oznaczonej w ppkt 3.3.1.
- Utrzymuj kultury w 37 °C, 5% CO2, wilgotnym inkubatorze do kultur tkankowych przez 1 - 14 dni. Podawaj kultury bakterii dwa razy w tygodniu, odświeżając pożywkę i roztwór leku, jak powyżej.
- Wybierz końcowe stężenia do testów narkotykowych.
4. Analiza morfologiczna i fenotypowa mikronowotworów
- Określ morfologię komórek w mikroguzach za pomocą standardowego barwienia żywych komórek.
- Przygotuj 1 mM zapasu Calcein-AM w DMSO. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- W żądanych odstępach czasu (1, 7 i 14 dni) dodać roztwór Calcein-AM przygotowany w PBS (bez Ca/Mg) do płytki 96-dołkowej w celu uzyskania końcowego stężenia 1 μM.
- Inkubować 20 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 2X, 4X i 10X (wzbudzenie: 450 - 490 nm pasmo przepustowe, emisja: 515 nm długie przepustowe, dichroiczne 500 nm).
- Test wzrostu/proliferacji mikroguza
- Rozpuść proszek MTT w PBS (bez Ca/Mg), aby przygotować 12 mM bulionu. Sterylny filtr, podwielokrotność, przechowywać w temperaturze -20 °C.
- W żądanych odstępach czasu (1, 7 i 14 dni) dodaj 20 μl roztworu MTT do 96-dołkowej płytki na 100 μl objętości hodowli. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych.
- Przygotować świeży roztwór do lizy 10% SDS w 0,01 M HCl i dodać równą ilość do objętości kultury na płytki. Inkubować szczelnie zamknięte płytki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
- Odczyt absorbancji przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika wielopłytkowego.
- Przygotowanie mikronowotworów do analizy kinomicznej
- Przygotować bufor do lizy, wstępnie schładzając do temperatury 4 °C, a następnie dodając po 100 proporcji 100 inhibitorów fosfatazy białkowej (PPI) i 100 razy inhibitorów proteazy białkowej (PI). Dobrze wymieszaj i trzymaj na lodzie.
- Przenieś 2 mikroguzy do każdej z trzech probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Usunąć supernatant i dodać 40 μl buforu do lizy zawierającego PPI i PI do każdej probówki i poddać lizie przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Energicznie pipetuj próbki, aby rozbić koraliki guza. Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu analizy kinomicznej.
5. Kinomiczne profilowanie mikronowotworów
- Profilowanie białkowej kinazy tyrozynowej (PTK)
- Rozmrozić odczynniki (10x bufor kinazy białkowej (PK) i 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) do 4 °C Załadować bufor PK (300 μl 10x bufor PK w 2,7 ml dH2O) do strzykawki w pozycji # 2 na platformie profilującej.
- Otwórz oprogramowanie do oznaczania kinazy i załaduj plik protokołu PTK i naciśnij "START", dodając adnotacje do próbek w oprogramowaniu po zeskanowaniu chipów. Umieść chipy na platformie profilującej i załaduj 25 μl 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na matrycę, a następnie naciśnij LOAD, aby rozpocząć etap blokowania protokołu sterowany przez oprogramowanie.
- Rozcieńczyć 6 μM ze 100 mM zapasu ATP w 54 μldH 2O, aby otrzymać 10 mM trifosforanu adenozyny (ATP). Gdy oprogramowanie rozpocznie trzeci i ostatni etap mycia (widoczny na ekranie) przynieś 15 μg lizatu doprowadzonego do 28 μl z dH2O, wymieszaj i dodaj do tablicy.
- Przygotować mieszankę wzorcową PTK (MM) (dla maksymalnie 12 próbek). Dodać 32,6 μl dH2O do rozpuszczenia ditiotreitolu (DTT) i dodać 6 μl DTT i 60 μl 10x roztwór PK do probówki PTK-MM1 (zawiera już 60 μl 10x BSA).
- Poczekaj, aż pojawi się komunikat "Załaduj" w oprogramowaniu do oznaczania kinazy, a następnie dodaj 126 μl PTK-MM1, 60 μl dodatku PTK i 60 μl 10 mM ATP do MM2 (zawiera wcześniej podane 4,5 μl przeciwciała PY20 FITC) i wymieszaj. Dodać 16 μl tej głównej mieszanki PTK do każdej probówki lizatu próbki i odpipetować 5 razy.
