Tworzenie gigantycznych rozmiarów polimeromów za pomocą ponownego uwodnienia wspomaganego żelem

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół szybkiego tworzenia gigantycznych pęcherzyków polimerowych (pGV). Krótko mówiąc, roztwory polimerów są odwadniane na wysuszonych foliach agarozowych przyklejonych do szkiełek nakrywkowych. Rehydratacja folii polimerowych powoduje szybkie tworzenie się pGV. Metoda ta znacznie przyspiesza przygotowanie syntetycznych pęcherzyków olbrzymich do bezpośredniego zastosowania w badaniach biomimetycznych.

Streszczenie

Pęcherzyki polimerowe, lub polimersomy, są szeroko badane jako syntetyczne analogi pęcherzyków lipidowych w oparciu o ich stabilność, wytrzymałość, właściwości barierowe, wszechstronność chemiczną i przestrajalne cechy fizyczne. Typowe metody stosowane do przygotowania gigantycznych rozmiarów (> 4 μm) pęcherzyków są jednak zarówno czasochłonne, jak i pracochłonne, dając niewielką liczbę nienaruszonych polimeromów. Tutaj po raz pierwszy prezentujemy zastosowanie rehydratacji wspomaganej żelem do szybkiego i wysokowydajnego tworzenia gigantycznych (>4 μm) pęcherzyków polimerowych (polimeromów). Korzystając z tej metody, polimeromy mogą być tworzone z szerokiej gamy roztworów rehydratacyjnych, w tym kilku różnych fizjologicznie kompatybilnych i pełnych pożywek do hodowli komórkowych, co czyni je łatwo przydatnymi do badań biomimikry. Technika ta jest również w stanie niezawodnie wytwarzać polimerosomy z różnych kompozycji polimerowych ze znacznie lepszą wydajnością i znacznie mniejszym trudem niż tradycyjne metody. Wielkość polimeromu można łatwo dostosować poprzez zmianę temperatury podczas ponownego uwodnienia lub dodanie płynizatorów membranowych do membrany polimerowej, generując polimeromy o gigantycznych rozmiarach (>100 μm).

Wprowadzenie

Tworzenie syntetycznych, gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) wielkości komórki budzi coraz większe zainteresowanie rekonstrukcją in vitro różnych procesów komórkowych w celu zbudowania ram dla generowania sztucznego systemu podobnego do komórki^1,2. Podczas gdy GUV złożone z błon lipidowych są doskonałymi naśladowcami naturalnych, biologicznych błon, są niestabilne na wahania środowiskowe i mają dość krótki okres przydatności do spożycia. Ze względu na te ograniczenia, amfifilowe kopolimery blokowe były używane jako mimiki lipidów do tworzenia pęcherzyków polimerowych lub polimeromów. W tym kontekście polimeromy są korzystne w rozwoju biomimetycznych systemów komórkowych ze względu na ich zwiększoną stabilność³, wszechstronność chemiczną^4,5 i modyfikowalne cechy fizyczne ^6-8.

Obecne metody tworzenia gigantycznych polimeromów obejmują elektroformację⁹ i szablonowe uwodnienie¹⁰, które są czasochłonne, pracochłonne, wymagają specjalistycznego sprzętu i dają niskie plony nienaruszonych gigantycznych polimeromów. Niedawno opracowano prostą metodę nawadniania wspomaganego żelem do produkcji lipidów GUVs¹¹. W tym miejscu opisujemy adaptację techniki rehydratacji wspomaganej żelem do tworzenia gigantycznych polimeromów o różnym składzie polimerowym, kontrolowanym rozmiarze i w różnych składach buforowych.

