Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Podsumowanie

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów. Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Streszczenie

Około 90% zgonów z powodu raka u ludzi jest związanych z przerzutami. Pomimo rozpowszechnienia i względnej szkodliwości przerzutów brakuje środków terapeutycznych do leczenia lub profilaktyki. Przedstawiamy metodę tworzenia przerzutów do płuc u myszy, przydatną do badania tego zjawiska. Iniekcja do żyły ogonowej myszy B57BL/6J z B16-BL6 jest jednym z najczęściej stosowanych modeli przerzutów czerniaka. Niektóre z krążących komórek nowotworowych osadzają się w płucach myszy, tworząc "eksperymentalne" ogniska przerzutowe. Dzięki temu modelowi możliwe jest zmierzenie względnego wpływu środków terapeutycznych na rozwój przerzutów nowotworowych. Różnica w liczbie ognisk płucnych między leczonymi i nieleczonymi myszami wskazuje na skuteczność neutralizacji przerzutów. Jednak przed badaniem środka terapeutycznego konieczne jest określenie optymalnej liczby wstrzykniętych komórek B16-BL6 do analizy ilościowej ognisk przerzutowych. Wstrzyknięcie zbyt wielu komórek może spowodować nadmiar ognisk przerzutowych, upośledzając prawidłową kwantyfikację i przytłaczając efekty terapii przeciwnowotworowych, podczas gdy wstrzyknięcie zbyt małej liczby komórek utrudni porównanie między leczonymi a kontrolnymi.

Wprowadzenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów wśród pacjentów z nowotworami złośliwymi. Proces przerzutowego rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych jest słabo poznany, ale wydaje się, że obejmuje kilka etapów, w tym inwazję sąsiednich tkanek, wewnątrznaczynienie do układu limfatycznego i naczyniowego, przeżycie i translokację w układzie krążenia, wynaczynienie z układu naczyniowego w miejscu przerzutów, adaptację do nowego mikrośrodowiska w nowym miejscu i kolonizację w nowym miejscu przez proliferację i tworzenie guzów wtórnych. ¹ Każde z tych zdarzeń biologicznych wiąże się z transformacją, rozprzestrzenianiem się i przeżywalnością przerzutowych komórek nowotworowych. Na przykład przekształcenie fenotypu nabłonkowego komórki nowotworowej w fenotyp mezenchymalny w połączeniu z udaną interakcją z macierzą zewnątrzkomórkową umożliwia im inwazję sąsiednich tkanek i przerzuty do innych części ciała. ^2,3 Ponadto te komórki przerzutowe muszą przetrwać w krążącym krwiobiegu i uniknąć nadzoru immunologicznego ze strony gospodarza. ^4,5 Wreszcie, po wszczepieniu w odległe miejsce w ciele, komórki nowotworowe muszą przystosować się do swojego mikrośrodowiska, aby się namnażać i tworzyć guzy wtórne. ^6,7 Dlatego, chociaż przerzuty są powszechnym zjawiskiem wśród pacjentów z rakiem, przerzutowe komórki nowotworowe mają wiele obszarów podatnych na interwencję terapeutyczną.

Biorąc pod uwagę immunogenny charakter czerniaka i niedawne zainteresowanie immunoterapiami, modele czerniaka są coraz bardziej użyteczne. ⁸ Szacuje się, że w samych Stanach Zjednoczonych czerniak jest przyczyną 9 000 zgonów rocznie. ⁹ Częstymi lokalizacjami przerzutów czerniaka są kości, mózg, wątroba i płuca. Większość przerzutów do odległych miejsc występuje przez krwioobieg. Krążące we krwi komórki nowotworowe muszą uniknąć klirensu immunologicznego, dotrzeć do łożyska naczyń włosowatych dystalnego narządu i zaatakować przez komórki śródbłonka naczynia krwionośnego, aby skutecznie się zadomowić. ^{4-7,10, 11}

Aby naśladować powszechne i zjadliwe zjawiska przerzutów, stworzono mysią linię komórkową B16-BL6. B16-BL6, spadkobierca rodzicielskiej linii komórkowej czerniaka C57BL/6 B16-F0, jest produktem końcowym 10 kolejnych selekcji przerzutów do płuc z wstrzyknięcia dożylnego (w wyniku B16-F10), po których następuje 6 kolejnych selekcji do penetracji błony pęcherza moczowego. ¹² W związku z tym jest to niezawodna linia komórkowa czerniaka do tworzenia ognisk przerzutów u myszy, zwłaszcza po wstrzyknięciu dożylnym. ¹³

