Artykuł metodologiczny

Jednoetapowe oczyszczanie metodą chromatografii ujemnej białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori z nadekspresją w Escherichia coli w trybie wsadowym

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54043

⸱

18 czerwca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę wysokiej wydajności jednoetapowego negatywnego oczyszczania rekombinowanego białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP) z nadekspresją w Escherichia coli przy użyciu żywic dietyloaminoetylowych w trybie wsadowym. HP-NAP oczyszczony tą metodą jest korzystny dla opracowywania szczepionek, leków lub diagnostyki chorób związanych z H. pylori.

Streszczenie

Białko aktywujące neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP) jest głównym czynnikiem wirulencji Helicobacter pylori (H. pylori). Odgrywa kluczową rolę w zapaleniu żołądka wywołanym przez H. pylori poprzez aktywację kilku wrodzonych leukocytów, w tym neutrofili, monocytów i komórek tucznych. Właściwości immunogenne i immunomodulujące HP-NAP sprawiają, że jest on potencjalnym kandydatem na szczepionkę i diagnostykę H. pylori oraz nowym kandydatem na lek do terapii przeciwnowotworowej. W celu uzyskania znacznych ilości oczyszczonego HP-NAP wykorzystywanego do zastosowań klinicznych, należy opracować skuteczną metodę oczyszczania tego białka z wysoką wydajnością i czystością.

W tym protokole opisaliśmy metodę jednoetapowego oczyszczania metodą chromatografii ujemnej rekombinowanego HP-NAP nadekspresji w Escherichia coli (E. coli) za pomocą żywic jonowymiennych dietyloaminoetylowych (DEAE) (np. Sephadex) w trybie wsadowym. Rekombinowany HP-NAP stanowi prawie 70% całkowitego białka E. coli i jest prawie w pełni odzyskiwany we frakcji rozpuszczalnej po lizie komórek przy pH 9,0. W optymalnych warunkach, przy pH 8,0, większość HP-NAP jest odzyskiwana we frakcji niezwiązanej, podczas gdy endogenne białka z E. coli są skutecznie usuwane przez żywicę.

Ta metoda oczyszczania przy użyciu chromatografii wsadowej w trybie ujemnym z żywicami jonowymiennymi DEAE daje funkcjonalny HP-NAP z E. coli w jego natywnej formie o wysokiej wydajności i czystości. Oczyszczony HP-NAP może być dalej wykorzystywany w profilaktyce, leczeniu i prognozowaniu chorób związanych z H. pylori, a także w terapii raka.

Wprowadzenie

Helicobacter pylori (H. pylori) jest główną przyczyną zapalenia żołądka i choroby wrzodowej. Bakteria ta została również sklasyfikowana jako czynnik rakotwórczy u ludzi przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem, część Światowej Organizacji Zdrowia, w 1994 roku. Szacuje się, że częstość występowania zakażenia H. pylori wynosi 70% w krajach rozwijających się i 30-40% w krajach uprzemysłowionych1. Mimo że wskaźnik infekcji H. pylori spada w krajach uprzemysłowionych, wskaźnik infekcji H. pylori w krajach rozwijających się jest nadal wysoki2. Standardowe leczenie mające na celu wyeliminowanie zakażenia H. pylori polega na podawaniu inhibitora pompy protonowej, IPP i dwóch antybiotyków, klarytromycyny z amoksycyliną lub metronidazolem3. Jednak wzrost oporności na antybiotyki w terapii wrzodów związanych z H. pylori wymaga opracowania nowych strategii zapobiegania lub leczenia infekcji. Opracowanie szczepień zapobiegawczych i/lub terapeutycznych przeciwko H. pylori może zapewnić alternatywne podejście do kontroli zakażenia H. pylori.