Krótko mówiąc, 1% w/v standardowych folii agarozowych z elektroforezy żelowej DNA jest odwodnionych na szklanym szkiełku nakrywkowym. Roztwory polimerów przygotowane w chloroformie rozprowadza się następnie po odwodnionej warstwie agarozy i pozostawia do odparowania. Po całkowitym usunięciu rozpuszczalnika, folie polimerowe są ponownie uwodniane w wybranym buforze z umiarkowanym ogrzewaniem (40-70 °C) i w ciągu 30 minut powstają polimeromy o gigantycznych rozmiarach (>4 μm). Metoda ta szybko wytwarza setki w pełni nienaruszonych, dobrze uformowanych polimeromów przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników przy minimalnych kosztach.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający metodę nawadniania wspomaganego żelem. Gigantyczne polimeromy złożone z kopolimeru diblokowego powstają po ~30 minutach ponownego uwodnienia. Blok hydrofilowy jest oznaczony w kolorze magenta, a blok hydrofobowy jest oznaczony kolorem zielonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Preparat polimerowy i agarozowy

Uwaga: Rękawice i fartuch laboratoryjny powinny być noszone przez cały czas trwania tego protokołu. Okulary ochronne są również wymagane podczas pracy z dowolnym rozpuszczalnikiem organicznym lub na każdym etapie, na którym możliwe jest rozpryskiwanie.

1. Przygotować roztwór polimeru w chloroformie o stężeniu 5 mg/ml. Dodać 1 ml chloroformu do 5 mg stałego kopolimeru diblokowego poli(tlenku etylenu)-b-poli(butadienu) (PEO-PBD, EO_{22-BD 37}) w szklanej fiolce i zamieszać do całkowitego rozpuszczenia. Wykonaj wszystkie kroki przy użyciu chloroformu w dygestoriach chemicznych.
2. Zmieszać z fluorescencyjnie znakowanym lipidem (zakupionym już rozpuszczonym w chloroformie) o końcowym stężeniu 0,5 mol w 99,5 % nieznakowanym polimerze.
   1. Na przykład odpipetować ~12 μl 1 mg/ml fluorescencyjnie znakowanego lipidu w chloroformie do 997,58 μl polimeru PEO-PBD, EO_{22-BD 37} w chloroformie (o masie cząsteczkowej 2,950 daltonów) dla końcowego stężenia 0,5 % znakowanego mieszaniny lipidów i 99,5% mol % polimeru.
   2. Roztwór należy przechowywać w hermetycznej fiolce z pokrywką odporną na chloroform, w temperaturze -20 °C. Owinąć taśmę hydrauliczną na krawędzi fiolki w miejscu, w którym pokrywka przykręca się do fiolki i zabezpieczyć pokrywkę fiolki. Owiń kolejny kawałek taśmy hydraulicznej na zewnątrz pokrywy, a na koniec owiń Parafilm na zewnątrz taśmy, aby zapewnić minimalne parowanie.
3. Przygotować 1% m/v roztwór agarozy, mieszając 0,5 mg wzorcowej agarozy z 50 ml wody (lub 50 ml 100 mM sacharozy) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Gotuj roztwór agarozy w standardowej kuchence mikrofalowej przez ~ 1 minutę (lub do całkowitego rozpuszczenia, jak zaznaczono po klarowaniu roztworu).
   Uwaga: Roztwór agarozy można zużyć po kilku minutach chłodzenia lub pozostawić do zestalenia, przechowywać i ponownie stopić przy użyciu tej samej procedury.

