Artykuł metodologiczny

Testy śmiałości, agresji i płycizny dla zespołów behawioralnych danio pręgowanego

DOI:

10.3791/54049

⸱

29 sierpnia 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Joseph’s University, 2Genomics and Computational Biology, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje przygotowanie, implementację i analizę śmiałości, agresji i ławicy u danio pręgowanego oraz testy na obecność zespołu behawioralnego. Ustandaryzowane podejście do kwantyfikacji behawioralnej pozwoli na łatwiejsze porównanie między badaniami. Modyfikacje tego protokołu są możliwe, ponieważ każdy test może być przeprowadzany indywidualnie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Syndrom behawioralny występuje, gdy określone zachowania wchodzą w interakcje w różnych kontekstach. Danio pręgowany był obiektem testów w ostatnich badaniach i ważne jest, aby ujednolicić protokoły, aby zapewnić właściwe analizy i interpretacje. W naszych poprzednich badaniach mierzyliśmy śmiałość, monitorując szereg zachowań (czas blisko powierzchni, opóźnienie w przejściach, liczba przejść i rzutek) w zbiorniku trapezowym o pojemności 1,5 l. Podobnie określiliśmy ilościowo agresję, obserwując ugryzienia, boczne wyświetlacze, strzałki i czas w pobliżu pochylonego lustra w prostokątnym zbiorniku o pojemności 19 litrów. Dzieląc zbiornik o pojemności 76 litrów na trzy części, zbadaliśmy również preferencje dotyczące mielizny. Test płycizny jest testem wysoce konfigurowalnym i może być dostosowany do konkretnych hipotez. Jednak protokoły dla tego testu również muszą być ustandaryzowane, a jednocześnie wystarczająco elastyczne, aby można je było dostosować. W poprzednich badaniach komory końcowe były albo puste, albo zawierały 5 lub 10 danio pręgowanego, albo 5 danio perłowych (D. albolineatus). W poniższym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowy protokół i reprezentatywne dane, które towarzyszą udanym zastosowaniom protokołu, co pozwoli na powtórzenie eksperymentów z syndromem behawioralnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje coraz więcej literatury badającej związki między różnymi zachowaniami u poszczególnych zwierząt z danej populacji. Powiązania te nazywane są syndromami behawioralnymi, a pomiary zazwyczaj obejmują śmiałość, agresję, zachowania eksploracyjne i towarzyskość1-5. Syndromy behawioralne są cenne zarówno z przyczyn bezpośrednich, jak i pośrednich. Bezpośrednio wiedza na temat syndromów behawioralnych może zapewnić pełniejszy obraz teorii ewolucji, struktury populacji i dynamiki populacji3. Pośrednio wiedza dotycząca powiązań behawioralnych może informować o dziedzinach, które kwantyfikują zachowanie, takich jak farmakologia6 , toksykologia7, genetyka behawioralna8,9 i endokrynologia10. Ze względu na te bezpośrednie i pośrednie korzyści, zwiększona wiedza na temat zespołów behawioralnych jest szczególnie cenna w powszechnie stosowanych organizmach modelowych, takich jak danio pręgowany. Badania z użyciem danio pręgowanego znajdują się w różnych dyscyplinach, w tym w analizie zespołów behawioralnych11-13. Aby poszerzyć wiedzę w badaniach nad syndromem behawioralnym i ponieważ inne dyscypliny również wykorzystują pomiary behawioralne do testowania hipotez, wymagane są wiarygodne i zwięzłe opisy zachowań dla ważnych analiz i interpretacji, a ustandaryzowane protokoły ułatwią porównania między badaniami w obrębie gatunków. Nasz protokół został opracowany w celu zmierzenia zespołu behawioralnego śmiałość-agresja-ławica w populacji zebry hodowanego w laboratorium14. Jednak podstawa protokołu (śledzenie poszczególnych ryb, zapewnienie właściwej randomizacji i odpowiednich analiz) może być łatwo modyfikowana dla różnych alternatywnych miar behawioralnych. Dodatkowo, testy śmiałości, agresji lub mielizny mogą być przeprowadzane indywidualnie w celu przetestowania różnych hipotez. Dlatego, chociaż naszym celem jest opisanie sposobu przeprowadzenia badania zespołu behawioralnego i protokołu skutecznego pomiaru zachowania na poziomie indywidualnym, każdy aspekt tej procedury może być niezależny.

