Przedstawiamy protokół szybkiego tworzenia gigantycznych pęcherzyków polimerowych (pGV). Krótko mówiąc, roztwory polimerów są odwadniane na wysuszonych foliach agarozowych przyklejonych do szkiełek nakrywkowych. Rehydratacja folii polimerowych powoduje szybkie tworzenie się pGV. Metoda ta znacznie przyspiesza przygotowanie syntetycznych pęcherzyków olbrzymich do bezpośredniego zastosowania w badaniach biomimetycznych.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie gigantycznych rozmiarów polimeromów za pomocą ponownego uwodnienia wspomaganego żelem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pęcherzyki polimerowe, lub polimersomy, są szeroko badane jako syntetyczne analogi pęcherzyków lipidowych w oparciu o ich stabilność, wytrzymałość, właściwości barierowe, wszechstronność chemiczną i przestrajalne cechy fizyczne. Typowe metody stosowane do przygotowania gigantycznych rozmiarów (> 4 μm) pęcherzyków są jednak zarówno czasochłonne, jak i pracochłonne, dając niewielką liczbę nienaruszonych polimeromów. Tutaj po raz pierwszy prezentujemy zastosowanie rehydratacji wspomaganej żelem do szybkiego i wysokowydajnego tworzenia gigantycznych (>4 μm) pęcherzyków polimerowych (polimeromów). Korzystając z tej metody, polimeromy mogą być tworzone z szerokiej gamy roztworów rehydratacyjnych, w tym kilku różnych fizjologicznie kompatybilnych i pełnych pożywek do hodowli komórkowych, co czyni je łatwo przydatnymi do badań biomimikry. Technika ta jest również w stanie niezawodnie wytwarzać polimerosomy z różnych kompozycji polimerowych ze znacznie lepszą wydajnością i znacznie mniejszym trudem niż tradycyjne metody. Wielkość polimeromu można łatwo dostosować poprzez zmianę temperatury podczas ponownego uwodnienia lub dodanie płynizatorów membranowych do membrany polimerowej, generując polimeromy o gigantycznych rozmiarach (>100 μm).
Wprowadzenie
Tworzenie syntetycznych, wielkich jednowarstwowych pęcherzyków (GUVs) o rozmiarach komórkowych budzi coraz większe zainteresowanie w kontekście rekonstrukcji różnych procesów komórkowych in vitro, co ma służyć budowie ram dla generowania sztucznego systemu przypominającego komórkę1,2. Chociaż GUVs składające się z błon lipidowych stanowią doskonałe mimetyki naturalnych błon biologicznych, są one niestabilne w obliczu wahań środowiskowych i mają dość krótki okres przydatności. Ze względu na te ograniczenia, amfifilowe kopolimery blokowe są wykorzystywane jako mimetyki lipidów do tworzenia pęcherzyków polimerowych, czyli polimerosomów. W tym kontekście polimerosomy są korzystne w rozwoju biomimetycznych systemów komórkowych ze względu na ich zwiększoną stabilność3, wszechstronność chemiczną4,5 oraz modyfikowalne cechy fizyczne6-8.
Obecne metody tworzenia polimerosomów o rozmiarach gigantycznych obejmują elektroformowanie9 oraz rehydratację matrycową10; obie te techniki są czasochłonne, pracochłonne, wymagają specjalistycznego sprzętu i dają niską wydajność nienaruszonych polimerosomów gigantycznych. Niedawno opracowano prostą metodę rehydratacji wspomaganej żelem do produkcji lipidowych GUV11. W niniejszej pracy opisujemy adaptację techniki rehydratacji wspomaganej żelem w celu tworzenia polimerosomów gigantycznych o różnym składzie polimerowym, kontrolowanym rozmiarze i w różnych składach buforów.