2. Przygotowanie filmu z agarozy

1. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby zapobiec zatkaniu. Za pomocą odciętej końcówki odpipetować 300 μl roztopionego roztworu agarozy na szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm bezpośrednio od producenta.
2. Pozostawić agarozę do ostygnięcia do ~65-75 °C przed osadzeniem. Jeśli agaroza jest zbyt chłodna, zacznie zbrylać się na powierzchni podczas procesu rozprowadzania. I odwrotnie, jeśli agaroza jest zbyt gorąca, będzie wymagała większego rozprowadzenia, aby przylgnąć agarozy do powierzchni.
3. Przytrzymaj tylko krawędź szkiełka nakrywkowego palcami w rękawicach i użyj dłuższej krawędzi kolejnej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby równomiernie rozprowadzić agarozę na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Przesuwaj końcówkę pipety w przód i w tył po szkiełku nakrywkowym, aż agaroza całkowicie przylgnie do szkiełka nakrywkowego i go zakryje.
4. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą na kawałku Parafilmu agarozą skierowaną do góry. Po pokryciu żądanej liczby szkiełek nakrywkowych umieść Parafilm z szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu odwodnienia agarozy na powierzchni przez co najmniej 1 godzinę.
   Uwaga: Odwodnienie określa się przez zanik widocznej warstwy agarozy; Szkiełko nakrywkowe powinno wyglądać na płaskie i przezroczyste. Gdy folie są całkowicie odwodnione, przechowuj szkiełka nakrywkowe powierzchnią agarozy skierowaną do góry na jednorazowej plastikowej szalce Petriego.

3. Tworzenie filmu polimerowego

1. Odpipetować 30 μl przygotowanego roztworu polimeru na folię agarozową.
2. Palcami w rękawiczkach przytrzymać tylko krawędź szkiełka nakrywkowego i za pomocą długiej krawędzi igły 18 G rozprowadzić roztwór na błonach agarozy, wykonując okrężne ruchy rozprowadzania. Kontynuuj rozprowadzanie, aż roztwór odparuje.
   Uwaga: Uważaj na ostry koniec igły.
3. Umieść folie polimerowe w plastikowej szalce Petriego polimerową stroną skierowaną do góry i umieść szalkę Petriego w standardowym domowym eksykatorze próżniowym pokrytym folią aluminiową (aby zapobiec fotowybielaniu oznakowanego lipidu) na co najmniej 1 godzinę, aby całkowicie usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika.

4. Tworzenie polimeromów

1. Przyklej pokrywę, albo domową studzienkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) (blok utwardzonego PDMS o grubości ~0,5 cm z wyciętym środkiem), albo dostępną w handlu studzienkę do szkiełka nakrywkowego pokrytego folią polimerową. Delikatnie dociśnij pokrywę do szkiełka nakrywkowego pokrytego polimerem, tak aby polimer był skierowany do góry, aż powstanie szczelne uszczelnienie między pokrywą a szkiełkiem nakrywkowym. Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno i nie złamać szkiełka nakrywkowego.
2. Dodaj 200-500 μl roztworu do rehydratacji (woda jest w porządku, ale działa również szereg lub pożywek) do komory (objętość rehydratacji zależy od wielkości przyleganej pokrywy).
3. Utwórz komorę wilgotnościową, aby zmniejszyć parowanie roztworu nawadniającego. Umieść zwiniętą, mokrą chusteczkę Kimwipe wzdłuż krawędzi szklanej szalki Petriego. Umieść folię polimerową z przyklejoną pokrywą w komorze wilgotnościowej i przykryj pokrywką. Przykryj szalkę Petriego folią aluminiową, aby zminimalizować fotowybielanie. Umieścić szalkę Petriego na płycie grzejnej ustawionej na 40 °C na co najmniej 30 minut.
4. Dostosuj temperaturę płyty grzejnej podczas nawadniania w zakresie 24-70 °C, aby dostroić rozmiar utworzonych pęcherzyków (Rysunek 5). 70 °C jest bliskie T_m agarozy, dlatego należy zachować ostrożność podczas przekraczania tej temperatury.