- Upewnij się, że szkło nakrywkowe jest czyste, a następnie dodaj 35 μl lizatu/mieszanki głównej na matrycę, zamknij pokrywę karuzeli i naciśnij przycisk LOAD.
- Profilowanie kinazy serynowo-treoninowej (STK):
- Rozmrozić odczynniki (10x bufor PK, 10x bufor STK i 2% BSA) do 4 °C. Załadować bufor PK (300 μl w 2,7 ml dH20) do pozycji strzykawki # 1, 1:10, a bufor STK (300 μl w 2,7 ml dH20) do pozycji strzykawki # 2.
- Otwórz program komputerowy do oznaczania kinaz i załaduj plik protokołu STK i naciśnij START, dodając adnotacje do próbek w programie po zeskanowaniu chipów. Umieść chipy na platformie profilującej i załaduj 25 μl 2% BSA na tablicę, a następnie naciśnij LOAD, aby rozpocząć etap blokowania protokołu sterowany przez oprogramowanie.
- Rozcieńczyć 6 μM ze 100 mM ATP za pomocą 54 μldH 2O. Podczas końcowego (3-ciego) etapu płukania wymieszać 2 μg lizatu i doprowadzić do 32,6 μl z dH2O, wymieszać i dodać do tablicy.
- Przygotuj mieszankę wzorcową STK: Dodaj 70 μl 10x PK do probówki STK-MM1 (zawiera 7 μl 100x BSA), a następnie dodaj 42 μl dH2O do probówki STK-MM1.
- Poczekaj, aż w oprogramowaniu do oznaczania kinazy pojawi się komunikat "Załaduj", a następnie: Dodaj 18 μl 10 mM ATP do STK-MM1 i dodaj 9 μl MM1 do każdej próbki lizatu. Dobrze wymieszaj.
- Upewnij się, że szkło nakrywkowe jest czyste i dodaj 35 μl lizatu/mieszanki głównej na matrycę, zamknij pokrywę karuzeli i naciśnij LOAD.
- Podczas końcowego (3-ciego) etapu płukania dodaj 1,05 μl przeciwciała drugorzędowego STK-FITC do probówki DMAB (zawiera 3,03 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych STK), dodaj 39,6 μl buforu AB do DMAB, dodaj 356,0 μl dH2O do DMAB, dodaj 30 μl do DMAB do każdej tablicy i naciśnij LOAD.
- Analiza danych kinomicznych 19,20
- Otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj aplikację do analizy obrazu. Wybierz folder obrazów zawierający obrazy całej tablicy z kodami kreskowymi i znacznikami czasu dla danych PTK lub STK, wybierz plik układu tablicy dopasowany do numeru artykułu (86312 dla PTK i 87102 dla STK) i załaduj wcześniej wygenerowany plik adnotacji tablicy.
- Sprawdź poprawną siatkę wszystkich obrazów i uruchom aplikację do skalowania czasu ekspozycji. Statystycznie porównaj przekształcone wartości ekspozycji/nachylenia log2 i zweryfikuj za pomocą krzywych kinetycznych praniawstępnego 19-21.
- Uruchom oprogramowanie do przewidywania kinaz upstream, aby sprawdzić zmienione profile kinomiczne między warunkami dla kinaz upstream22,23.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykazaliśmy, że trójwymiarowy (3D) system hodowli w biżelu wspiera długoterminowy wzrost i funkcje wielu typów komórek. W tym wspólnym projekcie linie ksenotransplantacyjne GBM pochodzące od pacjentów (PDX) są wykorzystywane do wytwarzania setek mikroguzów. Rozdzielone komórki (3 x 105) lub neurosfery (40–50) osadzono w kuleczkach z biogelu (2 mm), a po szybkiej żelacji hodowano je w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze wypełnionym pożywką NB. Określono żywotność komórek (Ca...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne etapy w ramach protokołu dotyczą głównie generowania mikroguzów, a także dawkowania i utrzymywania leków. Ponieważ kulki mikronowotworowe są delikatne i łatwo się rozrywają, należy zachować szczególną ostrożność zarówno na etapie rozwoju testu, jak i jego utrzymania. Jeśli podczas któregokolwiek z tych procesów wystąpi błąd, interpretacja eksperymentalna może zostać zagrożona, powodując wydłużenie lub niepotrzebne powtarzanie eksperymentów, a nawet wykluczenie danych.