Krótko mówiąc, standardowe błony agarozowe do elektroforezy DNA o stężeniu 1% w/v są odwadniane na szklanym szkiełku nakrywkowym. Następnie roztwory polimerów przygotowane w chloroformie są rozprowadzane na odwodnionej błonie agarozowej i pozostawione do odparowania. Po całkowitym usunięciu rozpuszczalnika błony polimerowe są rehydratowane w wybranym buforze przy umiarkowanym ogrzewaniu (40-70 °C), co prowadzi do utworzenia gigantycznych polimerosomów (rozmiar >4 µm) w ciągu 30 min. Metoda ta pozwala na szybkie wytworzenie setek w pełni nienaruszonych, prawidłowo uformowanych polimerosomów przy użyciu standardowego sprzętu i odczynników laboratoryjnych przy minimalnych kosztach.
Rycina 1. Schemat przedstawiający metodę rehydratacji wspomaganej żelem. Gigantyczne polimerosomy składające się z kopolimeru diblock powstają po około 30 min rehydratacji. Blok hydrofilowy zaznaczono kolorem magenta, a blok hydrofobowy kolorem zielonym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Protokół
1. Przygotowanie polimeru i agarozy
Uwaga: Przez cały czas trwania niniejszego protokołu należy nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Okulary ochronne są również wymagane podczas pracy z jakimkolwiek rozpuszczalnikiem organicznym lub w każdym kroku, w którym może dojść do rozpryskiwania cieczy.
- Przygotować roztwór polimeru w chloroformie o stężeniu 5 mg/ml. Dodać 1 ml chloroformu do 5 mg stałego diblokowego kopolimeru poli(tlenku etylenu)-b-poli(butadienu) (PEO-PBD, EO22-BD37) w szklanej fiolce i mieszać okrężnie do całkowitego rozpuszczenia. Wszystkie kroki z użyciem chloroformu należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym.
- Wymieszać z lipidem znakowanym fluorescencyjnie (zakupionym w formie roztworu w chloroformie) tak, aby końcowe stężenie wyniosło 0,5 mol % lipidu znakowanego w 99,5 mol % polimeru nieznakowanego.
- Na przykład: pipetować ~12 µl lipidu znakowanego fluorescencyjnie o stężeniu 1 mg/ml w chloroformie do 997,58 µl polimeru PEO-PBD, EO22-BD37 w chloroformie (o masie cząsteczkowej 2 950 Daltonów), aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mol % lipidu znakowanego i 99,5 mol % polimeru.
- Roztwór przechowywać w szczelnej fiolce z nakrętką odporną na chloroform w temperaturze -20 °C. Owinąć krawędź fiolki w miejscu przykręcania nakrętki taśmą teflonową i mocno zakręcić fiolkę. Kolejny fragment taśmy teflonowej owinąć wokół zewnętrznej części nakrętki, a na koniec całość owinąć folią Parafilm, aby zminimalizować parowanie.
- Przygotować 1% (m/v) roztwór agarozy, mieszając 0,5 mg standardowej agarozy w 50 ml wody (lub 50 ml 100 mM sacharozy) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Gotować roztwór agarozy w standardowej kuchence mikrofalowej przez ~1 min (lub do całkowitego rozpuszczenia, co objawia się przejaśnieniem roztworu).
Uwaga: Roztwór agarozy można wykorzystać po kilku minutach chłodzenia lub pozwolić mu stężeć, a następnie przechowywać i ponownie roztopić, stosując tę samą procedurę.
2. Przygotowanie filmu agarozowego
- Odetnij końcówkę końcówki do pipety 1 000 µl, aby zapobiec zapychaniu. Używając przyciętej końcówki, nanieś 300 µl roztopionego roztworu agarozy na kwadratowe szkiełko nakrywkowe o boku 25 mm bezpośrednio od producenta.
- Przed naniesieniem pozwól agarozie ostygnąć do ~65-75 °C. Jeśli agaroza będzie zbyt zimna, podczas procesu rozprowadzania zacznie tworzyć grudki na powierzchni. I odwrotnie, jeśli agaroza będzie zbyt gorąca, konieczne będzie intensywniejsze rozprowadzanie, aby przylgnęła ona do powierzchni.
- Trzymając krawędź szkiełka nakrywkowego w rękawiczkach, użyj długiej krawędzi drugiej końcówki do pipety 1 000 µl, aby równomiernie rozprowadzić agarozę po powierzchni szkiełka. Przesuwaj końcówkę pipety w przód i w tył po szkiełku nakrywkowym, aż agaroza całkowicie przylgnie i pokryje całą powierzchnię.
