Ten artykuł opisuje metodę pomiaru utleniania paliwa u Drosophila melanogaster, w której muchom podawane są śladowe ilości specyficznych, znakowanych radioaktywnie substratów metabolicznych. Wydychany znakowany radioizotopowo CO2 powstający w wyniku utleniania paliwa jest zbierany i mierzony.
Artykuł metodologiczny
Pomiar produkcji dwutlenku węgla z substratów znakowanych radioaktywnie u Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Moc genetyki Drosophila jest coraz częściej wykorzystywana do zagadnień sygnalizacji hormonalnej i metabolizmu oraz do rozwoju modeli chorób ludzkich w tym organizmie. Czułe metody pomiaru parametrów, takich jak tempo metabolizmu, są potrzebne do lepszego zrozumienia fizjologii i chorób u małych zwierząt, takich jak muszki owocowe. Opisana tutaj metoda ocenia utlenianie paliwa u niewielkiej liczby dorosłych much karmionych pokarmem zawierającym śladowe ilości 14substratów znakowanych C, takich jak glukoza lub kwas tłuszczowy. Po okresie karmienia i wszelkich dodatkowych manipulacjach eksperymentalnych, muchy są przenoszone do krótkich rurek przykrytych siatką, które są następnie umieszczane w szklanych fiolkach zawierających bibułę filtracyjną nasyconą KOH, która zatrzymuje wydychany, znakowany radioaktywnie CO2 powstały w wyniku utleniania substratów znakowanych radioaktywnie jako wodorowęglan potasu, KHCO3. Ten znakowany radioaktywnie wodorowęglan mierzy się za pomocą zliczania scyntylacyjnego. Jest to ilościowe, powtarzalne i proste podejście do badania utleniania paliw. Zastosowanie znakowanej radioaktywnie glukozy, kwasów tłuszczowych lub aminokwasów pozwala określić udział tych różnych źródeł paliwa w metabolizmie energetycznym w różnych warunkach, takich jak karmienie i post oraz w różnym podłożu genetycznym. Uzupełnia to inne podejścia stosowane do pomiaru metabolizmu energetycznego in vivo i powinno przyczynić się do lepszego zrozumienia regulacji metabolicznej.
Wprowadzenie
Praca nad modelowym organizmem Drosophila melanogaster znacznie przyczyniła się do zrozumienia zasad genetycznych, procesów rozwojowych, wzrostu, starzenia się, zachowania, odporności i chorób człowieka1,2. Niezliczone podejścia genetyczne i biologiczne do populacji Drosophila przyczyniły się do postępu w tych obszarach. Jednak badania nad metabolizmem muszki owocowej rozwijały się wolniej, w dużej mierze ze względu na trudności w pomiarze parametrów metabolicznych u tak małego zwierzęcia. Zainteresowanie wykorzystaniem Drosophila jako modelu do badania chorób ludzkich, takich jak cukrzyca, oraz do zrozumienia udziału metabolizmu we wzroście i różnych patologiach, popchnęło tę dziedzinę do opracowania i dostosowania technik metabolicznych dla tego organizmu3,4.
Niezawodne metody pomiaru wielu parametrów metabolicznych u muszki owocowej są teraz dostępne. Na przykład łatwo jestocenić spożycie pokarmu5, poziom zmagazynowanych trójglicerydów i glikogenu, a także poziom glukozy w krwionolimce we krwi i główny cukier krążący w muszce, trehalozę, która jest disacharydem złożonym z dwóch cząsteczek glukozy4. Zastosowanie znaczników metabolicznych umożliwiło badanie wchłaniania składników odżywczych z diety i przekształcania wchłoniętych składników odżywczych, takich jak glukoza, w formy magazynujące glikogen i trójglicerydy6. Tempo metabolizmu muszki owocowej można ocenić poprzez pomiar zużycia tlenu7,8 i produkcji dwutlenku węgla (CO2 ). Cykl kwasu cytrynowego utlenia dwuwęglowe jednostki, które mogą wejść do cyklu jako acetylokoenzym A (CoA), który pochodzi z metabolizmu dietetycznych i magazynowanych węglowodanów i kwasów tłuszczowych. Każdy obrót cyklu generuje po jednej cząsteczce GTP (lub ATP) i donora elektronów FADH2, trzech cząsteczek NADH i dwóch cząsteczek produktu odpadowego CO2 . Produkcja CO2 może być wykorzystana do oszacowania podstawowej przemiany materii. Całkowita produkcja CO2 u Drosophila może być oznaczona ilościowo za pomocą dostępnych na rynku lub ręcznie robionych respirometrów9-10,11.
