Artykuł metodologiczny

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

DOI:

10.3791/54036

⸱

13 czerwca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Surgery, Tohoku University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania egzosomów w ciągu ostatnich trzech lat znacznie rozszerzyły zakres identyfikacji i charakterystyki biomarkerów oraz ich zastosowań terapeutycznych.

Ostatnio wykazano, że egzosomy zawierają mikroRNA (miR). MiR same w sobie stały się cennymi biomarkerami do celów diagnostycznych. Ponieważ pobieranie próbek w klinikach i szpitalach jest dość zmienne, izolacja miRNA z całej żółci różni się znacznie. Uzyskanie solidnych, dokładnych i powtarzalnych profili miRNA z pobranych próbek żółci w prosty sposób wymagało opracowania wysokiej jakości protokołu izolowania i charakteryzowania egzosomów z żółci. Metoda wymaga kilku wirowań i etapu filtracji z końcowym etapem ultrawirowania w celu osadzenia izolowanych egzosomów. Mikroskopia elektronowa, plamy zachodnie, cytometria przepływowa i wieloparametrowa analiza optyczna nanocząstek, jeśli są dostępne, są kluczowymi etapami charakterystyki w celu walidacji jakości egzosomów. W celu wyizolowania miRNA z tych egzosomów, wzbogacenie lizatu niespecyficznym, syntetycznym miRNA z gatunku takiego jak Caenorhabditis elegans, tj. Cel-miR-39, jest ważne dla normalizacji wydajności ekstrakcji RNA. Wyizolowanie egzosomu z płynu żółciowego zgodnie z tą metodą pozwala na pomyślne profilowanie miRNA z próbek żółci przechowywanych przez kilka lat w temperaturze -80 °C.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak inne płyny biologiczne, np. mleko matki, osocze lub mocz, żółć zawiera egzosomy, pęcherzyki bogate w lipidy1-4. Egzosomy mogą indukować lub zmieniać funkcje biologiczne w komórkach biorcy5, 6, formę komunikacji komórka-komórka, która może być częścią ich normalnej funkcji4, 7-9. Egzosomy mogą zawierać gatunki miRNA, które mogą stanowić cenne źródło biomarkerów do diagnozy10. Profile miRNA zyskały w ostatnich latach dużą uwagę jako markery diagnostyczne i prognostyczne dla różnych chorób11-14.

miRNA samo w sobie można znaleźć w płynach biologicznych, prawdopodobnie uwalniane przez martwe komórki, a na ilość utraconych komórek może mieć duży wpływ choroba podstawowa. Profil miRNA egzosomów niekoniecznie odzwierciedla profil miRNA komórkiźródłowej 6, 10, 15-17, ale egzosomy mogą przenosić sygnatury miRNA, które mogą być charakterystyczne dla komórki rodzicielskiej, takiej jak komórka nowotworowa. Egzosomy pochodzące z guza zostały zidentyfikowane w osoczu pacjentów z gruczolakorakiem płuc, rakiem prostaty i innymi nowotworami8, 16, 18.

Celem tej metody jest niezawodna i solidna izolacja egzosomów od próbek ludzkiej żółci, w dużej mierze niezależnie od ich wcześniejszych procedur obchodzenia się z nimi. Został opracowany w celu wykorzystania żółci jako wiarygodnego źródła miRNA do potencjalnej diagnozy chorób dróg żółciowych, takich jak rak dróg żółciowych19. Składa się z kilku etapów wirowania ze zwiększającymi się prędkościami w celu wyizolowania egzosomów i może mieć zastosowanie do innych płynów biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie żółci od pacjentów za pomocą endoskopowej cholangiopankreatografii wstecznej (ERCP) wymaga zatwierdzenia protokołu badania na ludziach przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Wszystkie przedstawione tu prace zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins University Institutional Review Board.