5. Charakterystyka polimerosomów za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)

1. Przenieś szkiełko nakrywkowe z przyklejoną osłoną bezpośrednio do odwróconego mikroskopu w celu obrazowania.
2. Wybierz odpowiedni zestaw filtrów w oparciu o fluorescencyjny lipid zawarty w roztworze polimeru. W przypadku lipidów znakowanych rodaminą domieszkowanych roztworami polimerów należy użyć filtra wzbudzającego 560/25 nm i filtra emisyjnego 607/36 nm lub porównywalnych zestawów filtrów.
3. Użyj obiektywu olejowego 100X, aby skupić się na górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego, do której będą przylegać polimersomy. Jeśli polimeromy są szczególnie duże (>20 μm) lub jeśli warstwa polimerowa jest zbyt gruba, należy użyć obiektywu o mniejszej mocy (np. 40X), aby lepiej uwidocznić polimersomy.
4. Zidentyfikuj polimeromy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Polimeromy można rozpoznać po charakterystycznym pustym, kulistym pęcherzyku o średnicy >5 μm.
5. Scharakteryzuj płynność membrany za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) na mikroskopie fluorescencyjnym zawierającym regulowany kondensator. Ze względu na przylegający charakter i ścisłe upakowanie polimeromów na podłożach, naturalny ruch polimeromów jest ograniczony, co zwiększa jakość obrazowania FRAP.
   1. Skoncentruj mikroskop na interesującym Cię polimerze. Zamknij kondensator w małym obszarze i upewnij się, że krawędź polimerosomu znajduje się w obszarze obrazowania, który Cię
   interesuje.
   2. Zwiększ ekspozycję aparatu i upewnij się, że wszystkie filtry o neutralnej gęstości zostały usunięte, aby skutecznie fotowybielać obszar zainteresowania. Pozwól, aby intensywność fluorescencji membrany uległa fotowybielaniu przez 30-60 sekund lub do momentu, gdy intensywność fluorescencji znacznie się zmniejszy.
   3. Wyłącz lampę i całkowicie otwórz skraplacz. Zmniejsz ekspozycję z powrotem do ustawień początkowych i natychmiast rozpocznij robienie zdjęć co 30 sekund przez 3 minuty.
   4. Obliczyć współczynniki dyfuzji membrany przy użyciu standardowych metod¹². Jeśli wybielony obszar odzyska intensywność fluorescencji w ciągu 3-5 minut, oznacza to, że membrana jest płynna.

6. Charakterystyka wielkości polimerosomu

Rysunek 6. Proces analizy wielkości polimeromów przy użyciu oprogramowania do obrazowania. Instrukcje krok po kroku, jak zmierzyć średnicę powstałych pęcherzyków. Użytkownik musi znać jednostki kalibracyjne w pikselach/μm używanego mikroskopu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Otwórz uzyskane obrazy polimerosomów w oprogramowaniu do analizy obrazu¹³.
2. Ustaw skalę obrazu, klikając rozwijane pole analizy i klikając "ustaw skalę".
   1. Skalibruj skalę do mikroskopu przy użyciu standardowych metod (tj. mikrometru).
   2. Wypełnij jednostki kalibracyjne i kliknij "ok".
3. Kliknij przybornik linii i narysuj linię o średnicy pęcherzyka.
4. Zbierz pomiary długości, klikając rozwijane pole analizy i klikając "zmierz".
5. Kontynuuj pomiar poszczególnych pęcherzyków zgodnie z powyższą procedurą, a każdy nowy pomiar będzie dodawany do okna danych pomiarowych.
6. Naciśnij "Ctrl + D" po narysowaniu każdej linii i zmierzeniu długości, aby odcisnąć narysowaną linię na obrazie, co ułatwia śledzenie, które pęcherzyki zostały przeanalizowane.

Wyniki

Polimeromy zostały utworzone przy użyciu procedury opisanej powyżej (Rysunek 1) i wspólnego sprzętu laboratoryjnego pokazanego na Rysunku 2. Polimeromy ponownie uwodniono wodą dejonizowaną (ryc. 3) i zobrazowano na odwróconym mikroskopie w epifluorescencji przy użyciu 100-krotnego obiektywu olejowego. Należy pamiętać, że jeśli polimeromy nie są widoczne, mogły powstać w rozmiarach zbyt dużych, aby można je było uchwycić za pomocą obiektywu olejowego 100X; Zamiast tego może być konieczne użycie celu o niższej mocy. Jedną z zalet stosowania rehydratacji wspomaganej żelem jest wszechstronność tworzenia polimeromów w różnych roztworach do rehydratacji. Polimeromy z powodzeniem utworzono w wodzie dejonizowanej, pełnej pożywce do hodowli komórek ssaków, roztworach sacharozy i dwóch fizjologicznie istotnych roztworach buforowych (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) lub sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)), jak pokazano na rysunku 4. W standardowych warunkach (ponowne nawodnienie wodą o temperaturze 40 °C przez 1 godzinę) zwykle znajduje się więcej niż ~70 polimerosomów na pole widzenia 40 x 40^μm2. Chociaż produkcja powierzchniowa polimeromów nie jest jednorodna, istnieją dziesiątki pól widzenia z tą reprezentatywną wydajnością. Ponadto polimeromy były stabilne w roztworze przez co najmniej 24 godziny.

