Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów do modelowania nowotworów dostarczyło ważnych informacji na temat biologii nowotworów i reakcji na leki. Są one jednak czasochłonne, drogie i pracochłonne. Aby pokonać te przeszkody, wiele grup badawczych zwróciło się ku sferoidalnym kulturom komórek nowotworowych. Chociaż są użyteczne, sferoidy lub agregaty nowotworowe nie replikują interakcji komórka-macierz, jak stwierdzono in vivo. W związku z tym trójwymiarowe (3D) podejścia do hodowli wykorzystujące rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej zapewniają bardziej realistyczny system modelowy do badań. Począwszy od ksenoprzeszczepów podskórnych lub wewnątrzczaszkowych, tkanka nowotworowa jest dysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki, podobnej do neurosfer nowotworowych komórek macierzystych. Komórki te są następnie umieszczane w macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej od człowieka, biożelu 3D human, w celu wygenerowania dużej liczby mikroguzów. Co ciekawe, mikroguzy mogą być hodowane przez około miesiąc z wysoką żywotnością i mogą być wykorzystywane do testowania odpowiedzi na leki przy użyciu standardowych testów cytotoksyczności, takich jak bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT) i obrazowanie żywych komórek przy użyciu Calcein-AM. Co więcej, można je analizować za pomocą immunohistochemii lub zbierać w celu profilowania molekularnego, takiego jak wysokoprzepustowe profilowanie kinomiczne oparte na macierzyach, które również zostało tutaj szczegółowo opisane. Mikronowotwory 3D reprezentują zatem wszechstronny, wysokoprzepustowy system modelowy, który może dokładniej odwzorować biologię nowotworów in vivo niż tradycyjne podejścia.
Wprowadzenie
Najczęstszymi pierwotnymi złośliwymi nowotworami mózgu wewnątrzczaszkowymi są gwiaździaki III stopnia i glejak wielopostaciowy IV stopnia (glejak wielopostaciowy lub GBM). Guzy te oferują złe rokowania z medianą rocznego przeżycia wynoszącą od 12 do 15 miesięcy przy obecnych terapiach GBM w USA1-3. Terapie multimodalne obejmują chirurgię, radioterapię i chemioterapię, w tym temozolomid (TMZ) i leki ukierunkowane na kinazy. Sygnalizacja kinazy jest często rozregulowana w GBM, w tym podzbiory guzów z mutacjami amplifikacyjnymi lub aktywującymi w receptorze naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), wzrost sygnalizacji receptora płytkowego czynnika wzrostu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie oceny terapii ksenoprzeszczepami zostały przeprowadzone przy użyciu ortotopowego modelu guza glejaka na protokole zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Izolacja komórek ksenoprzeszczepu GBM pochodzących od pacjenta
- Przygotowanie odczynników
- Kolagenazę-I należy rozpuścić w sterylnej wodzie do stężenia 5 mg/ml i przefiltrować jałowo. Przechowywać w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C (końcowe stężenie wynosi 50 μg/ml w 100 ml roztworu enzymatycznego).
- Rozpuścić 100 μg naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) w 2 ml sterylnego r....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykazaliśmy, że trójwymiarowy (3D) system hodowli w biżelu wspiera długoterminowy wzrost i funkcje wielu typów komórek. W tym wspólnym projekcie linie ksenotransplantacyjne GBM pochodzące od pacjentów (PDX) są wykorzystywane do wytwarzania setek mikroguzów. Rozdzielone komórki (3 x 105) lub neurosfery (40–50) osadzono w kuleczkach z biogelu (2 mm), a po szybkiej żelacji hodowano je w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze wypełnionym pożywką NB. Określono żywotność komórek (Ca.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne etapy w ramach protokołu dotyczą głównie generowania mikroguzów, a także dawkowania i utrzymywania leków. Ponieważ kulki mikronowotworowe są delikatne i łatwo się rozrywają, należy zachować szczególną ostrożność zarówno na etapie rozwoju testu, jak i jego utrzymania. Jeśli podczas któregokolwiek z tych procesów wystąpi błąd, interpretacja eksperymentalna może zostać zagrożona, powodując wydłużenie lub niepotrzebne powtarzanie eksperymentów, a nawet wykluczenie danych.
Modyfikacje i r.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
R.S. i R.S.S. są pracownikami Vivo Biosciences. J.C.A. jest częściowo finansowana przez UAB Kinome Core.