Białko aktywujące neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP), główny czynnik wirulencji H. pylori, zostało po raz pierwszy zidentyfikowane w ekstraktach wodnych H. pylori ze zdolnością do aktywacji neutrofili w celu przylegania do komórek śródbłonka i wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS)4. Naciek neutrofili błony śluzowej żołądka stwierdzony u pacjentów zakażonych H. pylori z czynnym zapaleniem błony śluzowej żołądka może prowadzić do stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek żołądka. Tak więc HP-NAP może odgrywać patologiczną rolę poprzez aktywację neutrofili w celu wywołania zapalenia żołądka, co z kolei powoduje choroby wrzodowe lub choroby żołądka związane z H. pylori. Niemniej jednak HP-NAP jest potencjalnym kandydatem do zastosowań klinicznych5,6. Ze względu na właściwości immunogenne i immunomodulacyjne HP-NAP, białko to może być wykorzystywane do opracowywania szczepionek, środków terapeutycznych i narzędzi diagnostycznych. Przeprowadzono badanie kliniczne dotyczące stosowania rekombinowanego HP-NAP jako jednego ze składników szczepionki białkowej przeciwko H. pylori. Szczepionka ta składa się z rekombinowanego HP-NAP, genu A związanego z cytotoksyną (CagA) i wakuolizujących białek cytotoksyny A (VacA) sformułowanych z wodorotlenku glinu i wykazano, że jest bezpieczna i immunogenna u ludzi7. Ponadto HP-NAP działa jako silny immunomodulator, który wyzwala odpowiedzi immunologiczne spolaryzowane przez T pomocnika typu 1 (Th1) w terapii przeciwnowotworowej8 i obniża regulację odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Th2 wywołanej reakcjami alergicznymi i infekcjami pasożytniczymi9,10. Jeśli chodzi o diagnostykę, rekombinowany test ELISA na bazie HP-NAP zastosowano do wykrywania przeciwciał w surowicy przeciwko HP-NAP u pacjentów zakażonych H. pylori 11. Jedno z badań wykazało, że poziom przeciwciał specyficznych dla HP-NAP w surowicy pacjentów zakażonych H. pylori z rakiem żołądka był znacznie wyższy niż u pacjentów z przewlekłym zapaleniem żołądka12. Inne badanie wykazało również, że przeciwciała w surowicy przeciwko HP-NAP są związane z obecnością gruczolakoraka żołądka bez wróżbienia13. W związku z tym rekombinowany test ELISA oparty na HP-NAP może być stosowany do wykrywania przeciwciał surowicy przeciwko HP-NAP w celu prognozowania raka żołądka u pacjentów zakażonych H. pylori. Podsumowując, oczyszczony HP-NAP może być dalej wykorzystywany do zapobiegania, leczenia i prognozowania chorób związanych z H. pylori, a także do terapii raka.

Wśród kilku metod stosowanych do oczyszczania rekombinowanego HP-NAP wyrażonego w Escherichia coli (E. coli) w jego natywnej formie, do tej pory zgłoszono drugi etap oczyszczania, obejmujący chromatografię żelowo-filtracyjną, aby uzyskać wysoce czysty HP-NAP14-16. W tym artykule opisano metodę wykorzystującą chromatografię okresową w trybie ujemnym z żywicami jonowymiennymi dietyloaminoetylowymi (DEAE) do oczyszczania nadekspresji HP-NAP w E. coli z wysoką wydajnością i czystością. Ta technika oczyszczania opierała się na wiązaniu białek komórek gospodarza i/lub zanieczyszczeń innych niż HP-NAP z żywicą. Przy pH 8,0 prawie żadne inne białka poza HP-NAP nie są odzyskiwane z frakcji niezwiązanej. To podejście do oczyszczania przy użyciu chromatografii jonowymiennej DEAE w trybie ujemnym jest proste i oszczędza czas, umożliwiając oczyszczanie rekombinowanego HP-NAP za pomocą chromatografii jednoetapowej poprzez zbieranie frakcji niezwiązanej. Oprócz HP-NAP doniesiono również, że kilka innych biomolekuł, takich jak wirusy17, immunoglobulina G (IgG)18, hemoglobina19, fosfataza białkowa20 i czynnik wirulencjiflagelina 21, są również oczyszczane za pomocą chromatografii jonowymiennej w trybie ujemnym. Tryb ujemny jest preferowany w chromatografii jonowymiennej, jeżeli zanieczyszczenia są drugorzędnymi składnikami obecnymi w próbce poddanej oczyszczaniu22. Zastosowanie chromatografii ujemnej w oczyszczaniu naturalnych lub rekombinowanych biomolekuł zostało niedawno poddane przeglądowi23.

Niniejszy raport przedstawia krok po kroku protokół ekspresji rekombinowanego HP-NAP w E. coli, lizy komórek i oczyszczania HP-NAP za pomocą chromatografii wsadowej w trybie ujemnym z żywicami jonowymiennymi DEAE. Jeśli białko przeznaczone do oczyszczenia nadaje się do chromatografii jonowymiennej w trybie ujemnym, opisany protokół może być również zaadaptowany jako punkt wyjścia do opracowania procesu oczyszczania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzka krew została pobrana od zdrowych ochotników za uprzednią pisemną świadomą zgodą i zgodą Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua w Hsinchu na Tajwanie.