Rozmiar polimeromów można było łatwo dostosować poprzez ponowne nawodnienie folii polimerowych w różnych temperaturach. Polimeromy powstające w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej miały średnią średnicę 2,9 ± 0,7 μm. Wraz ze wzrostem temperatury podczas hydratacji zwiększa się również średnia wielkość polimeromów (tabela 1). W wysokich temperaturach (> 60 °C) tworzą się polimeromy o rozmiarach nawet większych niż 100 μm (ryc. 5).

Całe przetwarzanie obrazu zostało zakończone przy użyciu oprogramowania do obrazowania o otwartym kodzie źródłowym (Rysunek 6). Zebrane obrazy zostały otwarte w programie. Skalibrowany rozmiar piksela został wprowadzony w polu ustawionej skali. Za pomocą narzędzia Linia narysowano linie w poprzek średnic. Po narysowaniu każdej pojedynczej linii zmierzono skalibrowaną długość i dodano ją do pola wyników. Dane można następnie wykreślić w wybranym oprogramowaniu matematycznym (np. Excel, Prism, Origin itp.)

Rysunek 2. Obraz powszechnych i niedrogich materiałów laboratoryjnych wymaganych do tworzenia polimeromów. Wymagane elementy to: Parafilm, igła 18,5 G, polimer w chloroformie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku, końcówka do pipety 1 000 μl, kolba Erlenmeyera, pęseta, agaroza, kwadratowe szkiełka nakrywkowe 25 mm, studzienki obrazowe PDMS i szklana szalka Petriego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zdjęcia metody nawadniania wspomaganego żelem. Rozpuszczoną agarozę rozprowadza się na kwadratowym szkiełku nakrywkowym o średnicy 25 mm, aż równomierny film pokryje całe szkiełko nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe umieszcza się następnie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, a folię odwadnia się. Roztwór polimeru osadza się na odwodnionej folii agarozy i rozprowadza za pomocą igły ruchem okrężnym. Szkiełko nakrywkowe umieszcza się następnie w eksykatorze O/N w celu całkowitego odparowania wszelkich pozostałości rozpuszczalnika. Na koniec, komora obrazowania jest przyklejana do podłoża, a polimery są ponownie hydratelowane wybranym roztworem i umieszczane na szalce Petriego w temperaturze 40 °C na co najmniej 25 minut, aby umożliwić tworzenie polimeromów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Polimeromy mogą tworzyć się w wielu różnych. Folie polimerowe PEO-PBD ponownie uwodniono wskazanym buforem w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wzrost temperatury podczas hydratacji zwiększa rozmiar polimeromów. Reprezentatywne obrazy epifluorescencyjne polimeromów powstających w wodzie we wskazanych temperaturach hydratacji. Wzrost temperatury powoduje powstawanie większych polimeromów. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział Rozdział Rozdział

Temperatura (°C)	Średni rozmiar (μm)
24	2,93 ± 0,7
Rozdział 40	5,76 ± 2,5
50	6,65 ± 2,4
60	11,46 ± 5,8
70	14.04 ± 7.0

Tabela 1. Wzrost temperatury podczas nawodnienia powoduje zwiększenie rozmiaru polimeromu. Obliczono średnie średnice dla ponad 100 polimeromów w wodzie w różnych warunkach temperaturowych i przedstawiono je tutaj. Błąd to odchylenie standardowe.