1. Izolacja egzosomu od żółci

  1. Wykonaj endoskopową cholangiopankreatografię wsteczną (ECPW). Ułóż pacjenta w pozycji leżącej na plecach i zaintubuj.
    1. Przełóż duodenoskop przez usta pacjenta i włóż go do drugiej części dwunastnicy i zidentyfikuj brodawkę główną.
    2. Selektywnie kaniuluj wspólny przewód żółciowy, wprowadzając zwieracz o potrójnym prześwicie wstępnie obciążony hydrofilowym prowadnikiem o średnicy 0,035 cala (0,9 mm).
    3. Przesuń prowadnik pod kierunkiem fluoroskopowym do lewego przewodu wątrobowego, ponieważ czasami może być trudno odróżnić przewód torbielowaty od prawego przewodu wątrobowego, a następnie przesunąć zwieracz o 5 cm do przewodu żółciowego, aby uzyskać stabilną pozycję.
    4. Usunąć prowadnik, podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml do portu prowadnika przez śluzę Luer i zassać żółć za pomocą 10 ml podciśnienia.
    5. Wyjąć strzykawkę zawierającą żółć, aby przystąpić do ECPW, ponownie wkładając prowadnik i wstrzykując środek kontrastowy przez port iniekcji w celu zmętnienia żółci
      6. .
    6. Pobraną żółć przenieść do 15 ml probówki na lodzie i trzymać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do rozpoczęcia etapu wirowania.
      Uwaga: Noś rękawice, aby chronić siebie i próbki! Traktuj żółć jako potencjalne źródło infekcji, ponieważ może zawierać cząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu A!
    7. Próbkę (próbki) należy przechowywać na lodzie. Przejść do kroku 1.2 lub odwirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie zamrozić w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
      Uwaga: Próbki przechowywane w ten sposób przez kilka lat były rutynowo wykorzystywane z dobrymi wynikami19.
  2. Przenieść 400 μl żółci do probówki do mikrowirówki i zebrać komórki i resztki komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Usunąć supernatant za pomocą pipetowania, przenieść do świeżej probówki do mikrowirówki i odwirować próbkę(-i) o masie 16 500 x g przez kolejne 20 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia supernatantu z dalszych zanieczyszczeń. Wyrzuć rurki do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Alternatywnie, zamiast tego należy odwirować próbki w ultrawirówce.
  4. Zebrać supernatant i przefiltrować go w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą strzykawki przez filtr membranowy z polieterosulfonu (PES) o grubości 0,2 μm, który ma dobre prędkości przepływu i niskie wiązanie z białkami, aby usunąć wszelkie pozostałe cząstki większe niż 200 nm.
  5. Odpipetować przefiltrowany supernatant do probówek ultrawirówek i dodać PBS tak, aby probówki były wypełnione w więcej niż 2/3. Jeśli probówki zawierają mniej płynu, probówki zapadną się podczas wirowania! Probówki można myć, sterylizować w autoklawie i używać ponownie.
  6. Osadzać egzosomy przez ultrawirowanie w temperaturze 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu spójrz na dno probówki ultrawirówki, aby czasami zobaczyć małe żółte granulki; To są egzosomy.
  7. Usunąć sklarowany osad przez ostrożne odlanie i zdezynfekować odpady, dodając wybielacz do końcowego stężenia 10% v/v i odstawić na 20 minut.
  8. W przypadku dalszych doświadczeń należy albo przetworzyć granulkę(i) w małej objętości odpowiedniego roztworu (tj. buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) do izolacji białka, buforu do lizy RNA do izolacji miR) lub ponownie zawiesić go w 50–150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), która może być przechowywana w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości (ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) lub ekstrakcja białek itp.) lub stosowany do charakterystyki preparatu egzosomu za pomocą TEM lub analizy optycznej nanocząstek.