Pomiar całkowitej produkcjiCO2, zwłaszcza w połączeniu z pomiarem zużycia O2, dostarcza cennych informacji na temat metabolizmu energetycznego całego ciała. Jednak miara ta nie identyfikuje składnika odżywczego utlenianego do produkcji adenozynotrifosforanu (ATP). Trzy główne klasy składników odżywczych mogą wejść do cyklu kwasu cytrynowego po przekształceniu w acetylo-CoA: węglowodany, kwasy tłuszczowe i białka. Glukozo-6-fosforan, pochodzący z glukozy w diecie lub zmagazynowanego glikogenu, może zostać przekształcony w pirogronian, który jest dekarboksylowany przez dehydrogenazę pirogronianową w celu wytworzenia acetyloCoA. Rozkład kwasów tłuszczowych pochodzących z diety lub ze zmagazynowanych trójglicerydów przez ß-oksydację daje acetylo-CoA, który następnie wchodzi w cykl kwasu cytrynowego. Wreszcie, większość aminokwasów może wejść do cyklu kwasu cytrynowego po przekształceniu w pirogronian, acetylo-CoA lub produkty pośrednie cyklu kwasu cytrynowego, takie jak alfa-ketoglutaran.
Specyficzny dla składników odżywczych wkład w metabolizm energetyczny w warunkach podstawowych i stymulowanych może być monitorowany za pomocą radioaktywnych znaczników. Przedstawiony tutaj protokół jest przystosowany do stosowania u Drosophila z protokołu stosowanego do oceny utleniania w komórkach hodowanych w kulturze12,13. W tym podejściu muszki owocowe są karmione 14znakowanymi radioaktywnie substratami metabolicznymi (węglowodanami, kwasami tłuszczowymi lub aminokwasami) w diecie przez krótki (godzinny) lub długi (dni) impuls, ścigane na nieoznakowanym pokarmie, a następnie wystawiane na działanie komory zawierającej bibułę filtracyjną nasyconą wodorotlenkiem potasu (KOH) w celu wychwytywania wydychanego CO2 jako wodorowęglanu. Wodorowęglan znakowany radioaktywnie można określić ilościowo przez zliczanie scyntylacyjne. Różnice w produkcji znakowanego radioizotopowo CO2 między eksperymentalnymi grupami much mogą na przykład odzwierciedlać stosowanie różnych paliw do produkcji ATP w trakcie długotrwałego postu lub wewnętrzne różnice w metabolizmie paliwa między genotypami.
Protokół
1. Przygotowanie pokarmu dla much zawierającego radioznakowane substraty metaboliczne
- W probówce do mikrofuge wymieszać 1 - 2 μCi znakowanego radioaktywnie substratu (D-[6-14C]-glukozy, D-[1-14C]-glukozy lub [1-14C]-kwasu palmitynowego, 40 - 60 mCi/mmol) z 15 μl niebieskiego barwnika spożywczego FD&C nr 1 iH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 25 μl.
UWAGA: Węgiel-14 jest niskoenergetycznym emiterem beta i ma krótki zasięg w powietrzu. Należy jednak uważać, aby zapobiec rozlaniu się cząsteczek znakowanych radioaktywnie lub przypadkowemu spożyciu przez eksperymentatora. Fiolki z pokarmem dla much łatwo się przewracają; Pamiętaj, aby umieścić je w pojemniku, który zapobiegnie ich przewróceniu, zwłaszcza gdy RadioLabel jest w postaci płynnej (krok 1.2) lub w niezestalonej żywności (krok 1.4). Muchy, które są karmione lub były karmione substratami znakowanymi radioizotopem, zaczną wydychać niewielkie ilości znakowanego radioaktywnie CO2 . Muchy te powinny być trzymane w akrylowych pudełkach w wyciągach, a w pudełku można umieścić małe naczynie KOH do użycia jako płuczka CO2 . - Odpipetować cały substrat znakowany radioaktywnie i niebieski barwnik na dno pustej fiolki z pokarmem dla much (wysokość: 9,4 cm, szerokość: 2,2 cm).