- Połóż szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą na kawałku Parafilmu warstwą agarozy do góry. Po pokryciu odpowiedniej liczby szkiełek, umieść Parafilm ze szkiełkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 1 hr, aby odparować wodę z agarozy na powierzchni.
Uwaga: Odparowanie wody rozpoznaje się po zniknięciu widocznej warstwy agarozy; szkiełko powinno wyglądać na płaskie i przejrzyste. Po całkowitym odparowaniu wody przechowuj szkiełka nakrywkowe warstwą agarozy do góry w jednorazowej plastikowej szalce Petriego.
3. Tworzenie filmu polimerowego
- Nanieś pipetą 30 µl przygotowanego roztworu polimeru na błonę agarozową.
- Trzymając za krawędź szkiełko nakrywkę w rękawiczkach, użyj długiej krawędzi igły 18 G, aby rozprowadzić roztwór po błonach agarozowych okrężnymi ruchami. Kontynuuj rozprowadzanie do momentu odparowania roztworu.
Uwaga: Należy uważać na ostry koniec igły. - Umieść błony polimerowe w plastikowej szalce Petri stroną polimerową do góry, a następnie włóż szalkę do standardowego laboratoryjnego eksykatora próżniowego owiniętego folią aluminiową (aby zapobiec fotoblaknięciu znakowanego lipidu) na co najmniej 1 hr, aby całkowicie usunąć pozostałości rozpuszczalnika.
4. Formowanie polimerosomów
- Przykleić studzienkę osłonową — albo wykonaną samodzielnie studzienkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) (blok utwardzonego PDMS o grubości ~0,5 cm z wyciętym w środku otworem o średnicy ~1 cm), albo studzienkę dostępną w sprzedaży — do szkiełka nakrywkowe pokrytego błoną polimerową. Delikatnie docisnąć studzienkę do pokrytego polimerem szkiełka, z polimerem skierowanym do góry, aż do uzyskania szczelnego połączenia między studzienką a szkiełkiem. Należy uważać, aby nie docisnąć zbyt mocno i nie złamać szkiełka nakrywkowego.
- Dodać 200-500 µl roztworu rehydracyjnego do komory (można użyć wody, ale sprawdzi się również szereg buforów lub pożywek); objętość rehydracji zależy od rozmiaru przyklejonej studzienki.
- Przygotować komorę wilgotnościową, aby zmniejszyć parowanie roztworu rehydracyjnego. Wzdłuż krawędzi szklanej szalki Petriego umieścić zwinięty, mokry ręcznik Kimwipe. Umieścić błonę polimerową z przyklejoną studzienką w komorze wilgotnościowej i przykryć pokrywką. Szalkę Petriego owinąć folią aluminiową, aby zminimalizować fotowybielanie. Umieścić szalkę Petriego na płycie grzewczej ustawionej na 40 °C na co najmniej 30 min.
- W trakcie rehydracji regulować temperaturę płyty grzewczej w zakresie 24-70 °C, aby dostosować rozmiar tworzących się pęcherzyków (Rycina 5). Temperatura 70 °C jest bliska Tm agarozy, dlatego należy zachować ostrożność przy przekraczaniu tej wartości.
5. Charakterystyka polimerosomów za pomocą metody odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)
- Przenieś szkiełko nakrywkowe z przytwierdzonym doznownikiem bezpośrednio pod mikroskop odwrócony w celu wykonania obrazowania.
- Wybierz odpowiedni zestaw filtrów w zależności od fluorescencyjnego lipidu zawartego w roztworze polimeru. W przypadku lipidów znakowanych rhodaminą wprowadzonych do roztworów polimerowych należy użyć filtra wzbudzenia 560/25 nm i filtra emisji 607/36 nm lub porównywalnych zestawów filtrów.
- Użyj obiektywu olejowego 100X, aby ustawić ostrość na górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego, do której będą przytwierdzone polimerosomy. Jeśli polimerosomy są szczególnie duże (>20 µm) lub jeśli film polimerowy jest zbyt gruby, należy użyć obiektywu o mniejszej powiększeniu (np. 40X), aby lepiej zwizualizować polimerosomy.