Literatura na temat zespołów behawioralnych obejmuje kilka grup taksonomicznych, od stawonogów do ludzi4 i, aby zmierzyć zespół behawioralny, muszą być określone ilościowo co najmniej dwa konteksty behawioralne. Niestety, często istnieje niewielka spójność w testach, które są używane do ilościowego określania pomiaru behawioralnego na wszystkich osiach zachowania. Na przykład u ryb śmiałość można zmierzyć za pomocą testów T-labirynt, testów w terenie otwartym lub wprowadzenia nowego lub obcego bodźca15. Badania agresji u ryb mogą obejmować interakcje diady, testy bodźców wideo lub testy na modelach glinianych12,16,17. Podobnie, analiza zachowania ławicowego, która zazwyczaj obejmuje pomiar preferencji ławic, może być przeprowadzana w różnych typach zbiorników, przy użyciu różnych metod określania czasu asocjacji21-23. W tym protokole przedstawiono określony podzbiór ogólnego repertuaru testów behawioralnych. W szczególności protokół ten przedstawia metodologię śledzenia osobników za pomocą testów śmiałości, agresji i płycizny w sposób, który ułatwia porównania wśród osobników w celu określenia, czy porównania są spójne dla wszystkich osobników w populacji. Przeprowadziliśmy ten protokół z danio pręgowanym i pielęgnicami skazańcami (Amatitlania nigrofasciata) w poprzednich badaniach14,18 i będzie on działał z każdą rybą słodkowodną o podobnej wielkości.

Testy śmiałości są przeprowadzane w trapezoidalnym zbiorniku o pojemności 1,5 litra, który ma poziomą linię wyznaczającą równe obszary w górnej i dolnej części zbiornika. Ilościowe zachowania obejmują liczbę przejść przez badaną rybę między górną i dolną częścią zbiornika, czas spędzony w każdej porcji, liczbę strzałek i opóźnienie wejścia do górnej części. Test agresji przeprowadza się w prostokątnym zbiorniku o pojemności 19 litrów, który zawiera lustro o wymiarach 3 cale x 5 cali nachylone pod kątem około 22 ° umieszczone w lewym dolnym rogu zbiornika19. Ilościowe zachowania obejmują całkowitą ilość czasu spędzonego przez rybę docelową na interakcji z lustrem20, wraz z określonymi wskaźnikami agresywności – liczbą ugryzień, wyświetlaczami bocznymi, strzałkami między badaną rybą a jej odbiciem. W przypadku tych konkretnych wskaźników ugryzienia definiuje się jako szybkie wypady w kierunku lustra z otwartymi ustami, pokazy boczne definiuje się jako rozszerzanie płetw bocznych, piersiowych, odbytowych i grzbietowych w kierunku lustra, a strzałki to wszelkie nieregularne ruchy, które nie są skierowane w stronę lustra. Wreszcie, test płycizny określa ilościowo zachowanie badanej ryby w środkowej komorze trzykomorowego zbiornika. Boczne komory zbiornika są albo puste, albo zawierają "docelową ławicę" ryb, a czas, jaki badana ryba spędza w pobliżu każdej bocznej komory, jest mierzonyw godzinach 21-23. Pojedynczy wynik złożony, określany jako Strength of Shoaling (SoS), jest obliczany dla każdej badanej ryby, specyficzny dla bodźców, i może być wykorzystany w dalszych analizach14. Wszystkie zachowania są oceniane przez jednego widza lub wielu widzów za pomocą bezpłatnego oprogramowania do kwantyfikacji behawioralnej znanego jako JWatcher24.