- Podgrzej standardowy pokarm dla much w kuchence mikrofalowej, aż żywność po prostu się upłynni (15 - 20 sekund przy wysokim poziomie mocy dla jednej fiolki zawierającej 10 ml pokarmu).
- Dodaj 975 μl stopionego pokarmu do znakowanej radioaktywnie mieszanki substratu / niebieskiego barwnika i szybko zamieszaj, monitorując jednorodność niebieskiego koloru, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
- Pozostaw żywność do ostygnięcia i całkowitego zestalenia się w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 minut.
2. Karmienie dorosłych muszek owocowych radioznakowanymi substratami metabolicznymi
- Dorosłe muchy należy znieczulić za pomocą aparatu znieczulającego CO2 składającego się z porowatego polietylenu połączonego z akrylową podstawą i podłączonego do zbiornika CO2 z regulatorem ciśnienia. Wlać CO2 do aparatu znieczulającego z prędkością 5 l/min.
- Przenieść znieczulone muchy do fiolek zawierających znakowany radioizotermicznie, barwiony na niebiesko pokarm (n = 15 - 30 much na fiolkę). Zakręć fiolki piankowym korkiem i odpoczywaj poziomo, aż muchy się obudzą. Przenieść fiolki do akrylowego pojemnika z pokrywką (180 cm x 180 cm x 240 cm wysokości).
- W przypadku krótkotrwałego karmienia muchy należy głodzić przez 18 - 24 godziny przed przeniesieniem much do znakowanego radioaktywnie pokarmu na 2-3 godzinny etap karmienia. Etapgłodu jest ważny, ponieważ karmione muchy nie będą niezawodnie jeść nowego źródła pożywienia, które zostanie im przedstawione. W przypadku długotrwałego karmienia w ciągu 5 - 7 dni muchy nie muszą być głodzone, ale eksperymentator powinien monitorować zawartość wody w znakowanym radioaktywnie pokarmie w fiolkach, w których trzymane są muchy, i użyć igły i strzykawki, aby dodać wodę do fiolek z suchą karmą.
- Przenieś muchy do nieoznakowanego pokarmu, "stukając" je w nową fiolkę. Początkowy okres pościgu trwający od 2 do 4 godzin pozwala muszkom oczyścić znakowane radioaktywnie cząstki pokarmu ze skórek i umożliwia trawienie znakowanego radioaktywnie pokarmu pozostałego w jelitach. Monitoruj postęp pokarmu w jelitach poprzez oględziny much w poszukiwaniu niebieskich odwłoków.
- Następnie przenieś muchy na różne rodzaje pokarmu (12 - 24 godziny na standardowym pokarmie lub 1% agar do pomiaru wpływu stanu na czczo na oddychanie) lub temperatury otoczenia (12 - 96 godzin w temperaturze 18 °C lub 30 °C w przypadku manipulacji genetycznych przy użyciu wrażliwego na temperaturę GAL80 (GAL80ts), np.
Uwaga: Długość tego okresu pościgu będzie się różnić w zależności od przeprowadzanego eksperymentu. Na przykład, 96-godzinny pościg w temperaturze 30 °C może być konieczny w eksperymentach z użyciemGAL80 ts w celu pełnej aktywacji ekspresji transgenu zależnej od GAL4.
3. Przygotowanie aparatury do zbierania CO2
- Zbierz materiały do budowy "muchówek", rurek z siatką, które będą zawierały muchy oznaczone 14C-glukozą lub 14C-kwasem palmitynowym i które pozostaną otwarte na atmosferę. Odetnij górne 50 mm z rurek polipropylenowych o wymiarach 12 mm x 75 mm, pozostawiając rurki o długości 25 mm i okrągłym dnie. Przygotuj kwadraty o wymiarach 35 mm x 35 mm z siatki nylonowej 130 μm. Zaopatrz się również w przezroczystą taśmę w dyspenserze do taśmy.