- Zidentyfikuj polimerosomy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Polimerosomy rozpoznaje się po charakterystycznych pustych, sferycznych pęcherzykach o średnicy >5 µm.
- Zcharakteryzuj płynność błony za pomocą fluorescencyjnego odzyskiwania po fotowybielaniu (FRAP) na mikroskopie fluorescencyjnym z regulowanym kondensorem. Ze względu na adhezyjny charakter i gęste upakowanie polimerosomów na podłożach, ich naturalny ruch jest ograniczony, co zwiększa jakość obrazowania FRAP.
- Ustaw ostrość mikroskopu na interesujący polimerosom. Przymknij kondensator do małego obszaru i upewnij się, że krawędź polimerosomu znajduje się w obrębie analizowanego obszaru obrazowania.
- Zwiększ czas ekspozycji kamery i upewnij się, że wszystkie filtry neutralnej gęstości zostały usunięte, aby skutecznie fotowybielić analizowany obszar. Pozostaw fluorescencję błony do fotowybielenia przez 30-60 sec lub do momentu znacznego spadku intensywności fluorescencji.
- Wyłącz lampę i całkowicie otwórz kondensator. Zmniejsz ekspozycję do ustawień początkowych i natychmiast zacznij przechwytywać obrazy co 30 sec przez 3 min.
- Oblicz współczynniki dyfuzji błony stosując standardowe metody12. Jeśli wybielony obszar odzyska intensywność fluorescencji w ciągu 3-5 min, wskazuje to na płynność błony.
6. Charakterystyka rozmiaru polimerosomów
Rycina 6. Proces analizy wielkości polimerosomów przy użyciu oprogramowania do obrazowania. Instrukcje krok po kroku dotyczące pomiaru średnicy utworzonych pęcherzyków. Użytkownik musi znać jednostki kalibracji w pikselach/µm użytego mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Otwórz pozyskane obrazy polimerosomów w oprogramowaniu do analizy obrazu13.
- Ustaw skalę obrazu, klikając w rozwijanym menu „analyze”, a następnie wybierając opcję „set scale”.
- Skalibruj skalę mikroskopu przy użyciu standardowych metod (np. mikrometru).
- Wprowadź jednostki kalibracji i kliknij „ok”.
- Wybierz narzędzie do rysowania linii i narysuj linię obejmującą średnicę pęcherzyka.
- Zbierz pomiary długości, klikając w rozwijanym menu „analyze”, a następnie wybierając opcję „measure”.
- Kontynuuj pomiar poszczególnych pęcherzyków zgodnie z powyższą procedurą; każdy nowy pomiar zostanie dodany do okna danych pomiarowych.
- Po narysowaniu każdej linii i zmierzeniu jej długości naciśnij „Ctrl + D”, aby utrwalić linię na obrazie, co ułatwi śledzenie analizowanych pęcherzyków.
Wyniki
Polymersomy utworzono zgodnie z opisaną powyżej procedurą (Rysunek 1), wykorzystując standardowy sprzęt laboratoryjny przedstawiony na Rysunku 2. Polymersomy rehydratowano wodą dejonizowaną (Rysunek 3) i obrazowano przy użyciu mikroskopu odwróconego w trybie epifluorescencji z zastosowaniem obiektywu olejowego 100X. Należy pamiętać, że jeśli polymersomy nie są widoczne, mogły one osiągnąć rozmiary zbyt duże do uchwycenia obiektywem olejowym 100X; w takim przypadku może być konieczne użycie obiektywu o mniejszym powiększeniu. Jedną z zalet rehydratacji wspomaganej żelem jest możliwość tworzenia polymersomów w różnorodnych roztworach rehydratacyjnych. Polymersomy zostały z sukcesem utworzone w wodzie dejonizowanej, pełnej pożywce do hodowli komórek ssaków, roztworach sacharozy oraz dwóch fizjologicznie istotnych roztworach buforowych (buforze fosforanowym (PBS) lub buforze Tris (TBS)), co pokazano na Rysunku 4. W standardowych warunkach (rehydratacja wodą w 40 °C przez 1 h) w polu widzenia o wymiarach 40 x 40 µm2 zazwyczaj znajduje się ponad ~70 polymersomów. Chociaż produkcja polymersomów na powierzchni nie jest jednorodna, istnieje kilkanaście pól widzenia o takiej reprezentatywnej wydajności. Ponadto polymersomy były stabilne w roztworze przez co najmniej 24 h.