Dyskusja

Polimeromy stają się szeroko badane jako biologiczne naśladownictwo błon. Wytrzymałe i wszechstronne właściwości polimerów sprawiają, że są one bardzo atrakcyjne w badaniach wymagających funkcjonalizacji membrany, długowieczności i dostrojonej responsywności. Tradycyjne metody formowania gigantycznych rozmiarów polimeromów^9,10 (>4 μm) są pracochłonne i wymagają drogiego i specjalistycznego sprzętu. Tutaj po raz pierwszy prezentujemy szybką, wszechstronną i solidną metodę formowania gigantycznych rozmiarów polimeromów przy użyciu standardowych niedrogich odczynników i sprzętu laboratoryjnego.

Stosując rehydratację wspomaganą żelem, polimerosomy jednowarstwowe mogą być formowane szybko (<30 min), w różnych roztworach do rehydratacji (w tym w pożywkach do hodowli komórkowych) i przy użyciu różnych polimerów (dane nie pokazane). Nie zaobserwowano tworzenia się pęcherzyków wielopłytkowych lub asymetrycznych przy użyciu tej techniki. W trakcie tych prac użyliśmy neutralnego kopolimeru diblokowego poli(tlenku etylenu)-b-poli(butadienu) (PEO-PBD, EO_{22-BD 37}). Wiele różnych kompozycji polimerowych (w tym naładowane kopolimery diblokowe) działa dobrze przy użyciu tej metody (nie pokazano). Jednak niektóre dostępne na rynku kopolimery triblokowe i kopolimery diblokowe o wyższej masie cząsteczkowej (~ >5,000 daltonów) nie tworzą odrębnych polimeromów. We wszystkich eksperymentach opisanych w tym manuskrypcie niskie stężenie znakowanego lipidu zostało domieszkowane do roztworów polimerowych wyłącznie w celach wizualizacyjnych. Można również zastosować inne metody wizualizacji, w tym polimery bezpośrednio funkcjonalizowane barwnikiem fluorescencyjnym. Polimeromy można również obrazować za pomocą mikroskopii jasnego pola, chociaż mikroskopia fluorescencyjna zapewnia większą rozdzielczość.

Większość drobnych modyfikacji protokołu zazwyczaj nie zmienia wyników. Na przykład niewielkie różnice w stężeniu roztworu polimeru rozprowadzonego na szkiełkach nakrywkowych nie wpływają na tworzenie się powstałego filmu polimerowego. Chociaż pełny zakres stężeń nie został określony, tworzenie się polimeromów będzie z powodzeniem zachodzić przy dużym zakresie stężeń filmu polimerowego (np. 1-10 mg/ml). Istnieją jednak pewne zmiany w protokole, które negatywnie wpływają na tworzenie polimeromów. Najbardziej godne uwagi jest to, że okrągłe szkiełka nakrywkowe (zamiast kwadratowych) powodują bardzo słabe tworzenie polimeromów. Przypisujemy to niezwykle równomiernej warstwie agarozy na szkle, która w rzeczywistości utrudnia tworzenie polimeromów.

Jednym z najbardziej znaczących wyzwań związanych z tą techniką jest możliwość odzyskania polimeromów z powierzchni z wysoką wydajnością. Istnieją pewne przypadki, w których usunięcie polimeromów z pierwotnej powierzchni może być korzystne. Ze względu na wysoką fluorescencję tła z odwodnionej warstwy polimerowej, usunięcie pojedynczych polimeromów i przyklejenie ich do czystych szkiełek nakrywkowych poprawi jakość obrazowania i charakterystykę (szczególnie podczas analizy FRAP). Aby to zrobić, delikatne pipetowanie końcówką pipety, w której koniec został odcięty, spowoduje desorbację polimeromów z powierzchni (chociaż liczba odzyskanych pęcherzyków jest znacznie mniejsza niż te pierwotnie utworzone). Polimeromy można następnie umieścić na zmodyfikowanych powierzchniach szkiełek nakrywkowych, umożliwiając polimerosom interakcję z nowym szkiełkiem nakrywkowym. Zazwyczaj w przypadku obojętnych polimeromów PEO-PBD szkiełka nakrywkowe poddawane działaniu ozonu przez 15 minut pozwalają polimeromom opaść na powierzchnię w celu zobrazowania. Dla różnych kompozycji polimerowych (np. polimerów naładowanych ujemnie lub dodatnio) wymagana jest różna modyfikacja powierzchni.