Testowanie obecności zespołu behawioralnego jest przede wszystkim przedsięwzięciem statystycznym i zaleca się przestrzeganie wytycznych przedstawionych przez Budeav 201025. W szczególności zaleca się przeprowadzenie analizy głównych składowych (PCA) na wyśrodkowanych i znormalizowanych danych, w których dane wejściowe są wektorami zachowań jednostki w testach z wieloma pomiarami behawioralnymi (tj. śmiałość i agresja). PCA, wykonywany na macierzy korelacji, zmniejsza wymiarowość pomiarów behawioralnych, a tym samym wydobywa najważniejszą wiedzę, która wyjaśnia większość zmienności. Wyodrębnione komponenty mogą być następnie interpretowane na podstawie wysokich ładunków czynnikowych dla indywidualnego zachowania będącego przedmiotem zainteresowania, a wyniki regresji można wyodrębnić dla każdej osoby na podstawie składników objaśniających. Te wyniki regresji można następnie porównać z pomiarem SoS i innymi różnymi pomiarami niebehawioralnymi, takimi jak wielkość ryb lub płeć.

Ten przepływ pracy został zaimplementowany w badaniu zespołów behawioralnych danio pręgowanego, w którym odkryto specyficzny dla płci zespół behawioralny, który istnieje między śmiałością a ławicą14. W tej sytuacji odważniejsze samce danio pręgowanego są bardziej skłonne do kojarzenia się z większym, bardziej agresywnym gatunkiem (D. albolineatus), ale ten związek zanika u samic. Ten przebieg pracy został również zaimplementowany w badaniu młodocianych krewnych pielęgnic skazańców (Amatitlania nigrofasciata)18, w którym nie wykryto zespołu behawioralnego, co potencjalnie wskazuje na plastyczność behawioralną gatunku. W związku z tym przedstawiono poniższy protokół w celu nakreślenia charakteru trzech specyficznych testów (śmiałość, agresja i płycizna) w ramach badania zespołu behawioralnego na poziomie indywidualnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące metodologie dotyczące hodowli, opieki i badania ryb zebry zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Świętego Józefa.

1. Pomieszczenia i pielęgnacja danio pręgowanego

  1. Pozyskaj przedmiotowego danio pręgowanego od lokalnego dostawcy lub z dzikich populacji. Należy pamiętać, że trzymanie danio pręgowanego podlega wytycznym IACUC, a w przypadku trzymania dzikich populacji wymagane są dodatkowe zezwolenia.
  2. Zidentyfikuj i oddziel danio pręgowanego według płci. Alternatywnie pomiń ten krok lub zastąp go inną metodą separacji opartą na hipotezie badania.
    UWAGA: Cechy płciowe są trudne do określenia u danio pręgowanego, szczególnie u samic. Zapoznaj się z tymi wskazówkami10 lub przydatnymi podręcznikami online, aby odróżnić seks.
  3. Losowo rozdziel populacje dalej w odpowiedni stosunek ryb ogniskowych do ryb bodźców. Uwaga: Ryby ogniskowe są obiektami testowymi, które są poddawane serii testów behawioralnych, a ryby bodźcowe to osoby, które będą zajmować komory bodźców w testach agresji i ławicowania.
    UWAGA: Tradycyjnie, od 1 do 5 ryb bodźcowych na rybę ogniskową w testach ławicy i stosunek bodźca do ogniska 1:1 w testach agresji14,17. Jednak badacz musi specjalnie zaprojektować badanie z myślą o hipotezie (tj. czy ryby bodźcowe powinny być utrzymywane na stałym poziomie, aby utrzymać spójność w ogniskowym zachowaniu ryb, czy też ryby bodźcowe powinny być rotowane między każdym testem, aby zapewnić właściwą randomizację).
  4. Przechowuj wszystkie ryby w regałach na danio pręgowanego (27,5-28,5 °C) w ścisłym cyklu 12:12 światło/ciemność. Codziennie podawaj wszystkie pokarmy w płatkach dla ryb ogniskowych i bodźcowych, a krewetki solankowe co tydzień, w dni wolne od badań.
  5. Upewnij się, że wszystkie testy są wykonywane między ZT1 a ZT5 (czas zeitgeber), aby uniknąć wpływu rytmu okołodobowego26.