Po wstrzyknięciu wystarczającej ilości komórek B16-BL6 do żyły ogonowej myszy B57BL/6, a następnie dwóch lub więcej tygodni, aby umożliwić implantację i wzrost komórek B16/BL6, w płucach utworzą się ogniska przerzutowe. Po eutanazji i oględzinach za pomocą mikroskopii preparacyjnej można określić ilościowo liczbę obecnych ognisk. To z kolei można wykorzystać do ustalenia efektu dawka-przerzuty, ponieważ liczba wstrzykniętych komórek B16-BL6 koreluje z liczbą ognisk powstałych na powierzchni płuc. Model ten jest znany jako "przerzuty eksperymentalne", w których znane komórki przerzutowe są wprowadzane bezpośrednio do krwiobiegu, ułatwiając szybkie i przewidywalne rozprzestrzenianie się i osadzanie w płucach, wątrobie lub innym badanym narządzie. Jest to przeciwieństwo "spontanicznych przerzutów", w których komórki nowotworowe są wszczepiane, często podskórnie, a przerzuty pochodzą z organicznie zrzuconych komórek rakowych. ^14,15

Ważne jest, aby wstrzyknąć odpowiednią ilość komórek B16/BL6 do żył ogonowych myszy. Zbyt wiele, a płuca zostaną pokryte przerzutami, a sąsiednie ogniska będą nie do odróżnienia od siebie. Zbyt mało, a wpływ środka terapeutycznego będzie niezauważalny ze względu na nieodłączne różnice między wstrzyknięciami. W celu uzyskania optymalnej liczby ognisk w płucach myszy C57BL/6 konieczne jest skorelowanie liczby wstrzykniętych komórek z ilością ustalonych ognisk przerzutowych na powierzchni płuc, biorąc pod uwagę rozróżnialność poszczególnych ognisk. Protokół ten zademonstruje model przerzutowego mysiego czerniaka dla myszy C57BL / 6.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wykorzystanie myszy w badaniach naukowych jest dopuszczalne tylko w przypadkach, gdy może to przyczynić się do lepszego zrozumienia podstaw biologii lub w kierunku ostatecznego leczenia choroby.

1. Zamawianie

1. Kup samice myszy C57BL/6 (w wieku 6 - 8 tygodni), 5 myszy na grupę. Odczekaj kilka dni, aż myszy się przystosują.

2. Przygotowanie komórek B16-BL6

1. Wyjmij płytki do hodowli komórkowych z inkubatora pod kątem 37 stopni i umieść w sterylnym kapturze. Płytki powinny być w około 70% zlewane z komórkami czerniaka myszy B16-BL6. Większa konfluencja może zmienić potencjał przerzutowy komórek.
2. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA na płytkę, odstaw na 1 minutę, a następnie odessaj roztwór pożywki trypsynowej.
3. Dodać 1 ml trypsyny na płytkę i włożyć płytki z powrotem do inkubatora na 10 minut.
4. Po przeniesieniu płytek z inkubatora do sterylnego kaptura, dodaj 4 ml pożywki Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) bez surowicy do każdej płytki.
5. Zbierz komórki za pomocą sterylnej, zmotoryzowanej pipety. Wysuń komórki na spód płytki, z końcówką dociśniętą pod bardzo niewielkim kątem, aby rozbić komórki. Powtórz kilka razy, aby zapewnić odpowiednie oddzielenie grudek komórek, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać igłę wyrzutową. Zebrać i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
6. Użyj hemocytometru, aby określić gęstość komórek. Utrzymując stałą całkowitą liczbę komórek B16-BL6, określ objętość RPMI bez surowicy potrzebną do osiągnięcia końcowych stężeń 0, 0,065, 0,015, 0,25 i 0,5 miliona komórek/ml.
7. Równomiernie podzielić pożywkę w probówce o pojemności 50 ml na probówki stożkowe o pojemności 15 ml. Odwirować stożkowe probówki o masie 2 250 x g przez 5 minut. Zdekantować media. Dodaj odpowiednią objętość RPMI bez surowicy i potwierdź pożądaną gęstość komórek za pomocą hemacytometru. Dostosuj gęstości - dodając dodatkowe RPMI lub obracając i ponownie zawieszając w mniejszej objętości - odpowiednio.
8. Porcję 500 μl każdej zawiesiny komórkowej rozlać do oznakowanych probówek o pojemności 1,8 ml na lodzie.

