Method Article

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciernik trójgrzbietowy okazał się potężnym systemem do badania genetycznych podstaw szerokiej gamy morfologicznych, fizjologicznych i behawioralnych fenotypów. Niezwykle zróżnicowane fenotypy, które ewoluowały, gdy populacje morskie przystosowują się do niezliczonych środowisk słodkowodnych, w połączeniu ze zdolnością do krzyżowania form morskich i słodkowodnych, zapewniają rzadki system kręgowców, w którym genetyka może być wykorzystana do mapowania regionów genomu kontrolujących wyewoluowane cechy. Obecnie dostępne są doskonałe zasoby genomiczne, które ułatwiają molekularną analizę genetyczną wyewoluowanych zmian. Podczas gdy eksperymenty mapowania generują listy interesujących genów kandydujących, wymagane są funkcjonalne manipulacje genetyczne w celu przetestowania roli tych genów. Regulację genów można badać za pomocą transgenicznych plazmidów reporterowych i BAC zintegrowanych z genomem za pomocą systemu transpozazy Tol2. Funkcje określonych genów kandydujących i elementów cis-regulatorowych można ocenić poprzez indukcję ukierunkowanych mutacji za pomocą odczynników do edycji genomu TALEN i CRISPR/Cas9. Wszystkie metody wymagają wprowadzenia kwasów nukleinowych do zapłodnionych jednokomórkowych zarodków ciernika, co jest zadaniem utrudnionym ze względu na grubą kosmówkę zarodków ciernika oraz stosunkowo mały i cienki blastomer. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół mikroiniekcji kwasów nukleinowych do zarodków ciernika dla zastosowań transgenicznych i edycji genomu w celu badania ekspresji i funkcji genów, a także technik oceny sukcesu transgenezy i odzyskiwania stabilnych linii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z podstawowych elementów zrozumienia, jak powstaje bioróżnorodność, jest określenie genetycznych i rozwojowych podstaw wyewoluowanych zmian fenotypowych w przyrodzie. Ciernik trójgrzbietowy, Gasterosteus aculeatus, stał się doskonałym modelem do badania genetycznych podstaw ewolucji. Cierniki przeszły wiele adaptacyjnych zmian ewolucyjnych, ponieważ ryby morskie skolonizowały niezliczone środowiska słodkowodne na półkuli północnej, co spowodowało dramatyczne zmiany morfologiczne, fizjologiczne i behawioralne1. Genomy osobników z dwudziestu jeden populacji ciernika zostały zsekwencjonowane i złożone, a następnie wygenerowano mapę połączeń o wysokiej gęstości w celu dalszego ulepszenia składania2,3. Eksperymenty z mapowaniem genetycznym zidentyfikowały regiony genomowe leżące u podstaw wyewoluowanych fenotypów 4-6, a w kilku przypadkach przetestowano funkcjonalne role określonych genów kandydujących7,8. Zidentyfikowano szereg regionów genomu leżących u podstaw zmian morfologicznych z obiecującymi genami kandydującymi, ale kandydaci ci nie zostali jeszcze przebadani funkcjonalnie 9-12. Ponadto cierniki są powszechnymi modelami w badaniach genetyki/genomiki populacyjnej13,14, specjacji15, zachowania16, ekotoksykologii17, immunologii18 i parazytologii19. Przyszłe badania w każdej z tych dziedzin skorzystają z możliwości wykonywania funkcjonalnych manipulacji genetycznych u cierników. Oprócz manipulowania ich sekwencjami kodującymi, role genów kandydujących można oceniać, badając ich sekwencje cis-regulatorowe oraz funkcjonalnie zwiększając, zmniejszając lub eliminując ekspresję genu kandydującego. Metody mikroiniekcji i transgenezy u cierników są dobrze znane7,8,20 i zostały początkowo opracowane przy użyciu metody za pośrednictwem meganukleazy21, po raz pierwszy opisanej w medaka22. Przedstawiona tutaj zmodyfikowana metoda mikroiniekcji została zoptymalizowana zarówno pod kątem transgenezy za pośrednictwem Tol2, jak i niedawno opracowanych odczynników do edycji genomu, w tym TALEN-ów i CRISPR-ów.