2. Losowość i konfiguracja czołgu

  1. Losowo przydzielaj wszystkie osoby a priori do określonej sekwencji testów behawioralnych. Skonfiguruj spójny schemat randomizacji za pomocą internetowego generatora sekwencji losowych27 lub generatora sekwencji losowych z pakietu oprogramowania statystycznego (R).
    1. Oznacz każdy test od 1 do 3 i zachowaj spójność tego przypisania. Przypisz losową sekwencję do każdej osoby i zmapuj sekwencję zgodnie z etykietą testu behawioralnego. Na przykład dla trzech testów ogółem (1 zmapowany na Shoaling, 2 zmapowane na Śmiałość i 3 zmapowane na Agresję) dana osoba może mieć losową sekwencję "2,3,1", która będzie wymagała od niej wykonania określonych testów behawioralnych w określonej kolejności.
  2. Ustaw zbiorniki testowe (śmiałość, agresja i płycizna) w laboratorium w miejscach, które minimalizują możliwość wystąpienia niepożądanych bodźców zewnętrznych i upewnij się, że masz wystarczająco dużo miejsca na kamerę wideo, aby uchwycić cały zbiornik. Upewnij się, że kamera jest wystarczająco wyraźna, aby wyświetlić etykiety zbiorników, a także być w stanie rozróżnić subtelne zachowania ryb ogniskowych i ustawić kamerę w tej pozycji.
  3. Rejestruj wszystkie testy behawioralne za pomocą kamery umieszczonej w tej samej pozycji z pełnym widokiem określonego zbiornika, aby zminimalizować niezamierzone różnice w punktacji behawioralnej w wyniku nagrań różnicowych.
    UWAGA: Unikaj umieszczania zbiorników w miejscach o dużym natężeniu ruchu i przy drzwiach, ponieważ ruch i dźwięk wpłyną na zachowanie danio pręgowanego.
  4. Ustal unikalne protokoły JWatcher24 do oceny każdego testu behawioralnego. Zapoznaj się z podręcznikiem JWatcher, aby dowiedzieć się, jak tworzyć ogniskowe dane główne w celu przypisywania zachowań do naciśnięć i plików analizy ogniskowej w celu podsumowania zebranych danych.
    UWAGA: JWatcher to oprogramowanie do oceny behawioralnej, które pozwala na niezawodną i powtarzalną, dostosowaną ocenę behawioralną24.
  5. Zdefiniuj schemat etykietowania, aby śledzić datę, liczbę ryb i numer testu dla wszystkich testów behawioralnych (np. "F5-B-123115" oznaczający Fish 5, test pogrubienia, w dniu 31 grudnia 2015r.) i oznacz zewnętrzną część zbiornika taśmą w polu widzenia i ostrości kamery. Przechowuj i zapisuj te informacje w notatniku laboratoryjnym, aby mieć do nich szybki dostęp i przyszłą kontrolę jakości.
  6. Skonfiguruj zbiornik aklimatacyjny, który będzie używany między wszystkimi testami, a także bezpośrednio po wyjęciu osób z szafy mieszkaniowej.
    UWAGA: Zbiorniki aklimatyzacyjne i zbiorniki końcowe to małe akwaria (40 cm x 20 cm x 25 cm) ze żwirem i filtrem, które bardzo przypominają stojak na obudowę.
  7. Po zakończeniu wszystkich testów przenieś osobę do oddzielnego zbiornika terminalowego, który będzie służył jako zbiornik docelowy dla wszystkich używanych osobników ogniskowych. Użyj zbiornika, który jest wystarczająco duży, aby pomieścić grupę osobników do końca ich życia (np. 25 galonów).
    UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie stałych i podobnych temperatur i warunków wody we wszystkich zbiornikach. Obejmuje to obudowę, aklimatyzację i wszystkie zbiorniki testowe.