Podziękowania
Wspierane przez grant NIH R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), nagrodę Brain Tumor SPORE (PD: G.Y. Gillespie, P20CA 151129-03) i kontrakt SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagenaza-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsyna EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Suplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x końcowe stężenie |
| B-27 Suplement bez witaminy A | Life Technologies | 12587-010 | 1x stężenie końcowe |
| Rekombinowane ludzkie FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng / ml stężenie końcowe |
| Rekombinowany ludzki EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml stężenie końcowe |
| L-Glutamina | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM stężenie końcowe |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2,5 µ g/ml stężenie końcowe |
| Penicylina Streptomycyna | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicylina G, 100 &mikro; g/ml Streptomycyna stężenie końcowe |
| Gentamycyna | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml stężenie końcowe |
| MTT | Life Technologies | M6494 | przygotowana do 5 mg/ml w PBS i sterylnie przefiltrowana, 1 mg/ml w studzience |
| SDS Fisher | BP166 | do buforu do lizy MTT, przygotowana do 10% w 0,01 M HCl, 5% w studzience | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | do buforu do lizy MTT, przygotowany do 0,01 M z SDS, 5 mM w studni |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM w kolbie DMSO, 2 &mikro; M w roztworze barwiącym PBS, 1 &mikro; M w studni |
| Halt' s Koktajl inhibitorów fosfatazy białkowej | Pierce ThermoScientific | 78420 | o przełożeniu 1:100 w MPER |
| Inhibitor proteazy białkowej Halta | Pierce ThermoScientific | 87786 | stosunek 1:100 w |
| odczynniku do ekstrakcji białek ssaków MPER (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce | ThermoScientific 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | do rozpuszczania kalceiny AM i związków |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | rozcieńczony do 1x ultraczystą wodą MiliQ i sterylnie przefiltrowany (do hodowli komórkowych) |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco z Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | rozcieńczona do 1x ultraczystą wodą MiliQ (do prania przed utrwaleniem) |
| 10% neutralna buforowana formalina | Protokół | 032-060 | |
| Trypan | Blue Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| Hubiogel o wysokiej gęstości | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Inhibitor fosfatazy białkowej Halta | Pierce | 78420 | |
| Inhibitor proteazy białkowej | Halta Pierce | 87786 | |
| Odczynnik do ekstrakcji białek ssaków (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Układ do profilowania macierzy białkowej kinazy tyrozynowej (PTK) | PamGene | 86312 | |
| Bufor kinazy PTK | PamGene | 36000 | 300 µ l 10x zapas buforowy PK w 2,7 ml dH2O, numer katalogowy zestawu odczynników |
| PTK ATP | PamGene | 36000 | numer katalogowy zestawu odczynników PTK |
| PY20- Przeciwciało sprzężone z FITC | PamGene | 36000 | do zestawu odczynników PTK |
| Dodatek PTK | PamGene | 32114 | |
| Rurka PTK-MM1 (10x BSA) | PamGene | 36000 | do zestawu |
| odczynników PTKUkład do profilowania macierzy kinazy serynowo-treoninowej (STK) | PamGene | 87102 | |
| Bufor kinazy STK | PamGene | 32205 | numer katalogowy zestawu odczynników |
| STK Mieszanka przeciwciał pierwotnych STK (probówka DMAB) | PamGene | 32205 | dla zestawu odczynników STK |
| Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z FITC | PamGene | 32203 | |
| Probówka STK-MM1 (100x BSA) | PamGene | 32205 | numer katalogowy zestawu odczynników STK |
| Bufor przeciwciał STK | PamGene | 32205 | numer katalogowy zestawu odczynników STK |
| Sprzęt | |||
| #11 Ostrza, sterylne | |||
| #3, sterylne | Fisher | 08-913-5 | |
| Szklane szalki Petriego 100 mm | Fisher | 08-748D | |
| Kleszcze półzakrzywione | Fisher | 12-460-318 | |
| Kolba trypsynizująca | Fisher | 10-042-12B | |
| Mieszadło magnetyczne | Fisher | 14-490-200 | |
| Mieszadło 3/4" | Fisher | 14-512-125 | |
| Sitko do komórek BD | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Probówka wirówkowa | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 oprogramowanie do analizy kinomicznej | PamGene | ||
| Evolve | PamGene | ||
| UpKin App (przewidywanie kinazy upstream) | Dysocjator PamGene | ||
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotacyjny system hodowli komórek (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | z 10 ml jednorazowym HARV |
Bibliografia
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