Uważa się, że zmiany w elementach cis-regulatorowych są kluczowe dla ewolucji morfologicznej, ponieważ zmiany cis-regulatorowe pozwalają uniknąć negatywnych plejotropowych konsekwencji mutacji kodujących23. Dlatego testowanie i porównywanie przypuszczalnych sekwencji cis-regulatorowych stało się głównym celem coraz większej liczby badań ewolucyjnych. Ponadto większość wariantów choroby u ludzi to warianty regulatorowe24,25, a modelowe systemy kręgowców są pilnie potrzebne do badania funkcji i logiki elementów cis-regulatorowych. Ryby, które w dużych ilościach zapładniają swoje zarodki zewnętrznie, oferują potężne systemy kręgowców do badania regulacji cis. System transpozonów Tol2, w którym obce DNA, które ma zostać zintegrowane z genomem, jest otoczone miejscami wiązania transpozazy Tol2 i wstrzykiwane jednocześnie z mRNA transpozazy Tol2, działa z wysoką wydajnością w celu pomyślnej integracji konstruktów plazmidowych z genomami ryb26-28. Zazwyczaj potencjalny wzmacniacz jest klonowany przed podstawowym promotorem (takim jak hsp70l29) i fluorescencyjnym genem reporterowym, takim jak EGFP (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne) lub mCherry w szkielecie Tol2 i wstrzykiwany z transpozazą mRNA26. Obserwacja ekspresji fluorescencyjnego reportera, zarówno w wstrzykniętych zarodkach, jak i potomstwie ze stabilnie zintegrowanymi transgenami, dostarcza informacji na temat czasoprzestrzennej regulacji ekspresji genów napędzanej przez domniemany wzmacniacz. W dalszych eksperymentach zwalidowane wzmacniacze mogą być stosowane do napędzania specyficznej tkankowo nadekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.

Do analizy większych regionów cis-regulatorowych, stworzono wysokiej jakości biblioteki genomiczne z dużymi wstawkami, wykorzystujące sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) zarówno dla morskich, jak i słodkowodnych cierników30. Te BAC mogą być rekombinowane w celu zastąpienia genu fluorescencyjnym genem reporterowym w kontekście dużego (150-200 kb) regionu genomowego31. Reporter fluorescencyjny jest następnie wyrażany we wzorcu czasoprzestrzennym, określonym przez sekwencje regulatorowe w BAC. W przypadku badań na rybach miejsca Tol2 można dodać do BAC, aby ułatwić integrację genomową32,33. W późniejszych stadiach rozwoju, gdy hybrydyzacja in situ jest technicznie trudna, fluorescencyjny odczyt BAC może być wykorzystany do badania wzorców ekspresji genów, jak wykazano w przypadku ciernika Bone morphogenetic protein 6 (Bmp6)20. Dodatkowo, wzorce ekspresji fluorescencyjnej u danej osoby mogą być śledzone w czasie, czego nie można osiągnąć za pomocą hybrydyzacji in situ. BAC mogą być również używane do dodawania dodatkowej kopii regionu genomowego w celu zwiększenia dawki genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Do badania funkcji genów, edycja genomu to gwałtownie rozwijająca się dziedzina, która może być wykorzystana do tworzenia ukierunkowanych zmian w sekwencjach genomowych w wielu różnych organizmach34. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) to modułowe, specyficzne dla sekwencji nukleazy pierwotnie wyizolowane z patogenów roślinnych, które można precyzyjnie zaprojektować, aby wiązały się bezpośrednio z wybraną sekwencją genomową i generowały podwójne pęknięcie nici35,36. Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/systemy CAS zostały pierwotnie znalezione w bakteriach i wykorzystują przewodnik RNA i białko Cas9 do wygenerowania przerwy w docelowej sekwencji DNA komplementarnej do przewodnika37. Późniejsza naprawa podwójnej przerwy nici utworzonej zarówno przez TALEN, jak i CRISPR często pozostawia niewielką insercję lub delecję, co może zakłócić funkcję sekwencji docelowej35-37. U cierników TALEN-y zostały użyte do zakłócenia ekspresji genów poprzez ukierunkowanie na wzmacniacz20, a zarówno TALEN-y, jak i CRISPR z powodzeniem wytworzyły mutacje w sekwencjach kodujących (dane niepublikowane). Szczegółowy protokół generowania CRISPR do stosowania u danio pręgowanego może posłużyć jako wytyczne do opracowania CRISPR dla cierników38.