1. Ekspresja rekombinowanego HP-NAP w E. coli

  1. Przygotować plazmid pET42a-NAP zawierający sekwencję DNA HP-NAP ze szczepu H. pylori 26695, jak opisano wcześniej16. Przygotować plazmidy zawierające sekwencję DNA HP-NAP z pożądanymi mutacjami punktowymi, jak opisano (patrz Protokół, krok 8).
  2. Przekształć 10 ng powyższych plazmidów DNA w kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3) przez szok termiczny przez 45 sekund w temperaturze 42 °C, umieścić komórki na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB) zawierających 50 μg/ml kanamycyny i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
  3. Zaszczepić pojedyncze kolonie w pojedynczych probówkach zawierających 5 ml bulionu LB 50 μg/ml kanamycyny i hodować je jako kultury wstępne w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem przy 170 obr./min.
  4. Zaszczepić 2 ml powyższych komórek hodowli wstępnej w 200 ml bulionu LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny w kolbie o pojemności 1 l. Inkubować zaszczepioną kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż absorbancja przy 600 nm osiągnie około 0,4-0,5 wykrytej przez spektrofotometr UV/VIS.
  5. Dodać 80 μl 1 M izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do powyższej kultury do końcowego stężenia 0,4 mM w celu wywołania ekspresji HP-NAP. Inkubować kulturę przez 3 godziny, aż absorbancja przy 600 nm osiągnie około 1,6-1,7.
  6. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu usunięcia supernatantu. Przechowywać osad komórkowy w temperaturze -70 °C do czasu oczyszczenia.

2. Przygotowanie frakcji białka rozpuszczalnego zawierającej HP-NAP

Uwaga: Wszystkie poniższe czynności są wykonywane w temperaturze 4 °C.

  1. Zawiesić 50 ml osadu komórkowego przygotowanego w kroku 1.6 protokołu w 20 ml 20 mM Tris-HCl o pH 9,0, 50 mM NaCl zawierającym 0,13 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,03 mM N-alfa-tozylo-L-lizynylo-chlorometyloketonu (TLCK) i 0,03 mM N-tozylo-L-fenyloalaninylo-chlorometyloketonu (TPCK) w temperaturze 4 °C, jak opisano wcześniej16.
  2. Rozbić komórki bakteryjne, przepuszczając zawiesinę bakteryjną przez homogenizator wysokociśnieniowy działający w zakresie od 15 000 do 20 000 psi 7 razy w temperaturze 4 °C.
  3. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 30 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w celu oddzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji białkowych za pomocą ultrawirówki. Przenieść supernatant w postaci rozpuszczalnej frakcji białkowej do zlewki.
  4. Zmierzyć stężenie białka w rozpuszczalnej frakcji białkowej metodą Bradforda, używając komercyjnego zestawu z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako wzorcem zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Dodać 177,6 μl 1 N HCl do 20 ml rozpuszczalnej frakcji białkowej otrzymanej z kroku 2.3 Protokołu, aby dostosować jej wartość pH z pH 9,0 do pH 8,0.
  6. Dodać 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl do powyższego roztworu białkowego, aby końcowe stężenie białka wynosiło 0,5 mg/ml.

3. Oczyszczanie rekombinowanego HP-NAP z E. coli metodą chromatografii wsadowej w trybie ujemnym z użyciem żywic jonowymiennych DEAE