- Zebrać materiały do aparatury do zbierania CO2 . Dla każdej muchorolki należy założyć szklaną fiolkę scyntylacyjną o pojemności 20 ml, gumowy górny korek z otworem poza środkiem, środkową studzienkę, którą należy włożyć przez otwór w górnym korku, bibułę filtracyjną z mikrofibry szklanej klasy GF/B (okrąg o średnicy 2,1 cm, por 1 μm). Bibuła filtracyjna GF/B jest stosowana ze względu na jej wysoką wytrzymałość na mokro i wysoką nośność.
- Przygotuj 5% KOH świeżego w dniu użycia. Tuż przed krokiem 3.4 złóż i umieść okrągłą bibułę filtracyjną GF/B w środkowej studzince, która jest przewleczona przez otwór gumowego górnego korka i nasącz ją 100 μl 5% KOH. Patrz rysunek 1.
- Po inkubacji na nieznakowanych pożywkach, znieczulenie muszek za pomocą CO2 . Wciśnij muchy do odciętej rurki polipropylenowej, nakryj nylonową siatką i użyj przezroczystej taśmy, aby przykleić siatkę do rurki. Pracuj szybko, aby muchy nie obudziły się i nie uciekły, zanim siatka zostanie bezpiecznie przymocowana do rurki. W każdym strąku muchowym należy użyć równej liczby much do konkretnego eksperymentu; 10 - 20 much na muchę wytwarza wystarczającą ilość znakowanego radioaktywnieCO2 do pomiaru przez zliczanie scyntylacyjne (krok 4.1 poniżej).
- Przenieść saszetkę muchową do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Zakryj szklaną fiolkę gumowym górnym korkiem, w którym znajduje się środkowa studzienka zawierająca bibułę filtracyjną GF/B nasyconą KOH. Zawinąć szeroką górną część gumowego górnego korka na krawędź szklanej fiolki scyntylacyjnej. Patrz rysunek 1.
- Umieść szklane fiolki zawierające muchy w akrylowym pojemniku z pokrywką i inkubuj przez różne okresy czasu (dobrze działa od 2 do 12 godzin).
4. Analiza wyników
- Pod koniec inkubacji odkręć szklane fiolki i przenieś bibułę filtracyjną GF/B nasyconą KOH do 6 ml plastikowej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 4 ml koktajlu scyntylacyjnego.
- W razie potrzeby zamrozić muchy w muchach na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszego określenia przechowywanych substratów. Należy pamiętać, że próbki te są radioaktywne i muszą być odpowiednio przechowywane.
- Przygotuj dodatkowe fiolki scyntylacyjne: jedną zawierającą niewykorzystaną bibułę filtracyjną GF/B, która służy jako tło, oraz jedną lub dwie inne zawierające 0,1 - 0,5 μCi substratu znakowanego radioaktywnie w celu oznaczenia cpm/μCi.
- Zmierz cpm dla każdej próbki za pomocą licznika scyntylacyjnego zgodnie z protokołem producenta.
- Oblicz pmol 14CO2/cpm i pmol 14CO2 na lot na godzinę. Odejmij tło cpm od wartości cpm dla każdej próbki. Na podstawie czystych danych substratu znakowanego radioaktywnie oblicz cpm/μCi zliczonej próbki z korektą tła.
- Do obliczenia pmol/cpm należy użyć podanej przez producenta aktywności właściwej i stężenia radiochemicznego substratu znakowanego radioaktywnie (na przykład odpowiednio 50 μCi/μmol i 0,1 μCi/μl). Użyj tego współczynnika, aby przekonwertować dane z muchomierzami z korekcją tła z cpm 14CO2 / próbkę na pmol 14CO2 / próbkę. Następnie podziel przez liczbę much i liczbę godzin w kapsule.
