Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania egzosomów w ciągu ostatnich trzech lat znacznie rozszerzyły zakres identyfikacji i charakterystyki biomarkerów oraz ich zastosowań terapeutycznych.
Ostatnio wykazano, że egzosomy zawierają mikroRNA (miR). MiR same w sobie stały się cennymi biomarkerami do celów diagnostycznych. Ponieważ pobieranie próbek w klinikach i szpitalach jest dość zmienne, izolacja miRNA z całej żółci różni się znacznie. Uzyskanie solidnych, dokładnych i powtarzalnych profili miRNA z pobranych próbek żółci w prosty sposób wymagało opracowania wysokiej jakości protokołu izolowania i charakteryzowania egzosomów z żółci. Metoda wymaga kilku wirowań i etapu filtracji z końcowym etapem ultrawirowania w celu osadzenia izolowanych egzosomów. Mikroskopia elektronowa, plamy zachodnie, cytometria przepływowa i wieloparametrowa analiza optyczna nanocząstek, jeśli są dostępne, są kluczowymi etapami charakterystyki w celu walidacji jakości egzosomów. W celu wyizolowania miRNA z tych egzosomów, wzbogacenie lizatu niespecyficznym, syntetycznym miRNA z gatunku takiego jak Caenorhabditis elegans, tj. Cel-miR-39, jest ważne dla normalizacji wydajności ekstrakcji RNA. Wyizolowanie egzosomu z płynu żółciowego zgodnie z tą metodą pozwala na pomyślne profilowanie miRNA z próbek żółci przechowywanych przez kilka lat w temperaturze -80 °C.
Wprowadzenie
Podobnie jak inne płyny biologiczne, np. mleko matki, osocze lub mocz, żółć zawiera egzosomy, pęcherzyki bogate w lipidy1-4. Egzosomy mogą indukować lub zmieniać funkcje biologiczne w komórkach biorcy5, 6, formę komunikacji komórka-komórka, która może być częścią ich normalnej funkcji4, 7-9. Egzosomy mogą zawierać gatunki miRNA, które mogą stanowić cenne źródło biomarkerów do diagnozy10. Profile miRNA zyskały w ostatnich latach dużą uwagę jako markery diagnostyczne i prognostyczne dla różnych chorób11-14.
miRNA samo w sobie można znaleźć w płynach biologicznych, prawdopodobnie ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobieranie żółci od pacjentów za pomocą endoskopowej cholangiopankreatografii wstecznej (ERCP) wymaga zatwierdzenia protokołu badania na ludziach przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Wszystkie przedstawione tu prace zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins University Institutional Review Board.
1. Izolacja egzosomu od żółci
- Wykonaj endoskopową cholangiopankreatografię wsteczną (ECPW). Ułóż pacjenta w pozycji leżącej na plecach i zaintubuj.
- Przełóż duodenoskop przez usta pacjenta i włóż go do drugiej części dwunastnicy i zidentyfikuj brodawkę główną.
- Selektywnie kaniuluj wspólny przewód żółciowy, wprowa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą zwykłej mikroskopii lub cytometrii przepływowej, konieczne jest zastosowanie mikroskopii elektronowej lub optycznej analizy nanocząsteczek. Analiza optyczna nanocząsteczek ma tę przewagę nad mikroskopią elektronową, że jest również ilościowa i pozwala wyznaczyć rozkład wielkości oraz stężenie. Urządzenie wprowadza precyzyjnie skupioną wiązkę lasera przez pryzmat szklany do próbki. Ruchy Browna wyizolowanych pęcherzyków są .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby niezawodnie wykorzystać egzosomy wyizolowane z żółci, ważne jest stosowanie spójnych, wysokiej jakości metod izolacji, aby w zamian uzyskać próbki wysokiej jakości. Metodologia zdefiniowana w tym artykule jest dobrze znanym sposobem izolowania egzosomów i miRNA z ludzkiej żółci. Podkreśla kilka kluczowych etapów w charakterystyce izolowanych egzosomów, które powinny obejmować co najmniej mikroskopię elektronową lub analizę optyczną nanocząstek i plamy zachodnie.
Najważniejszym krokiem w iz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żaden z autorów nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte nagrodą K08 Award (DK090154-01) od National Institutes of Health (NIH; dla F.M.S.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,2 &mikro; m Filtr membranowy z polieterosulfonu (PES) | Corning | ||
| Redlica Beckman 331374 | |||
| SW40Ti Rotor | Redlica | ||
| LM10-HS | Oprogramowanie Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| Kompletny inhibitor proteazy | Roche dystrybuowany przez Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Przeciwciało anty-CD63 | Abcam | ab59479 | |
| Anty-TSG101 | Abcam | ab30871 |
Bibliografia
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