  1. Przygotuj 15 ml żywicy DEAE.
    1. Odważyć 0,6 g suchego proszku żywic DEAE i zawiesić go w 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 dzień.
    2. Odwirować żywicę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min.
    3. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    4. Dodać 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
    5. Powtórz kroki protokołu od 3.1.2 do 3.1.4 jeszcze cztery razy.
    6. Przechowywać 15 ml osiadłej żywicy (50% zawiesiny w 30 ml buforu Tris) w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
      Uwaga: Wszystkie poniższe czynności są wykonywane w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać 45 ml rozpuszczalnych białek przygotowanych w kroku 2.6 protokołu do 15 ml żywicy i mieszać zawiesinę białkowo-żywiczną mieszadłem magnetycznym w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  3. Wlać zawiesinę białka/żywicy do plastikowej lub szklanej kolumny wyposażonej w zawór odcinający. Pozwól, aby żywica osiadła pod wpływem grawitacji.
  4. Otwórz kurek, aby roztwór białkowy mógł przepływać przez kolumnę przez przepływ grawitacyjny, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję niezwiązaną, która zawiera oczyszczony HP-NAP.
  5. Dodać do kolumny 15 ml lodowatego 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
  6. Otworzyć kurek, aby bufor płuczący mógł przepływać przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję płuczącą.
  7. Powtórz kroki protokołu od 3.5 do 3.6 jeszcze cztery razy, aby zebrać dodatkowe frakcje płukania.
  8. Dodać 15 ml lodowatego 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl do kolumny.
  9. Otwórz kurek, aby bufor elucyjny mógł przepływać przez kolumnę przez przepływ grawitacyjny, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję elucyjną.
  10. Powtórz kroki protokołu od 3.8 do 3.9 jeszcze cztery razy, aby zebrać dodatkowe frakcje elucyjne.

4. Wymiana buforu i usuwanie endotoksyn z HP-NAP oczyszczone metodą chromatografii wsadowej w trybie ujemnym za pomocą żywic DEAE

Uwaga: Oczyszczony HP-NAP wyrażony w E. coli musi zostać poddany wymianie buforowej i usunięciu endotoksyn przed stymulacją neutrofili.

  1. Przeprowadzić dializę w celu zmiany buforu oczyszczonego HP-NAP na buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco, pH 7,2, w temperaturze 4 °C, używając rurki do dializy o masie cząsteczkowej odcięcia 14 kDa, jak opisano wcześniej24.
  2. Przefiltrować dializowany HP-NAP przez filtr strzykawkowy z dodatnio naładowaną, hydrofilową membraną przymocowaną do jednorazowej strzykawki o pojemności 20 ml przy natężeniu przepływu w zakresie od 2,5 do 4 ml/minutę w temperaturze 4 °C w celu usunięcia endotoksyny.

5. Charakterystyka właściwości molekularnych oczyszczonego rekombinowanego HP-NAP za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowym i poliakryloamidowym (SDS-PAGE), Western Blotting, Native-PAGE, chromatografii filtracji żelowej i spektroskopii dichroizmu kołowego

  1. Przeanalizować oczyszczony rekombinowany HP-NAP za pomocą SDS-PAGE i western blot z supernatantami z kultur hybrydoma zawierających mysie przeciwciało monoklonalne MAb 16F425, jak opisano wcześniej24.
  2. Przeanalizować oczyszczony HP-NAP za pomocą natywnej chromatografii filtracyjnej i filtracji żelowej, aby zbadać jego oligomeryczny status, jak opisano wcześniej26.
  3. Przeanalizuj oczyszczony rekombinowany HP-NAP za pomocą spektroskopii dichroizmu kołowego, aby zbadać jego strukturę drugorzędową, jak opisano wcześniej26.

6. Ocena czystości HP-NAP za pomocą barwienia srebrem żelu SDS-PAGE

  1. Przygotuj roztwór utrwalający, roztwór uczulający, roztwór srebra, roztwór do wywoływania, roztwór zatrzymujący i roztwór myjący zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do barwienia srebra.
  2. Barwienie srebrem żelu SDS-PAGE należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do barwienia srebra.
  3. Uzyskaj obraz żelu za pomocą systemu obrazowania.

7. Pomiar produkcji ROS z neutrofili indukowanej przez HP-NAP

  1. Wyizolować ludzkie neutrofile z ludzkiej krwi heparynizowanej przez sedymentację dekstranu, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości, jak opisano wcześniej24.
  2. Pomiar produkcji ROS z neutrofili stymulowanych HP-NAP za pomocą testu chemiluminescencji zależnego od luminolu.
    1. Włączyć czytnik płytek i ustawić temperaturę na 37 °C. Umieścić pustą 96-dołkową białą płytkę z płaskim dnem w komorze czytnika płytek, pozwalając jej ogrzać się do 37 °C.
    2. Przygotować mieszaniny bodźców w D-PBS, pH 7,2, zawierające 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 i 13,3 μM 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodion (luminol) z obecnością i bez 0,67 μM usuniętej endotoksyny HP-NAP przygotowanej z kroku 4.2 protokołu.
    3. Dostosuj stężenie ludzkich neutrofili przygotowanych z kroku 7.1 protokołu do 2 x 106 komórek/ml w D-PBS, pH 7,2, zawierającym 5 mM glukozy.
    4. Dodać 50 μl zawiesiny neutrofili do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
    5. Dodać 150 μl mieszanin bodźców przygotowanych z kroku 7.2.2 protokołu do studzienki zawierającej neutrofile w odstępie czasu 5 sekund na basenik.
    6. Mierzyć emisję chemiluminescencji przez 5 sekund na studzienkę przez okres trzech godzin za pomocą czytnika płytek.