3. Przeprowadzanie testu agresji

  1. Przeprowadź test agresji w prostokątnym zbiorniku o pojemności 19 l o wymiarach 30 cm x 15 cm x 10 cm. Wyposaż zbiornik w zewnętrzne nieprzezroczyste przegrody otaczające trzy strony zbiornika agresji, pozostawiając przód odsłonięty do oglądania, aby zredukować niepożądane bodźce zewnętrzne. Podziel zbiornik z zewnętrznymi oznaczeniami na cztery równe prostokątne ćwiartki i zamocuj lustro na stałe (z silikonową uszczelką) w lewym dolnym kwadrancie, nachylonym pod kątem 22.5°, tworząc trójkąt prostokątny względem lewej strony zbiornika.
  2. Upewnij się, że temperatura wody w zbiorniku aklimatyzacyjnym i zbiorniku agresji mieści się w zakresie 2 °C od stelaża obudowy. W tym celu należy przygotować świeżą, dojrzałą wodę podgrzaną do temperatury 27,5-28,5 °C, którą można dodać do zbiornika z agresją. Należy pamiętać, że ważne jest, aby wymieniać wodę między każdym testem, aby wyeliminować nieuzasadnione sygnały węchowe.
  3. Przenieś, poprzez stawianie baniek, ryby ogniskowej ze stojaka do oddzielnego zbiornika aklimatyzacyjnego, gdzie będzie się aklimatyzować przez 10 minut.
    UWAGA: Ważne jest, aby zmniejszyć bodziec wprowadzany do ryb przez niewłaściwe obchodzenie się. Przekazywanie osób w sposób opisany wcześniej27.
    1. W szczególności ręcznie i ostrożnie umieść mały, przezroczysty plastikowy kubek w interesującym Cię zbiorniku. Nie zakłócając pracy ryby, tak bardzo, jak przenosząc ją za pomocą siatki, powoli nabieraj rybę do kubka.
  4. Upewnij się, że kamera wideo jest gotowa do nagrywania, potwierdzając, że zbiornik do oznaczania agresji (patrz krok 3.1) jest ostry i bezpośrednio przed przeniesieniem osoby do zbiornika agresji naciśnij przycisk nagrywania na urządzeniu. Przenieś rybę ogniskową przez stawianie baniek ze zbiornika aklimatyzacyjnego do zbiornika agresji.
    UWAGA: Ważne jest, aby nagrywać przed wejściem ryb do zbiornika agresji, aby śledzić dokładny czas wejścia.
  5. Nagrywaj zbiornik agresji przez 10 minut i 30 sekund, a następnie umieść ogniskową rybę ze zbiornika agresji z powrotem do zbiornika aklimatyzacyjnego.
  6. Oglądając nagranie, odczekaj 30 sekund po wprowadzeniu ryby do zbiornika jako dodatkowy okres aklimatyzacji przed oceną zachowań.
  7. Korzystając z systemu punktacji JWatcher zdefiniowanego dla zachowań agresywnych, określ ilościowo następujące zachowania przez 10 minut: czas spędzony w pobliżu lustra, liczba podejść do lustra, liczba rzutek, liczba prób ugryzienia (otwarcie ust w kierunku lustra) i liczba wyświetleń bocznych (erekcja płetwy grzbietowej, piersiowej, odbytowej i ogonowej)9.
  8. Oceniaj pojedynczy test agresji co najmniej dwa razy, aż test zostanie oceniony z dużą zgodnością między iteracjami.