2. Identyfikacja egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub CryoEM

  1. Zawiesić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w 100 μl PBS przez pipetowanie. Najlepiej używać egzosomów, które nie były przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C, zwłaszcza gdy wykonujesz izolację po raz pierwszy.
  2. Adsorbować 20 μl podwielokrotności (około 2 μg) do 400 siatek miedzianych Parlodion powlekanych węglem przez 2 minuty i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  3. Utrwalić egzosom w 1% (v/v) aldehydzie glutarowym (klasa EM) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie umieszczając krople na wysuszonym preparacie.
  4. Umyj kratki dwukrotnie wodą przez 5 minut, a następnie porównuj plamy EV z 1% kwasem fosfowolframowym (PTA) przez 30 sekund.
  5. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu elektronowego o napięciu przyspieszenia 80 kilowoltów, zaczynając od powiększenia 20 000x i zwiększając do 100 000X podczas określania wielkości cząstek.
    Uwaga: Możliwe są również inne przygotowania, takie jak nakładanie warstw na powlekane węglem siatki miedziane lub niklowe Formvar o siatce 200 oraz barwienie kontrastowe, takie jak 1% lub 2% octan uranylu przez 10-15 minut.
  6. W przypadku CryoEM należy zmieszać 20 μl podwielokrotności (około 2 μg) z 60 μl białka G gold 10 nm (stosunek 1:3). Pomoże to określić średnicę egzosomu.
  7. Przenieść próbki na rozżarzone, płaskie, dziurawe siatki węglowe typu C i usunąć nadmiar cieczy przez osuszenie. Zamroź kratki, zanurzając je natychmiast w ciekłym etanie.
  8. Zamontuj kratki w uchwycie kriogenicznym w ciekłym azocie.
  9. Rejestruj obrazy przy napięciu 200 kV z powiększeniami 20 000x i 100 000x.

3. Identyfikacja egzosomów za pomocą wieloparametrowej analizy optycznej nanocząstek

  1. Ponownie zawiesić wyizolowane egzosomy w 100 μl PBS przez pipetowanie.
  2. Rozcieńczyć egzosomy w 600 μl PBS w kilku różnych proporcjach (np. 1:50, 1:100, 1:300, 1:600 i 1:1,200).
  3. Wizualizacja egzosomów poprzez rozpraszanie światła laserowego za pomocą odpowiedniego instrumentu i oprogramowania w czasie rzeczywistym zgodnie z protokołem producenta20.
  4. Zwiększ poziom aparatu w trybie przechwytywania, aż cząsteczki staną się widoczne, a następnie dostosuj ostrość, aby cząsteczki wyglądały na gładkie.
  5. W trybie standardowym zmniejsz kamerę do najniższego poziomu, do którego cząstki są nadal widoczne, w razie potrzeby dostosuj migawkę aparatu i wzmocnienie, aby to osiągnąć.
  6. Sprawdź wzrokowo, czy na ekranie widocznych jest 20-100 cząstek, jeśli nie, przepłucz urządzenie i dostosuj rozcieńczenie w PBS.
  7. Następnie dostosuj czas przechwytywania do 30-60 sekund. Po przechwyceniu wideo dostosuj parametry przetwarzania, aż wszystkie cząstki zostaną zidentyfikowane na ekranie i przetwórz plik wideo.