8. Budowa plazmidów DNA zawierających mutanty HP-NAP za pomocą opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) Site-direct Mutageneza

Uwaga: Mutageneza bezpośrednia w miejscu oparta na PCR została wygenerowana zasadniczo tak, jak opisano wcześniej27, z wyjątkiem tego, że "ciche" miejsca restrykcyjne zostały wprowadzone do starterów mutagenezy za pomocą oprogramowania wspomagającego mutagenezę ukierunkowaną (SDM)28.

  1. Wykonaj reakcję PCR.
    1. Dodać 10 ng plazmidu pET42a-NAP, 1 μM par starterów mutagenezy wymienionych w tabeli 1, 200 μM trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP) i 3 jednostki mieszanki enzymów PCR o wysokiej wierności do probówki PCR zawierającej wodę dejonizowaną, uzyskując końcową objętość 25 μl.
    2. Rozpocząć cykle PCR w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu denaturacji matrycy DNA, a następnie wykonać 12 cykli amplifikacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę, Tm no-5 °C przez 1 minutę i 72 oC przez 6 minut.
    3. Zakończyć cykle PCR etapem wyżarzania w temperaturze Tm pp-5 oC przez 1 minutę i etapem przedłużania w temperaturze 72 °C przez 30 minut.
  2. Poddać 15 μl produktu PCR 0,4 μl enzymu restrykcyjnego Dpn I w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, a następnie przeanalizować 2 μl produktu PCR poddanego działaniu Dpn I za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
  3. Mutanty ekranowe.
    1. Przekształć 2 μl produktu PCR w komórki kompetentne do E. coli DH5α poprzez szok termiczny przez 45 sekund w temperaturze 42 °C.
    2. Rozprowadzić przekształcone komórki na płytce LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
    3. Wyizoluj plazmidowe DNA z kolonii bakteryjnych za pomocą komercyjnego zestawu do lizy alkalicznej zgodnie z protokołem producenta.
    4. Plazmidowe DNA wyizolowane w kroku 8.3.3 protokołu należy potraktować enzymem restrykcyjnym XhoI, aby zweryfikować obecność pożądanych cichych mutacji zgodnie z protokołem producenta.
    5. Sekwencjonować plazmidowe DNA zweryfikowane w kroku 8.3.4 protokołu za pomocą startera promotora T7 w celu potwierdzenia korekty sekwencji kodujących mutantów HP-NAP zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat procedury eksperymentalnej ujemnego oczyszczania rekombinowanego białka HP-NAP ekspresowanego w E. coli z zastosowaniem żywic jonowymiennych DEAE w trybie okresowym przedstawiono w Rysunek 1Ta technika oczyszczania opiera się na wiązaniu białek komórek gospodarza i/lub zanieczyszczeń innych niż HP-NAP do żywicy. Przy pH 8,0 z frakcji nie związanej odzyskuje się niemal żadne inne białka poza HP-NAP w jego formie natywnej (Rycina 2A i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj chromatografia okresowa w trybie ujemnym z żywicami anionowymiennymi DEAE nadaje się do oczyszczania rekombinowanego HP-NAP z nadekspresją w E. coli. Wartości pH stosowanych na etapach lizy i oczyszczania komórek są bardzo ważne dla zapewnienia rozpuszczalności HP-NAP w lizatach E. coli i skutecznego oddzielania rekombinowanego HP-NAP od zanieczyszczeń komórek gospodarza. Komórki bakteryjne należy poddać lizie przy pH 9,0, a oczyszczanie ujemne należy przeprowadzić przy pH 8,0 w celu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