3. Iniekcja żyły ogonowej

1. Weź mysz trzymaną za ogon i poprowadź ją tyłem do przodu do ogranicznika myszy. Trzymając tułów w głównej komorze respektu, z ogonem na zewnątrz, pociągnij mysz w kierunku końca ogranicznika. Włóż tłok ograniczający, kontynuując naciskanie, aż mysz zostanie zabezpieczona.
2. Obróć mysz o 90 stopni tak, aby jedna z bocznych żył ogonowych była skierowana do góry. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem energicznie wyczyść bok ogona myszy, szczególnie w miejscu, gdzie żyła ogonowa jest najbardziej widoczna.
   Uwaga: Dobre oświetlenie jest niezbędne do efektywnej wizualizacji żył ogonowych na myszach B57BL/6J. Lampy grzewcze lub podgrzewane podkładki chirurgiczne, choć nie są konieczne, pomogą również zwiększyć objętość żyły ogonowej.
3. W sterylnym kapturze hodowlanym zebrać 300 μl pożywki do hodowli komórkowych z probówki o pojemności 2 milionów komórek/ml. Odwrócić igłę, przesuwając bok i naciskając tłok, aby usunąć pęcherzyki ze strzykawki. Wysunąć kulturę-RPMI, aby uzyskać końcową objętość 250 μl.
4. Wyprostuj ogon myszy ręką niedominującą. Trzymaj ogon z bliższym końcem ogona uniesionym palcem wskazującym ręki niedominującej, a dystalną częścią ogona wciśniętą kciukiem.
   Uwaga: W ten sposób żyła ogonowa jest utrzymywana w pozycji bocznej, równolegle do powierzchni ograniczającej, z możliwością przystającego wejścia w bardziej dystalną część ogona.
5. Wprowadzić igłę do żyły ogonowej, w kierunku dystalnego końca, pod minimalnym kątem w dół, a następnie wyregulować igłę tak, aby dopasować ją do kąta żyły ogonowej po dalszym wprowadzaniu (obniżając koniec tłoka strzykawki względem igły).
6. Wbić igłę na około 1 cm do żyły ogonowej. Po włożeniu należy rozpocząć wciskanie tłoka, trzymając igłę stabilnie.
   Uwaga: Jeśli igła znajduje się w żyle ogonowej, a koniec igły nie jest zatkany, pożywka powinna bez przeszkód przepływać do żyły. Skuteczne wstrzyknięcie charakteryzuje się usuwaniem krwi z żyły. Jeśli występuje opór lub w miejscu wstrzyknięcia zaczyna tworzyć się pęcherzyk, należy usunąć igłę i spróbować ponownie w miejscu bliższym wzdłuż żyły ogonowej.
7. Wyjąć igłę z żyły i wyrzucić ją. Przyłóż gazę do miejsca wprowadzenia, aby zatamować krwawienie.
8. Wyjąć tłok z ogranicznika i umieścić mysz w klatce odbiorcy.
9. Powtórz dla wszystkich pozostałych stężeń.
   Uwaga: Tworzenie ognisk płucnych trwa około 2 - 3 tygodni, przy czym zmienność zależy od linii komórkowej i pożądanej wielkości ognisk. ⁹ W międzyczasie myszy powinny być monitorowane pod kątem objawów, które mogłyby uzasadniać wczesną eutanazję, takich jak nadmierne dyszenie.

4. Liczenie ognisk płucnych

1. Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze CO₂ i wystawiając na działanie 100% CO₂ wprowadzanego w tempie 10-30% objętości komory na minutę przez 5 minut. Następnie nastąpi zwichnięcie szyjki macicy.
2. Rozłóż mysz na styropianie. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj chirurgiczne nacięcie wzdłuż mostka.
3. Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia, zarówno od góry nacięcia mostka, jak i rozgałęziając się w kierunku ramion myszy, odsłaniając klatkę piersiową.
4. Wykonaj dwa cięcia, każde wzdłuż bocznych boków mostka, aby usunąć klatkę piersiową z tułowia, odsłaniając płuca i serce.
5. Trzymając serce pęsetą chirurgiczną, przetnij przełyk i tchawicę, uwalniając serce i płuca od myszy. Umieść pod mikroskopem preparacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu, aby uzyskać lepszą wizualizację.
6. Wypreparuj serce z płuc i usuń grasicę, pozostawiając tylko dwa płuca.
7. Mając płuca pod lunetą sekcyjną, zacznij liczyć ogniska płuc. Każde ognisko powinno pojawić się jako okrągły, brązowy wytrutek na powierzchni płuc.
   1. Aby uzyskać spójność między myszami, policz liczbę ognisk na powierzchni płata, a następnie odwróć ten płat. Wykonanie każdego z czterech płatów osobno pozwala na łatwiejsze liczenie.
8. Zachowaj i napraw płuca podczas wykonywania IHC, w przeciwnym razie wyrzuć resztki.