4. Charakterystyka egzosomu za pomocą Western Blot

  1. Lizować granulki egzosomów z 2-5 ml żółci w 100 μl lodowatego buforu testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) z inhibitorem proteazy, dokładnie pipetując w górę iw dół, a następnie energicznie mieszać lizaty przez 30 sekund w wirze, aby skutecznie rozpuścić białka.
  2. Chociaż w większości przypadków nie jest to konieczne, należy zastosować pulsacyjne sonikowanie próbek na lodzie z 2 impulsami przez 10 sekund każdy, aby zapewnić pełną lizę.
  3. Materiał nierozpuszczalny w granulkach przez odwirowanie w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i przenieść supernatant do czystej probówki.
  4. Określić stężenie białka za pomocą wybranej metody (tj. kwas bicinchoninowy (BCA), Coomassie, zmodyfikowany test Lowry'ego, test białka 660 nm itp.) zgodnie z protokołem producenta. Metoda nie jest tak ważna, o ile ta sama metoda jest konsekwentnie stosowana w celu uzyskania wyników, które można porównać między eksperymentami.
  5. Załadować 50 μg białka na próbkę do buforu Laemmli po podgrzaniu próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut do studzienki z żelem poliakrylamidowym do elektroforezy (PAGE).
  6. Próbki na żelach PAGE należy poddać elektroforezie przez 1,5 godziny i przenieść oddzielone białka na nylonową membranę.
  7. Zablokować błonę (błony) 5% mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej buforowanej trisem z 0,1% Tween 20 (TBS-T) przez 1 godzinę, a następnie inkubować z przeciwciałami specyficznymi dla egzosomów, takimi jak anty-CD63 i anty-TSG-101 w rozcieńczeniu 1:500, najlepiej O/N w temperaturze 4 °C.
  8. Przemyć błony TBS-T 3 x 10 min, a następnie inkubować z odpowiednim, pasującym przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w 5% mleku beztłuszczowym w TBS-T przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Przemyć membranę (membrany) 3 x 5 minut TBS-T i wykryć określone białka za pomocą odczynników chemiluminescencyjnych zgodnie z protokołem producenta.
  10. Zobrazuj membrany za pomocą kliszy lub cyfrowego systemu obrazowania zgodnie z protokołem producenta.

5. Izolacja mikroRNA z izolowanych egzosomów

Uwaga: Izolacja miRNA z egzosomów żółciowych odbywa się za pomocą zmodyfikowanej izolacji miRNA opartej na komercyjnie dostępnym zestawie, ale każda inna metoda izolacji RNA może być użyta lub dostosowana.