Wielkość polimerosomów można było łatwo regulować poprzez rehydratację filmów polimerowych w różnych temperaturach. Polimerosomy utworzone w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej miały średnicę średnią 2,9 ± 0,7 µm. Wraz ze wzrostem temperatury podczas rehydratacji zwiększała się również średnia wielkość polimerosomów (Tabela 1). W wysokich temperaturach (> 60 °C) powstawały polimerosomy o rozmiarach przekraczających nawet 100 µm (Rysunek 5).
Całe przetwarzanie obrazów przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym (Rysunek 6). Zebrane obrazy otwarto w programie komputerowym. Skalibrowaną wartość rozmiaru piksela wprowadzono w polu ustawiania skali. Za pomocą narzędzia linii narysowano linie w poprzek średnic. Po narysowaniu każdej poszczególnej linii zmierzono skalibrowaną długość i dodano ją do okna wyników. Następnie dane można wykreślić w wybranym programie matematycznym (np. Excel, Prism, Origin, itp.)
Rycina 2. Zdjęcie powszechnie dostępnych i niedrogich materiałów laboratoryjnych wymaganych do tworzenia polimerosomów. Wymagane elementy to: Parafilm, igła 18.5 G, polimer w chloroformie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku, końcówka do pipety 1,000 µl, kolba Erlenmeyera, pęseta, agaroza, kwadratowe szkiełka zakryjące 25 mm, studzienki obrazowe PDMS oraz szklana szalka Petriego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3. Zdjęcia metody rehydratacji wspomaganej żelem. Rozpuszczoną agarozę rozprowadza się na kwadratowej szkiełku nakrywkowym o boku 25 mm, aż równomierna warstwa pokryje całe szkiełko. Następnie szkiełka nakrywkowe umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37 °C i dokonuje dehydratacji filmu. Roztwór polimeru nanosi się na z dehydratowany film agarozowy i rozprowadza za pomocą igły ruchem okrężnym. Szkiełko nakrywkowe umieszcza się następnie w deskrykatorze przez noc (O/N), aby całkowicie odparować pozostałości rozpuszczalnika. Na koniec do podłoża przykleja się komorę obrazową, a polimery rehydratuje się wybranym roztworem i umieszcza w płytce Petriego w temperaturze 40 °C przez co najmniej 25 min, aby umożliwić formowanie się polimerosomów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4. Polimersomy mogą tworzyć się w różnych buforach. Filmy polimerowe PEO-PBD poddano rehydratacji wskazanym buforem w temperaturze 40 °C przez 1 hr. Pasek skali = 10 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5. Podniesienie temperatury podczas rehydratacji zwiększa rozmiar polimersomów. Reprezentatywne obrazy epifluorescencyjne polimersomów utworzonych w wodzie w zaznaczonych temperaturach rehydratacji. Wzrost temperatury prowadzi do powstania większych polimersomów. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Temperatura (°C) | Średnia wielkość (µm) |
| 24 | 2.93 ± 0.7 |
| 40 | 5.76 ± 2.5 |
| 50 | 6.65 ± 2.4 |
| 60 | 11.46 ± 5.8 |
| 70 | 14.04 ± 7.0 |
Tabela 1. Zwiększenie temperatury podczas rehydratacji prowadzi do zwiększenia rozmiaru polimerosomów. Obliczono średnice dla więcej niż 100 polimerosomów w wodzie dla różnych warunków temperaturowych, które przedstawiono na tym wykresie. Błąd oznacza odchylenie standardowe.
Dyskusja
Polimeromy stają się szeroko badane jako biologiczne naśladownictwo błon. Wytrzymałe i wszechstronne właściwości polimerów sprawiają, że są one bardzo atrakcyjne w badaniach wymagających funkcjonalizacji membrany, długowieczności i dostrojonej responsywności. Tradycyjne metody formowania gigantycznych rozmiarów polimeromów9,10 (>4 μm) są pracochłonne i wymagają drogiego i specjalistycznego sprzętu. Tutaj po raz pierwszy prezentujemy szybką, wszechstronną i solidną metodę formowania gigantycznych rozmiarów polimeromów przy użyciu standardowych niedrogich odczynników i sprzętu laboratoryjnego.