4. Przeprowadzanie testu śmiałości

  1. Przeprowadź test pogrubienia w małym zbiorniku trapezowym o pojemności 1,5 litra o wymiarach 15 cm wysokości x 26,5 cm u góry x 22,5 cm u dołu x 6 cm szerokości. Owiń nieprzezroczysty papier ze wszystkich stron zbiornika, ale pozostaw przód odsłonięty do view. Umieść pojedynczy, cienki kawałek taśmy na zewnątrz zbiornika, aby oddzielić górną część od dolnej części zbiornika.
  2. Upewnij się, że temperatura wody w zbiorniku śmiałości mieści się w zakresie 2 °C od stelaża obudowy (patrz krok 3.2)
  3. Przenieść ogniskową rybę ze stojaka do zbiornika aklimatyzacyjnego (patrz krok 3.3) i pozostawić do aklimatyzacji na 10 minut.
  4. Upewnij się, że kamera jest gotowa do nagrania testu pogrubienia, a gdy będzie gotowa do przeniesienia ogniskowej ryby, naciśnij przycisk nagrywania na urządzeniu. Przenieś ogniskową rybę ze zbiornika aklimatyzacyjnego do zbiornika śmiałości i nagrywaj przez 8 minut i 30 sekund.
  5. Oglądając nagranie, należy odczekać dodatkowe 30 sekund okresu aklimatyzacji po wprowadzeniu ryby do zbiornika przed zdobyciem punktów.
  6. Korzystając z oprogramowania JWatcher, określ ilościowo zachowania śmiałości przez 8 minut. W szczególności określ ilościowo następujące zachowania: czas w pobliżu powierzchni, opóźnienie wejścia w górną część, liczbę przejść do górnej części i liczbę nieregularnych ruchów (rzutek)29.
  7. Oceń pojedynczy test pogrubienia co najmniej dwa razy, aż test zostanie oceniony z dużą zgodnością między iteracjami.

5. Przeprowadzanie testu na mieliźnie

  1. Przeprowadź test płycizny w zbiorniku o pojemności 76 litrów, który ma trzy komory przedzielone dwiema szklanymi przegrodami uszczelnionymi silikonową uszczelką (powstałe trzy komory składają się z dwóch stref bodźca i jednej komory ogniskowej). Zewnętrznie zaznacz dwie strefy preferencji wyznaczone w odległości 6,35 cm od szklanej przegrody każdej ze stref bodźców, wskazujące na dwie długości ciała30. Zastosuj nieprzezroczyste przegrody na zewnątrz wokół trzech stron zbiornika ławicy, ale pozostaw przód odsłonięty do oglądania.
    UWAGA: Tę strefę preferencji można dostosować, aby przetestować określone hipotezy dla gatunków o różnych rozmiarach.
  2. W zależności od charakteru badania, wybierz ławice bodźców, aby zaaklimatyzowały się przez co najmniej 12 godzin przed badaniem i pozostały w zbiorniku płycizny przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Ławice bodźcowe to zbiory pojedynczych ryb, które służą do oceny, jak ryba ogniskowa zachowuje się w obecności lub braku tych ławic. Można wybrać różne kombinacje płycizny bodźców, aby przetestować szereg różnych hipotez dotyczących mielizny. Upewnij się, że ławice bodźców są obracane między każdą strefą bodźca, aby uniknąć stronniczości bocznej, a także mogą się zaaklimatyzować przez co najmniej 12 godzin przed badaniem.
  3. Przenieść ogniskową rybę do zbiornika aklimatycznego, jak opisano wcześniej (patrz krok 3.3)
  4. Przenieść, poprzez stawianie baniek, ryb ogniskowych ze zbiornika aklimatyzacji do centralnego przedziału w zbiorniku ławicowym.
  5. Pozwól na 10-minutowy okres aklimatyzacji przed 10-minutowym okresem obserwacji na żywo. Alternatywnie, nagraj testy płycizny i oceń później za pomocą JWatcher. Ryby określa się jako ławicowe, gdy znajdują się w strefie preferencji w komorze, w której znajduje się docelowa ławica.
  6. Określ ilościowo czas spędzony w każdej strefie preferencji i czas spędzony w środkowej objętości.
  7. Jako dodatkową miarę opisową należy obliczyć "siłę mielizny" (SoS). Przypisz wartość z zakresu od -1 do +1, gdzie wielkość opisuje, jak często pojedyncza ryba pływa
    8. .
  8. Oblicz stosunek czasu spędzonego na mieliźnie podzielony przez obszar stref płycizny i odejmij stosunek czasu spędzonego bez mielizny do powierzchni stref niemieliznowych. Umieść tę ilość na sumie czasu spędzonego w każdej strefie podzielonej przez objętość każdej strefy z osobna. Więcej informacji na temat tego obliczenia można znaleźć w poprzednim badaniu14.