Większość materiałów używanych w tym protokole jest z powodzeniem przechowywana i używana przez dni lub tygodnie. Zestaloną agarozę można ponownie zagotować i ponownie użyć, aż agaroza zacznie mieć zagięcia nawet po ugotowaniu lub zestalona agaroza zacznie wysychać. Szkiełka nakrywkowe z wysuszonymi foliami agarozowymi mogą być przechowywane i używane przez czas nieokreślony (np. miesiące). Polimer rozpuszczony w chloroformie może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Jednak po wysuszeniu folii polimerowej na foliach agarozowych, folie muszą być przechowywane w próżni domowej i zużyte w ciągu dwóch tygodni (dłuższe przechowywanie nie zostało bezpośrednio określone, ale zauważalne są różnice w polimeromach utworzonych z folii polimerowych starszych niż dwa tygodnie).

Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu nawadniania wspomaganego żelem, setki polimeromów o jednolitym kształcie są formowane szybko po zaledwie kilku godzinach pracy przy użyciu standardowego sprzętu i niedrogich odczynników laboratoryjnych. Ponadto polimeromy mogą być tworzone w różnych fizjologicznych roztworach buforowych i z różnych kompozycji polimerowych (nie pokazano). Niewielkie zmiany w metodzie nie wpływają negatywnie na tworzenie polimeromów, co sprawia, że rehydratacja wspomagana żelem jest wszechstronną i dostępną techniką dla naukowców o różnej wiedzy technicznej.

Zdolność do łatwego tworzenia gigantycznych polimeromów w skali wielkości komórek jest niezbędna do budowy sztucznych systemów przypominających komórki. Łatwość użycia i wszechstronność nawadniania wspomaganego żelem w celu wytworzenia tych polimeromów stanowi ogromny postęp w dziedzinie biomimetyki w tworzeniu solidnych mimików błony komórkowej. Na przykład, korzystając z tej techniki, strategie enkapsulacji różnych składników wewnątrzkomórkowych, funkcjonalizacji polimeru białkami błony komórkowej i włączenia białek transportujących błonę, żeby wymienić tylko kilka, można zaprojektować w celu budowy sztucznych komórek na bazie polimeromów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolba Erlenmeyera 125 ml	VWR	89000-360
18-stopniowa igła	VWR	BD-305196
Szkiełka nakrywkowe kwadratowe 25 mm	VWR	48366-089
Agaroza	Sigma	A9539	Standardowa agaroza do elektroforezy żelowej DNA
Chloroform	Sigma	288306-2L
Osłona	handlowaMikroskopia elektronowa Nauki	70336	Izolatory silikonowe Press-to-Seal
Oprogramowanie do analizy obrazu Fidżi	ImageJ		Bezpłatne pobieranie: http://fiji.sc/Fiji
Szklana fiolka z teflonową pokrywką	VWR	66009-556	o pojemności 1,9 ml, opakowanie 144
Liss-rhodamine B PE Lipid	Avanti Polar Lipids	810150C	1 mg lipidu w stężeniu 1 mg/ml w chloroformie
Parafilm	VWR	52858-000	10,2 cm x 38,1 m
poli(tlenek etylenu)-b-poli(butadien) lub PEO-PBD (o masie cząsteczkowej 2,940)	Źródło polimeru	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
Pastic Petri Dish	VWR	25384-092
Taśma teflonowa	VWR	300001-057	1/2" szerokość