Stosując rehydratację wspomaganą żelem, polimerosomy jednowarstwowe mogą być formowane szybko (<30 min), w różnych roztworach do rehydratacji (w tym w pożywkach do hodowli komórkowych) i przy użyciu różnych polimerów (dane nie pokazane). Nie zaobserwowano tworzenia się pęcherzyków wielopłytkowych lub asymetrycznych przy użyciu tej techniki. W trakcie tych prac użyliśmy neutralnego kopolimeru diblokowego poli(tlenku etylenu)-b-poli(butadienu) (PEO-PBD, EO22-BD 37). Wiele różnych kompozycji polimerowych (w tym naładowane kopolimery diblokowe) działa dobrze przy użyciu tej metody (nie pokazano). Jednak niektóre dostępne na rynku kopolimery triblokowe i kopolimery diblokowe o wyższej masie cząsteczkowej (~ >5,000 daltonów) nie tworzą odrębnych polimeromów. We wszystkich eksperymentach opisanych w tym manuskrypcie niskie stężenie znakowanego lipidu zostało domieszkowane do roztworów polimerowych wyłącznie w celach wizualizacyjnych. Można również zastosować inne metody wizualizacji, w tym polimery bezpośrednio funkcjonalizowane barwnikiem fluorescencyjnym. Polimeromy można również obrazować za pomocą mikroskopii jasnego pola, chociaż mikroskopia fluorescencyjna zapewnia większą rozdzielczość.
Większość drobnych modyfikacji protokołu zazwyczaj nie zmienia wyników. Na przykład niewielkie różnice w stężeniu roztworu polimeru rozprowadzonego na szkiełkach nakrywkowych nie wpływają na tworzenie się powstałego filmu polimerowego. Chociaż pełny zakres stężeń nie został określony, tworzenie się polimeromów będzie z powodzeniem zachodzić przy dużym zakresie stężeń filmu polimerowego (np. 1-10 mg/ml). Istnieją jednak pewne zmiany w protokole, które negatywnie wpływają na tworzenie polimeromów. Najbardziej godne uwagi jest to, że okrągłe szkiełka nakrywkowe (zamiast kwadratowych) powodują bardzo słabe tworzenie polimeromów. Przypisujemy to niezwykle równomiernej warstwie agarozy na szkle, która w rzeczywistości utrudnia tworzenie polimeromów.
Jednym z najbardziej znaczących wyzwań związanych z tą techniką jest możliwość odzyskania polimeromów z powierzchni z wysoką wydajnością. Istnieją pewne przypadki, w których usunięcie polimeromów z pierwotnej powierzchni może być korzystne. Ze względu na wysoką fluorescencję tła z odwodnionej warstwy polimerowej, usunięcie pojedynczych polimeromów i przyklejenie ich do czystych szkiełek nakrywkowych poprawi jakość obrazowania i charakterystykę (szczególnie podczas analizy FRAP). Aby to zrobić, delikatne pipetowanie końcówką pipety, w której koniec został odcięty, spowoduje desorbację polimeromów z powierzchni (chociaż liczba odzyskanych pęcherzyków jest znacznie mniejsza niż te pierwotnie utworzone). Polimeromy można następnie umieścić na zmodyfikowanych powierzchniach szkiełek nakrywkowych, umożliwiając polimerosom interakcję z nowym szkiełkiem nakrywkowym. Zazwyczaj w przypadku obojętnych polimeromów PEO-PBD szkiełka nakrywkowe poddawane działaniu ozonu przez 15 minut pozwalają polimeromom opaść na powierzchnię w celu zobrazowania. Dla różnych kompozycji polimerowych (np. polimerów naładowanych ujemnie lub dodatnio) wymagana jest różna modyfikacja powierzchni.