Wyniki
Ilość wydychanego i wychwyconego radioznakowanego CO2, wytwarzanego w wyniku metabolizmu radioaktywnego substratu, powinna być skorelowana z liczbą much w pojemniku (fly pod) oraz z czasem przebywania zwierząt w aparaturze do zbierania CO2. Aby to sprawdzić, muchy poddane 18-godzinnej głodówce karmiono radioznakowanym kwasem palmitynowym (0,02 µCi/µl pokarmu) przez 2 h, a następnie badano produkcję radioznakowanego CO2 w grupach po 12 lub 25 zwierząt podczas inkubacji trwającej 3 lub 6 h. Ilość CO2 wytworzona przez 25 much była niemal dwukrotnie większa od ilości wytworzonej przez 12 much, a wartość dla każdej grupy uległa podwojeniu po wydłużeniu czasu inkubacji z 3 h do 6 h (Rysunek 2A). Wartość pmol 14CO2 / mucha / h była niemal identyczna w każdej grupie.
Post stymuluje rozkład kwasów tłuszczowych poprzez ß-oksydację; w związku z tym produkcja CO2 z oksydacji kwasów tłuszczowych powinna być zwiększona u zwierząt na czczo w porównaniu z zwierzętami karmionymi. Aby sprawdzić, czy tak jest, muchy po 18-godzinnym poście karmiono kwasem palmitynowym znakowanym radioizotopem przez 2 h. Po tym krótkim impulsie karmienia muchy podzielono na dwie grupy i przeniesiono na nieznakowaną pożywkę dla much lub 1% agar na 3 h, a następnie przeniesiono do kapsułek dla much (fly pods) na 2 h. W dwóch oddzielnych eksperymentach muchy w fazie wypłukiwania na agarze produkowały znacząco więcej znakowanego radioizotopem CO2 w porównaniu z muchami w fazie wypłukiwania na pożywce (Ryc. 2B), co wskazuje na zwiększenie ß-oksydacji u zwierząt na czczo.
Rysunek 1. Aparatura do zbierania wydychanego, znakowanego izotopem promieniotwórczym CO2.
Muchy, które spożyły znakowane izotopem substraty metaboliczne, umieszcza się w „kapsule dla much” (FP), będącej odciętą probówką wirówkową zamkniętą siatką (M). Kapsułę dla much umieszcza się w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml i zamyka gumowym korkiem (S) z otworem poza centrum, przez który wprowadza się wgłębnik (CW) zawierający papier filtracyjny GF/B nasączony 100 µl 5% KOH. Wydychany CO2 reaguje z KOH i zostaje uwięziony na papierze filtracyjnym w postaci wodorowęglanów. Ilość uwięzionego, znakowanego CO2 można określić za pomocą licznika scyntylacyjnego nasączonego papieru filtracyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. 14CO2 Produkcja koreluje z czasem oraz liczbą much w pojemniku typu fly pod i reaguje na warunki sytości oraz głodówki.
(A) Ilość 14CO2 wyprodukowane u much karmionych palmitynianem znakowanym izotopem promieniotwórczym koreluje z liczbą badanych much (n = 12 (słupki puste) lub 25 (słupki wypełnione)) oraz czasem spędzonym w klatce dla much (3 lub 6 h). W przeliczeniu na jedną muchę, muchy wyprodukowały 0,99, 1,13, 1,10 i 1,01 pmol 14tlenek węgla2 / godz. (dane wymienione w tej samej kolejności od lewej do prawej, co dane na wykresie).
(B) Muchy utrzymywane na agarze utleniły więcej radioaktywnie znakowanego palmitanu niż muchy utrzymywane na pożywce. Dane pochodzą z dwóch eksperymentów i przedstawiono je jako średnie ± odchylenie standardowe, n = 16–17 much/grupa (eksperyment 1); n = 10 much/grupa (eksperyment 2). * p = 0,017, test t Studenta. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę pomiaru utlenienia określonych substratów znakowanych radioaktywnie u dorosłego Drosophila melanogaster. Technika ta jest prosta, ilościowa, powtarzalna i czuła, a także uzupełnia istniejące metody pomiaru całkowitej produkcji CO2 i zużyciaO2 , ponieważ może być stosowana do identyfikacji składników odżywczych utlenianych do produkcji ATP.