6. Kontrola jakości danych

  1. Analizuj dane przy użyciu tradycyjnych narzędzi do analizy danych31-32.
  2. Przetestuj jednorodność wariancji za pomocą nieparametrycznego testu Levene'a dla wszystkich zachowań. Jeśli zachowanie jest niejednorodne, wykonaj transformację logarytmiczną33.
  3. Upewnij się, że nie ma efektów sekwencji (tj. że kolejność randomizacji nie wpłynęła na zachowanie osób) za pomocą ANOVA Kruskala-Wallisa na jednorodnych danych34.
  4. Upewnij się, że nie ma odchyleń bocznych w teście płycizny, tworząc jednowymiarowe ogólne modele liniowe na indeksach SoS z boku jako stałym czynnikiem35,
    UWAGA: Jeśli nie ma żadnych problemów z danymi, można przeprowadzić dalsze analizy. Jeśli wystąpią problemy, pogodz się z dodatkowymi transformacjami, zracjonalizuj za pomocą biologicznie prawdopodobnych wyjaśnień i/lub zwiększ wielkość próby.

7. Analizuj dane

  1. Oblicz dwustronne korelacje rang Spearmana36 dla wszystkich zachowań osobno w testach śmiałości i agresji.
  2. Oblicz współczynniki korelacji wewnątrzklasowej (ICC) jako dwukierunkowy model mieszany ze spójnością dla testów behawioralnych, które zostały przeprowadzone więcej niż jeden raz dla danej osoby36. W tym kontekście ICC jest miarą tego, jak konsekwentnie ryba zachowywała się w danym teście, mierzonym więcej niż jeden raz.
  3. Wstępnie przeprojektuj śmiałość i agresywne zachowania, centrując i normując wszystkie zachowania, aby przygotować się do danych wejściowych do analizy głównych składowych (PCA)25.
    UWAGA: Wstępne przetwarzanie pomiarów poprzez centrowanie i normowanie jest niezbędnym krokiem. Bez tego kroku wstępnego przetwarzania zachowania, które występują z większą częstotliwością i bardziej zmiennie, będą nadmiernie wpływać na interpretacje wyodrębnionych składników. Proces centrowania i normowania usunie to uprzedzenie.
  4. Wykonaj PCA z macierzą korelacji, aby określić, czy śmiałość i agresja są ze sobą powiązane jako zespół behawioralny. Interpretuj ładunki behawioralne każdego składnika istotnego na poziomie >0,6. Zobacz Budaev 201024, aby zapoznać się z obszernym przewodnikiem dotyczącym zgłaszania PCA w badaniach behawioralnych. Wykres piargowy będzie zawierał informacje o tym, które wektory własne należy zachować do interpretacji.
  5. Korzystając z pakietu oprogramowania statystycznego, takiego jak R lub SPSS31,32, wyodrębnij wyniki dla każdego komponentu dla każdej osoby. Wyniki reprezentują, w jakim stopniu zachowanie danej osoby można wyjaśnić za pomocą konkretnego komponentu.
  6. Obliczać Korelacje rang Spearmana między wynikami regresji czynnikowej a siłą mielizny36.
    UWAGA: Uważa się, że syndrom behawioralny występuje, jeśli zachowania śmiałości i agresji obciążają ten sam komponent lub jeśli którykolwiek składnik o znaczących, możliwych do zinterpretowania obciążeniach koreluje z siłą płycizny. Należy również pamiętać, że siła mielizny nie jest uwzględniona w PCA, aby umożliwić lepszą interpretację bardziej złożonych kwantyfikacji behawioralnych (śmiałość i agresja). PCA będzie ortogonalnie zwijać cechy pogrubienia i agresji do wektorów własnych, aby zmaksymalizować ilość wyjaśnianej zmienności i dobrze nadaje się do tych złożonych pomiarów. Interpretacja otrzymanych wektorów własnych i regresja naszych pomiarów siły ławicy na każdym z nich daje znacznie bardziej intuicyjną interpretację tego, jak każde ze złożonych zachowań (śmiałość i agresja) odnosi się do bardziej dobrze zdefiniowanego binarnego pomiaru mielizny (tj. ryba
    7. płyci lub nie mielizny).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zależności od charakteru badania i konkretnego zastosowanego protokołu, możliwe jest uzyskanie kilku różnych wyników w eksperymencie z zespołami behawioralnymi. Poniższe tabele i ryciny, tam, gdzie są wskazane, są zaczerpnięte z naszego poprzedniego badania opublikowanego w czasopiśmie Behavioural Processes14 i czasopiśmie Zebrafish17. Gdy propozycja (jak opisano powyżej) jest realizowana w całości, oczekuje się dwóch zestawów wyników: "w ramach korelacji testu" i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół określi, czy istnieją spójne powiązania w śmiałości, agresji i zachowaniach ławicowych u danio pręgowanego. Jeśli w danej populacji istnieją spójne powiązania między którymkolwiek