Większość materiałów używanych w tym protokole jest z powodzeniem przechowywana i używana przez dni lub tygodnie. Zestaloną agarozę można ponownie zagotować i ponownie użyć, aż agaroza zacznie mieć zagięcia nawet po ugotowaniu lub zestalona agaroza zacznie wysychać. Szkiełka nakrywkowe z wysuszonymi foliami agarozowymi mogą być przechowywane i używane przez czas nieokreślony (np. miesiące). Polimer rozpuszczony w chloroformie może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Jednak po wysuszeniu folii polimerowej na foliach agarozowych, folie muszą być przechowywane w próżni domowej i zużyte w ciągu dwóch tygodni (dłuższe przechowywanie nie zostało bezpośrednio określone, ale zauważalne są różnice w polimeromach utworzonych z folii polimerowych starszych niż dwa tygodnie).
Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu nawadniania wspomaganego żelem, setki polimeromów o jednolitym kształcie są formowane szybko po zaledwie kilku godzinach pracy przy użyciu standardowego sprzętu i niedrogich odczynników laboratoryjnych. Ponadto polimeromy mogą być tworzone w różnych fizjologicznych roztworach buforowych i z różnych kompozycji polimerowych (nie pokazano). Niewielkie zmiany w metodzie nie wpływają negatywnie na tworzenie polimeromów, co sprawia, że rehydratacja wspomagana żelem jest wszechstronną i dostępną techniką dla naukowców o różnej wiedzy technicznej.
Zdolność do łatwego tworzenia gigantycznych polimeromów w skali wielkości komórek jest niezbędna do budowy sztucznych systemów przypominających komórki. Łatwość użycia i wszechstronność nawadniania wspomaganego żelem w celu wytworzenia tych polimeromów stanowi ogromny postęp w dziedzinie biomimetyki w tworzeniu solidnych mimików błony komórkowej. Na przykład, korzystając z tej techniki, strategie enkapsulacji różnych składników wewnątrzkomórkowych, funkcjonalizacji polimeru białkami błony komórkowej i włączenia białek transportujących błonę, żeby wymienić tylko kilka, można zaprojektować w celu budowy sztucznych komórek na bazie polimeromów.
Oświadczenia
Sandia National Laboratories to wieloprogramowe laboratorium zarządzane i obsługiwane przez Sandia Corporation, spółkę zależną należącą w całości do Lockheed Martin Corporation, dla Narodowej Administracji Bezpieczeństwa Jądrowego Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie kontraktu DE-AC04-94AL85000.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Ianowi M. Hendersonowi, Andrew Gomezowi i dr Walterowi F. Paxtonowi za ich techniczną wiedzę, rady i pomoc w tej pracy. Prace te były wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Podstawowych Nauk o Energii, Wydział Nauk o Materiałach i Inżynierii (BES-MSE). ACG, DYS i GDB były wspierane przez BES-MSE. Prace te zostały częściowo wykonane w Center for Integrated Nanotechnologies, Office of Science User Facility działającym dla Biura Nauki Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) (numer projektu użytkownika RA2015A0004, PI: ACG).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolba Erlenmeyera 125 ml | VWR | 89000-360 | |
| 18-stopniowa igła | VWR | BD-305196 | |
| Szkiełka nakrywkowe kwadratowe 25 mm | VWR | 48366-089 | |
| Agaroza | Sigma | A9539 | Standardowa agaroza do elektroforezy żelowej DNA |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Osłona | handlowaMikroskopia elektronowa Nauki | 70336 | Izolatory silikonowe Press-to-Seal |
| Oprogramowanie do analizy obrazu Fidżi | ImageJ | Bezpłatne pobieranie: http://fiji.sc/Fiji | |
| Szklana fiolka z teflonową pokrywką | VWR | 66009-556 | o pojemności 1,9 ml, opakowanie 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg lipidu w stężeniu 1 mg/ml w chloroformie |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10,2 cm x 38,1 m |
| poli(tlenek etylenu)-b-poli(butadien) lub PEO-PBD (o masie cząsteczkowej 2,940) | Źródło polimeru | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Taśma teflonowa | VWR | 300001-057 | 1/2" szerokość |
Bibliografia
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
- Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
- Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
- Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
- Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
- Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
- Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
- Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).
Przedruki i uprawnienia