Pomiar CO2 uwolnionego w wyniku utleniania określonych substratów znakowanych izotopem promieniotwórczym przy użyciu opisanej tutaj metody jest uzupełnieniem technik pomiaru całkowitej produkcji CO2 . Całkowita produkcja CO2 (VCO2) pozwala na oszacowanie tempa metabolizmu, a gdy znane jest całkowite zużycieO2 (VO2), można obliczyć tempo metabolizmu i oszacować źródło paliwa do utleniania na podstawie współczynnika wymiany oddechowej (VCO2 / VO2 = RER). Gdy wyłącznym substratem są węglowodany, RER = 1, ale gdy wyłącznym źródłem są kwasy tłuszczowe, RER = 0,7, ze względu na stechiometrię reakcji utleniania glukozy i lipidów. Ze względu na brak sprzętu do pomiaru zużycia tlenu u Drosophila14 nie można zidentyfikować źródła paliwa utleniającego. Jednak znakując muszki śladowymi ilościami tego czy innego substratu radioaktywnego i mierząc tempo produkcji znakowanego radioaktywnie CO2 , można wyciągnąć wnioski na temat zdolności much do utleniania danego substratu w różnych punktach czasowych podczas bodźca lub na temat wpływu danej mutacji na utlenianie paliwa.
W protokole tym składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, należy zachować ostrożność podczas stosowania materiałów promieniotwórczych, aby uniknąć wycieków i skażenia obszarów badawczych. Po drugie, gdy muchy znieczulające podczas kroków 2.1 i 3.4 powinny działać szybko, aby uniknąć wpływu długotrwałej ekspozycji na CO2 na metabolizm i zachowanie. Grupa 20 much może zostać znieczulona i przeniesiona do nowej fiolki lub do kapsuły muchowej w ciągu 20 sekund lub krócej. Po przeniesieniu z aparatu anestezjologicznego do fiolki z żywnością, fiolkę należy oprzeć na boku, aby zapobiec utknięciu znieczulonych much na powierzchni pokarmu. Kiedy muchy są karmione radioznakowanym pokarmem w ciągu kilku dni, jak w kroku 2.2, eksperymentator powinien upewnić się, że pokarm nie wysycha, ponieważ muchy są wrażliwe na odwodnienie.
Stan odżywienia lub postu przed etykietowaniem, wybór etykiety, długość czasu etykietowania, długość czasu w kapsule muchowej oraz metoda znieczulenia to parametry, które można poddać rozwiązywaniu problemów i modyfikacji podczas korzystania z tej techniki. Po pierwsze, muchy poddawane krótkim okresom znakowania (2 - 3 godziny) prawdopodobnie nie spożyją znacznych ilości żywności znakowanej radioaktywnie, chyba że wcześniej zostaną poddane okresowi postu. Po drugie, wybór etykiety może mieć wpływ na wnioski, jakie można wyciągnąć na temat fenotypów metabolicznych. Na przykład znakowana radioaktywnie produkcja CO2 z D-[1-14C]-glukozy może odzwierciedlać utlenianie w cyklu kwasu cytrynowego lub bocznika pentozofosforanu, podczas gdy znakowana radioaktywnie produkcja CO2 z D-[6-14C]-glukozy odzwierciedla utlenianie w cyklu kwasu cytrynowego tylko12,15,16. Karmienie muszek znakowanym radioaktywnie znacznikiem niezbędnego aminokwasu17,18 byłoby dobrą strategią oceny utleniania aminokwasów pochodzących z białek. Wreszcie, długie okresy znakowania radioaktywowaną glukozą również zwiększają możliwość włączenia tego prekursora do innych klas cząsteczek, takich jak trójglicerydy19 i aminokwasy, takie jak alanina, która łatwo przekształca się z pirogronianem. Można to ocenić, mierząc promieniotwórczość zawartą w tych różnych klasach cząsteczek6. Rzeczywiście, oddzielne kohorty much mogą być karmione substratami znakowanymi radioaktywnie w ten sam sposób, a następnie wykorzystywane do eksperymentów z muchami lub pomiaru znakowania radioaktywnego, które jest przechowywane i pozostaje w glikogenie i trójglicerydach na przykład w warunkach karmienia i na czczo6. Inną strategią jest stosowanie krótkich okresów znakowania, które prawdopodobnie ujawnią utlenianie samych znakowanych radioaktywnie składników odżywczych w diecie, a nie formy magazynowania tych składników odżywczych. Po trzecie, możliwe jest również, że dwie grupy much mogą mieć identyczne wskaźniki produkcji 14CO2 w danym okresie czasu, ale początkowo bardzo różne. Dlatego zmiana ilości czasu, jaki muchy spędzają w strąku muchowym, może być ważnym parametrem, który należy zmienić podczas oceny zmienności fenotypowej. Wreszcie, protokół ten wzywa do zastosowania krótkiego okresu znieczulenia CO2 podczas umieszczania much w aparacie do much. Możliwe jest, że znieczulenie CO2 może wpływać na funkcje metaboliczne w trakcie eksperymentu z muchom. Alternatywnym podejściem jest zastosowanie znieczulenia azotowego, które nie wpływa na tempo przemiany materii 20.