Wyniki

Podczas inspekcji wizualnej widoczna jest zmienność ognisk powierzchniowych. Przeliczenie liczby guzów pod mikroskopem stereoskopowym powinno wykazać liniową zależność między liczbą wstrzykniętych komórek nowotworowych a liczbą powstałych, możliwych do policzenia ognisk. Celem jest zastosowanie optymalnej liczby wstrzykiwanych komórek, tak aby płuca nie były całkowicie pokryte, jak ma to miejsce przy 500,000 cells/ml na Rysunku 1A, ani zbyt słabo pokryte, jak w przypadku 62,500 cells/ml i 125,000 cells/ml. Można to również określić ilościowo za pomocą korelacji liniowej (Rysunek 1B).

Rycina 1. Ogniska w płucach powstałe w wyniku wstrzyknięcia komórek B16/BL6 do żyły ogonowej. (A) Ogniska w płucach można zaobserwować na powierzchni płuc myszy C57BL/6 jako brązowe, okrągłe masy (reprezentatywne ogniska wskazane strzałkami). Wraz ze wzrostem gęstości wstrzykniętej hodowli komórkowej (nad każdym obrazem) wzrasta odpowiadająca jej liczba powstałych ognisk w płucach (pod każdym obrazem). Płuca myszy, której wstrzyknięto najwyższą gęstość komórek, wykazują największy wizualny stopień zajęcia przez ogniska. Paski skali oznaczają 20 mm. (B) Wyliczenie liczby ognisk w płucach w zależności od gęstości hodowli komórkowej. Powyżej 125,000 cells/ml występuje relacja w przybliżeniu liniowa, określona za pomocą hemacytometru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Krążące komórki nowotworowe z wstrzyknięcia żyły ogonowej reprezentują przerzuty, które unikają miejsc pierwotnego wzrostu i migrują drogami, takimi jak krwiobieg lub układ limfatyczny, czasami osiedlając się w łożyskach naczyń włosowatych w odległych miejscach. ¹⁴ Opisany powyżej protokół służy jako model dla przerzutów wtórnych. Przy optymalnej liczbie wstrzykniętych komórek B16-BL6 eksperymentatorzy mogą określić względny wpływ podanego leku lub populacji komórek odpornościowych, po neutralizacji, na przerzuty komórek rakowych.

Ten protokół ma ograniczenia. Krążące komórki nowotworowe zostały wyselekcjonowane ze względu na ich zdolność do przerzutów i dlatego są nieimmunogenne, mają niższy poziom cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy 1. ¹² Co więcej, nagłe i skupione w sobie wprowadzenie dużej liczby przerzutów różni się od typowego scenariusza u pacjentów, u których niewielka liczba przerzutowych komórek nowotworowych rozprasza się w dłuższym okresie czasu z pierwotnego miejsca guza. Dodatkowo, wprowadzone dożylnie komórki nowotworowe pochodzą z hodowli tkankowej, a nie z pierwotnego nowotworu. Dlatego komórki te różnią się od przerzutów wtórnych, które wynikają ze zmian w adhezji komórek, migracji, rozpoznawaniu immunologicznym i tworzeniu narządu biorcy. ^15,16

Alternatywnym protokołem byłoby podskórne wstrzyknięcie witaminy B16/BL6 w celu wytworzenia guzów pierwotnych i analiza powstałych "spontanicznych" przerzutów do płuc. Stwierdzono, że te "spontaniczne" przerzuty zawierają więcej heterogeniczności niż ich "eksperymentalne" odpowiedniki, bardziej odpowiadając przerzutom u ludzi. Protokół jest ograniczony pod względem możliwości określenia wpływu eksperymentalnego związku na przerzuty. W przypadku wstrzyknięcia bocznej żyły ogonowej liczbę komórek czerniaka wstrzykniętych do krwiobiegu można przybliżyć za pomocą hemocytometru. Jednak w przypadku "spontanicznych" przerzutów występuje większa niejednorodność między nowotworami, co dodaje dodatkową zmienną do liczby powstałych ognisk płucnych. ¹⁶

Podsumowując, model mysiego czerniaka żyły ogonowej B16-BL6 stanowi prosty model do określania wpływu leczenia lub immunoterapii na przerzuty. Poprzez dożylne wstrzykiwanie krążących komórek nowotworowych naukowcy mogą do pewnego stopnia replikować pacjentów po przerzutach. Biorąc pod uwagę destrukcyjne działanie przerzutowych komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem, model ten jest potężnym narzędziem do zrozumienia wieloetapowego procesu przerzutów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trypsin	Corning	MT25052CV
RPMI 1640 Medium	Corning	MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer	Hausser	02-671-54
Strzykawki insulinowe Micro-Fine IV	BD	14-829-1D
Sterylne podkładki do przygotowywania alkoholu	Fisherbrand	22-363-750
Ogranicznik	myszyBraintree Scientific	NC9999969	Wybór ogranicznika zależy od wieku/wielkości myszy
Podkładka grzewcza	Harry Schein	NC0012697	Opcjonalnie