Modyfikacje i r...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
R.S. i R.S.S. są pracownikami Vivo Biosciences. J.C.A. jest częściowo finansowana przez UAB Kinome Core.
Podziękowania
Wspierane przez grant NIH R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), nagrodę Brain Tumor SPORE (PD: G.Y. Gillespie, P20CA 151129-03) i kontrakt SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagenaza-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsyna EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Suplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x końcowe stężenie |
| B-27 Suplement bez witaminy A | Life Technologies | 12587-010 | 1x stężenie końcowe |
| Rekombinowane ludzkie FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng / ml stężenie końcowe |
| Rekombinowany ludzki EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml stężenie końcowe |
| L-Glutamina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM stężenie końcowe |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2,5 µ g/ml stężenie końcowe |
| Penicylina Streptomycyna | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicylina G, 100 &mikro; g/ml Streptomycyna stężenie końcowe |
| Gentamycyna | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml stężenie końcowe |
| MTT | Life Technologies | M6494 | przygotowana do 5 mg/ml w PBS i sterylnie przefiltrowana, 1 mg/ml w studzience |
| SDS Fisher | BP166 | do buforu do lizy MTT, przygotowana do 10% w 0,01 M HCl, 5% w studzience | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | do buforu do lizy MTT, przygotowany do 0,01 M z SDS, 5 mM w studni |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM w kolbie DMSO, 2 &mikro; M w roztworze barwiącym PBS, 1 &mikro; M w studni |
| Halt' s Koktajl inhibitorów fosfatazy białkowej | Pierce ThermoScientific | 78420 | o przełożeniu 1:100 w MPER |
| Inhibitor proteazy białkowej Halta | Pierce ThermoScientific | 87786 | stosunek 1:100 w |
| odczynniku do ekstrakcji białek ssaków MPER (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce | ThermoScientific 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | do rozpuszczania kalceiny AM i związków |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | rozcieńczony do 1x ultraczystą wodą MiliQ i sterylnie przefiltrowany (do hodowli komórkowych) |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco z Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | rozcieńczona do 1x ultraczystą wodą MiliQ (do prania przed utrwaleniem) |
| 10% neutralna buforowana formalina | Protokół | 032-060 | |
| Trypan | Blue Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Hubiogel o wysokiej gęstości | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Inhibitor fosfatazy białkowej Halta | Pierce | 78420 | |
| Inhibitor proteazy białkowej | Halta Pierce | 87786 | |
| Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Układ do profilowania macierzy białkowej kinazy tyrozynowej (PTK) | PamGene | 86312 | |
| Bufor kinazy PTK | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x zapas buforowy PK w 2,7 ml dH2O, numer katalogowy zestawu odczynników |
| PTK ATP | PamGene | 36000 | numer katalogowy zestawu odczynników PTK |
| PY20- Przeciwciało sprzężone z FITC | PamGene | 36000 | do zestawu odczynników PTK |
| Dodatek PTK | PamGene | 32114 | |
| Rurka PTK-MM1 (10x BSA) | PamGene | 36000 | do zestawu |
| odczynników PTKUkład do profilowania macierzy kinazy serynowo-treoninowej (STK) | PamGene | 87102 | |
| Bufor kinazy STK | PamGene | 32205 | numer katalogowy zestawu odczynników |
| STK Mieszanka przeciwciał pierwotnych STK (probówka DMAB) | PamGene | 32205 | dla zestawu odczynników STK |
| Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z FITC | PamGene | 32203 | |
| Probówka STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | numer katalogowy zestawu odczynników STK |
| Bufor przeciwciał STK | PamGene | 32205 | numer katalogowy zestawu odczynników STK |
| Sprzęt | |||
| #11 Ostrza, sterylne | |||
| #3, sterylne | Fisher | 08-913-5 | |
| Szklane szalki Petriego 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Kleszcze półzakrzywione | Fisher | 12-460-318 | |
| Kolba trypsynizująca | Fisher | 10-042-12B | |
| Mieszadło magnetyczne | Fisher | 14-490-200 | |
| Mieszadło 3/4" | Fisher | 14-512-125 | |
| Sitko do komórek BD | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Probówka wirówkowa | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 oprogramowanie do analizy kinomicznej | PamGene | ||
| Evolve | PamGene | ||
| UpKin App (przewidywanie kinazy upstream) | Dysocjator PamGene | ||
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotacyjny system hodowli komórek (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | z 10 ml jednorazowym HARV |
Bibliografia
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