Podobnie jak w przypadku każdej techniki, która mierzy tak złożony system, jak utlenianie paliwa i tempo przemiany materii, opisana tutaj metoda ma ograniczenia. Po pierwsze, możliwe jest, że muchy w różnych grupach mogą spożywać różne ilości znakowanego radioaktywnie pokarmu, a tym samym wejdą w fazę zbierania CO2 w teście z różnymi wyjściowymi ilościami substratu. Można to do pewnego stopnia kontrolować, przeprowadzając eksperyment na dużych rozmiarach prób i masowo karmiąc muchy. Przez krótkie okresy znakowania, muchy z podobnymi niebieskimi wnętrznościami będą spożywać radioznacznik i mogą być przenoszone do części eksperymentu dotyczącej pościgu. Ilość radioznacznika pozostającego w grupie muszek może być również mierzona pod koniec eksperymentu oraz w oddzielnych kohortach much po zakończeniu okresu żerowania i początkowego pościgu. Po drugie, poziomy aktywności między grupami much w kapsułach muchowych mogą się różnić. Będzie to musiało zostać ustalone doświadczalnie i wzięte pod uwagę przy interpretacji danych. Po trzecie, technika ta nie mierzy całkowitej produkcji CO2 , a jedynie produkcję określonego składnika odżywczego w diecie lub formy przechowywania tego składnika odżywczego. Protokół ten nie zastępuje, ale uzupełnia pomiary VCO2 , ponieważ dostarcza różnych i dodatkowych informacji.
Opisana tutaj metoda mierzy wydychany, znakowany radioaktywnie CO2 , który jest produktem utleniania śladowych ilości określonych substratów metabolicznych. Zmieniając używaną etykietę - glukoza, kwas tłuszczowy lub aminokwas - można projektować coraz bardziej wyrafinowane eksperymenty, aby ocenić udział różnych substratów w metabolizmie w różnych warunkach fizjologicznych, takich jak głód i na różnych podłożach genetycznych. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują pomiar metabolizmu w fazie rozwoju larwalnego i poczwarki, dwóch etapów cyklu życiowego Drosophila , które charakteryzują się odpowiednio ekstremalnym magazynowaniem i rozkładem składników odżywczych.
Oświadczenia
Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Autor dziękuje doktorom Mingjian Lu i Morrisowi Birnbaumowi za pomocne rady i wsparcie finansowe od NIDDK (R21DK089391).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KWAS PALMITYNOWY, [1-14C]-, 50 &mikro; Ci | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUKOZA, D-[6-14C]-, 50 & mikro; Ci | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glukoza, D-[1-14C]-, 50&mikro; Ci | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Fiolki Drosophila, wąskie, polistyrenowe | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Siatka, nylon niteksowy, 120 i mikro; m | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowego | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Korek górnej kolby z otworem off-center | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Studzienka środkowa z polipropylenu | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Bibuła filtracyjna z mikrofibry szklanej Whatman GF/B, okrągła, średnica | 2,1 cmFisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| ml Fiolki scyntylacyjne z nakrętkami typu push-on/twist-off | National Diagnostics | SVC-06 |
Bibliografia
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut. Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).
- Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila. Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry. JoVE. (88), e51681(2014).
- Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress. Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).
- Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides. Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).
- Ontko, J. A., Jackson, D. Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations. J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).
- Vincent, A., Briggs, L., et al. parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress. Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).
- Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices. J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).
- Katz, J., Wood, H. G. The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).
- Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Sang, J. H., King, R. C. Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults. J Exp Biol. , (1961).
- Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis. J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).
Przedruki i uprawnienia