z tych zachowań, oznacza to, że występuje syndrom behawioralny. Badając naturalny syndrom behawioralny populacji, naukowcy mogą uzyskać pełniejsze zrozumienie jej dynamiki behawioralnej, struktury populacji i być może historii ewolucyjnej. Co więcej, manipulowanie środowiskiem, które wpływa na te zespoły behawioralne, jak w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy (GW i SPM) nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant edukacyjny Instytutu Medycznego Howarda Hughesa oraz wewnętrzny grant z oddziału Sigma Xi na Uniwersytecie Świętego Józefa. Chcielibyśmy również podziękować trzem anonimowym recenzentom, którzy przyczynili się do udoskonalenia protokołu i interpretacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System stojaków na rybki zebryAquaneering IncKat. # ZS550
Pet Valu Karma dla ryb tropikalnych, 224.0 gPet ValuCat. # 31700
Jaja krewetek solankowych klasy premium, 16 uncjiKrewetki solankowe Direct
1.5 L Zbiornik trapezowyPentair Ekosystemy wodneKat. # itsts-a
prostokątny zbiornikTo miejsceryb
Prostokątny zbiornik o pojemności 76 lThat Fish Place212180
Hitachi KP-D20A Kamera CCDPrescott's, Inc.
Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s Obiektyw MAKRONikon Corporation
ArtMinds Lustro kwadratowe, pakiet promocyjny 3" x 3"Michaels Cat. # 10334162
Jwatcher
SPSS Statistics BaseIBM
RThe R Foundation
19-litrowy 211932

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
  2. Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
  3. Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
  4. Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
  5. Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
  6. Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
  7. Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
  8. Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90(2010).
  9. Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
  10. Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
  11. Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
  12. Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
  13. Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
  14. Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
  15. Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
  16. Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
  17. Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
  18. Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
  19. Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
  20. Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
  21. McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
  22. Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
  23. Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
  24. Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
  25. Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
  26. Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
  27. Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
  28. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  29. Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
  30. Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
  31. IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
  32. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
  33. Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
  34. Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
  35. Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M. Generalized Linear Models. J Roy Stat Soc A Sta. 135, 370-384 (1972).
  36. Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
  37. Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
  38. Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
  39. Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
  40. Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
  41. Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
  42. Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
  43. Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
  44. Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
  45. Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test mia o ciTest agresjiTest awicowaniaAnaliza behawioralnaNagrywanie wideoZbiornik aklimatyzacyjnyKontrola temperaturyB d obserwatoraProtok do wiadczalny

Powiązane artykuły