HWF i YCY są wynalazcami patentów TW I 432579 i US 8,673,312 na metodę jednoetapowego oczyszczania białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori . Wszystkie materiały opisane w manuskrypcie będą dostępne do celów badawczych. Autorzy potwierdzają, że nie zmienia to ich przestrzegania wszystkich zasad JoVE dotyczących udostępniania danych i materiałów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Chao-Sheng Cheng z National Tsing Hua University na Tajwanie za wykonanie pomiaru dichroizmu kołowego. Dziękujemy również dr Evanthii Galanis i dr Ianko D. Iankovowi z Mayo Clinic w USA za dostarczenie przeciwciała monoklonalnego anty-HP-NAP. Dziękujemy doktorom Han-Wen Chang i Chung-Chu Chen z Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Tajwan za udzielenie porad dotyczących stosowania IRB, panu Te-Lung Tsai ze szpitala Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Tajwan, za nadzór nad analizą wyizolowanych neutrofili oraz pani Ju-Chen Weng z National Tsing Hua University na Tajwanie za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 i NSC98-2311-B-007-006-MY3), Wspólnego Programu Badawczego Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua i Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) oraz programu badawczego Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua (104N2052E1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
pET42a-NAP Nie dotyczyNie dotyczysporządzono zgodnie z opisem w danych uzupełniających do referencji 15 
> http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317E. coli BL21 (DE3)Thermo Fisher Scientific IncC6000-03https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
KanamycynaAmresco25389-94-0http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)10837091001 Sigma-Aldrich
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW
N-alfa-tozylo-L-lizynylo-chlorometyloketon (TLCK)Sigma-AldrichT7254
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW
N-tozylo-L-fenyloalaninylo-chlorometyloketon (TPCK)Sigma-AldrichT4376
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW
Wzorzec białka (albumina surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichP5619 standardowe białko do testu białkowego Bio-Rad
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE– Sephadex   Chlorek A-25 zSigma-AldrichA25120http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW
rurki do dializy Spectrum/PorSpectrum Laboratories132720z granicą masy cząsteczkowej 14 kDa
http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Jednostki Acrodisc® z Mustangiem® Membrana EPallMSTG25E3do usuwania endotoksyn; działała przy natężeniu przepływu w zakresie od 1 do 4 ml/min
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
mysiego przeciwciała monoklonalnego MAb 16F4N/AN/Apodniesionego w stosunku do oczyszczonego HP-NAP szczepu H. pylori NCTC 11637, jak opisano w referencji 23;   Prezent od dr Evanthii Galanis i dr Ianko D. Iankova w Mayo Clinic, USA
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare Life Sciences28989335do chromatografii z filtracją żelową
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
Zestaw do barwienia srebra PlusOne, białkoGE Healthcare Nauki Przyrodnicze17-1150-01http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare Nauki Przyrodnicze17-1440-02do wirowania w gradifikacji gęstości w celu oczyszczenia ludzkich neutrofili
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Biała płytka z płaskim dnem 96 dołkówThermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
LuminolSigma-AldrichA8511chroniona przed światłem
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW
Rozwiń   system PCR z długą matrycąSigma-Aldrich11681834001źródłem mieszanki enzymów High Fidelity PCR
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW
Dpn INew England BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho INew England BiolabsR0146Shttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5&alfa;Thermo Fisher Scientific Inc18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
NazwaFirmaNumer produktuKomentarze
>Equipment
 
Spektrofotometr UV/VIS dwuwiązkowy U-2800Hitachi Niepoza rynkiem i zmodernizowany do nowego modelu
http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
homogenizator wysokociśnieniowy EmulsiFlex-C3Avestin IncC315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html
ogólnej ultrawirówki Hitachi Koki himac CP80WX HitachiKoki Co90106401do oddzielania rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji białkowych od E. coli lizatów
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
Ä KTA FPLCGE Healthcare Life Sciences18-1900-26do chromatografii z filtracją żelową
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Spektrofotometr CD Aviv model 62ADSAviv BiomedicalN/Awycofany z rynku i zmodernizowany do nowego modelu http://www.avivbiomedical.com/circular.php
systemu obrazowania LAS-3000FujifilmN/Awycofane i wymienione
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
Wallac 1420 (Victor2) licznik wieloetykietowyPerkin-Elmer1420-018do detekcji chemiluminescencji
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018
Inhibitor proteazy Inhibitor proteazy Inhibitor proteazy dotyczy

Bibliografia

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157(2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786(2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie HP NAPchromatografia negatywnawymiana jonowa DEAEoczyszczanie w trybie okresowymekspresja bia ek rekombinowanychrozpuszczalno bia ekoptymalizacja pHultrawirowaniemetoda Bradforda

Powiązane artykuły