  1. Dodać 300 μl buforu do lizy/budowania do osadu egzosomu (wyizolowanego z 400 μl żółci), odwirować, pipetować lub przepuścić przez igłę/strzykawkę, aby całkowicie zlizować egzosomy w celu uzyskania jednorodnego lizatu.
  2. Dodać 1/10 (30 μl) objętości dodatku homogenatu miRNA i dobrze wymieszać, kilkakrotnie wirując lub odwracając probówkę.
  3. Inkubuj mieszankę przez 10 minut na lodzie.
  4. Dodać objętość kwasowo-fenolowo-chloroform równą początkowemu homogenatowi (300 μl).
  5. Dodać 5 μl z 5 fmol/μl cel-miR 39 i wirować przez 30-60 sekund.
  6. Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej (górnej) i organicznej (dolnej).
  7. Ostrożnie odessać górną fazę przez pipetowanie i przenieść do świeżej probówki, zwracając uwagę na przenoszoną objętość. Wyrzuć fazę organiczną do odpowiedniego pojemnika na odpady organiczne.
  8. Aby wzbogacić małe RNA, dodaj 1/3 objętości 100% etanolu do odzyskanej fazy wodnej i wymieszaj, dokładnie wirując lub kilkakrotnie odwracając probówkę.
  9. Odpipetować mieszaninę lizatu i etanolu na wkład filtra, jednorazowo do 700 μl.
  10. Odwirować wkłady przez 15 sekund przy maksymalnej sile 10 000 x g lub zastosować podciśnienie, aby przepuścić mieszaninę przez filtr.
  11. Zebrać filtrat i jeśli mieszanina lizatu i etanolu przekracza 700 μl, przenieść przepływ do świeżej probówki i powtórzyć procedurę w celu zebrania wszystkich filtratów. Filtr ten zawiera frakcje RNA pozbawione małych RNA i może być używany do odzyskiwania tych większych RNA.
  12. Dodać 2/3 objętości RT 100% etanolu do całkowitego filtratu i dokładnie wymieszać przez wirowanie.
  13. Odpipetować mieszaninę filtratu/etanolu na drugi wkład filtracyjny. Tak jak poprzednio, maksymalna objętość, którą można nałożyć jednorazowo, to 700 μl.
  14. Wirować przez 15 sekund przy 10 000 x g lub zastosować próżnię zgodnie z opisem w kroku 5.10.
  15. Odrzucić przepływ i powtarzać tę czynność, aż cała mieszanina filtratu/etanolu zostanie przefiltrowana.
  16. Nałożyć 700 μl miRNA Wash Solution 1 na wkład filtra, odwirować przez 5-10 sekund lub zastosować próżnię i wyrzucić przepływ.
  17. Umyj filtr 500 μl roztworu myjącego 2/3, jak to opisano w kroku 5.16.
  18. Powtórzyć płukanie po raz drugi z 500 μl roztworu płuczącego 2/3, jak w kroku 5.16, wyrzucić przepływ i umieścić filtr z powrotem w probówce zbiorczej.
  19. Obracaj wkład filtra przez 1 minutę przy 10 000 x g, aby usunąć wszystkie resztki płynu z filtra.
  20. Przenieść wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej i nanieść 100 μl gorącej (95 °C) wody wolnej od nukleaz na środek filtra.
  21. Obracaj zespoły przez 20-30 sekund z maksymalną prędkością, aby odzyskać RNA.
  22. Zebrać eluat i zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby mogły być wykryte za pomocą zwykłej mikroskopii lub cytometrii przepływowej, należy przeprowadzić mikroskopię elektronową lub analizę optyczną nanocząstek. Analiza optyczna nanocząstek ma tę przewagę nad mikroskopią elektronową, że jest również ilościowa i zapewnia rozkład wielkości i koncentrację. Przyrząd wprowadza do próbki precyzyjnie skupioną wiązkę laserową przez szklany pryzmat. Ruch Browna izolowanych pęcherzyków jest rejestrowany przez kamerę E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby niezawodnie wykorzystać egzosomy wyizolowane z żółci, ważne jest stosowanie spójnych, wysokiej jakości metod izolacji, aby w zamian uzyskać próbki wysokiej jakości. Metodologia zdefiniowana w tym artykule jest dobrze znanym sposobem izolowania egzosomów i miRNA z ludzkiej żółci. Podkreśla kilka kluczowych etapów w charakterystyce izolowanych egzosomów, które powinny obejmować co najmniej mikroskopię elektronową lub analizę optyczną nanocząstek i plamy zachodnie.

Najważniejszym krokiem w iz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wsparte nagrodą K08 Award (DK090154-01) od National Institutes of Health (NIH; dla F.M.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m Filtr membranowy z polieterosulfonu (PES)Corning
 Redlica Beckman 331374
SW40Ti RotorRedlica
LM10-HS Oprogramowanie Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Nanosight
mirVANALife TechnologiesAM1560
Kompletny inhibitor proteazyRoche dystrybuowany przez Sigma-Aldrich4693116001
Immobilon PSQMillipore, Bedford MAISEQ00010
Przeciwciało anty-CD63Abcamab59479
Anty-TSG101Abcamab30871
Cienkościenne probówki ultrawirówkowe z polialomeru 431229Beckman

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  2. Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649(2013).
  3. Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856(2014).
  4. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  5. Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  6. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282(2011).
  7. Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
  8. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  9. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  10. Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
  11. Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
  12. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
  13. Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
  14. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  15. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
  16. Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  17. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  18. Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
  19. Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
  20. Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
  21. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja egzosom wprzetwarzanie pr bek ciprotok ultrawir wkiprofilowanie mikroRNAmikroskopia elektronowaanaliza Western blotcytometria przep ywowaledzenie nanocz steksyntetyczny spike miRNAbiomarker cholangiokarcinoma

Powiązane artykuły