Eksperymenty transgeniczne i edycja genomu wymagają wprowadzenia kwasów nukleinowych do nowo zapłodnionego zarodka jednokomórkowego. Wprowadzenie transgenu lub narzędzia do edycji genomu na wczesnym etapie rozwoju, maksymalizuje się liczbę genetycznie zmanipulowanych komórek potomnych w zarodku. Wstrzyknięte zarodki są następnie poddawane wizualnym badaniom przesiewowym pod kątem fluorescencji lub molekularnym badaniom przesiewowym pod kątem modyfikacji genomu. Jeśli komórki przyczyniające się do linii zarodkowej zostaną skutecznie namierzone, transgen lub mutacja może zostać przekazana podgrupie potomstwa, nawet jeśli śmiertelność po wstrzyknięciu jest wysoka. Ryby mozaikowe mogą być krzyżowane lub krzyżowane, a ich potomstwo poddawane badaniom przesiewowym w celu odzyskania zmutowanych alleli lub stabilnie zintegrowanego transgenu będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół ten opisuje metody wprowadzania transgenów i odczynników do edycji genomu do jednokomórkowych zarodków ciernika oraz monitorowania udanych modyfikacji genomu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace związane z rybami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley (numer protokołu R330).

1. Przygotuj kwasy nukleinowe do iniekcji

  1. Transgeneza plazmidu Tol2 (zaadaptowana z Fishera26).
    1. Wyciąć 10 μg plazmidu transpozazy (pCS-Tp)39 za pomocą 10 U NotI w dostarczonym buforze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu linearyzacji.
      Uwaga: Do uzyskania plazmidów Tol2 mogą być wymagane umowy o transferze materiałów.
    2. Ekstrahować pocięty plazmid mieszaniną fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego i osadu etanolu w proporcji 25:24:1 z octanem sodu zgodnie ze standardowymi protokołami40. Zawiesić plazmid w 50 μl wody wolnej od RNaz.
      Uwaga: Chloroform fenolowy powinien być używany w okapie, a odpady muszą być odpowiednio utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    3. Ustaw reakcję transkrypcji Sp6 zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Użyj zestawu do izolacji RNA, aby oczyścić reakcję transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta; ponownie zawieś RNA w 50 μl wody wolnej od RNaz.
    5. Usunąć 1 μl podwielokrotności RNA. Podgrzewać do 65 °C przez 5 minut, aby zdenaturować struktury wtórne, a następnie natychmiast schłodzić na lodzie. Zamrozić pozostałą reakcję transkrypcji w temperaturze -80 °C.
    6. Uruchom podwielokrotność RNA na 1% żelu agarozowym w 0,5x TAE (zasada Tris, kwas octowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy) z buforem roboczym ze wzorcem wielkości RNA na jednym torze. Oczekiwany produkt to 2 200 pb; odrzucić, jeśli >5% całkowitego RNA pojawia się w rozmazie mniejszym niż 2,200 pz, co wskazuje na rozległą degradację (ryc. 1).
    7. Określić ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Rozcieńczyć do 350 ng/μl w wodzie wolnej od RNaz i przechowywać 1 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C (dobrze przez co najmniej dwa lata).
    8. Sklonuj plazmid reporterowy Tol2 (na przykład przy użyciu pT2HE8 lub plazmidów z zestawu Tol241) z interesującym elementem cis-regulatorowym. Krótko mówiąc, PCR amplifikuje interesującą sekwencję genomowego DNA za pomocą starterów zawierających miejsca restrykcyjne znajdujące się w plazmidzie, trawi produkt PCR i wektor za pomocą enzymu (enzymów), podwiązuje wstawkę do wektora i przekształca powstały plazmid w kompetentną E. coli40. Odizoluj plazmid za pomocą zestawu zawierającego płukanie endotoksynami zgodnie z protokołem producenta.
    9. Wykonaj drugie oczyszczanie plazmidu Tol2 za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 30 μl wody wolnej od RNaz.
      Uwaga: wydajność z tego etapu może być niska (czasami poniżej 50% plazmidu wejściowego).
    10. Rozcieńczyć plazmid do ~125 ng/μl w wodzie wolnej od RNaz.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Transpozaza mRNA żel. Oczyszczony produkt reakcji transkrypcji (1 μl) podgrzano do temperatury 65 °C, schłodzono na lodzie i uruchomiono na 1% żelu agarozowym z 0,5-krotnym buforem TAE przy napięciu 100 V. Rozmiary drabinki RNA w kilozasadach (kb) są wskazane po lewej stronie. MRNA transpozazy o pełnej długości jest jasnym pasmem o wielkości ~2,2 kb. Niewielką, ale akceptowalną ilość zdegradowanego lub niekompletnego mRNA obserwuje się poniżej 2,2 kb. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Transgeneza BAC (patrz Suster32,33 dla technik rekombinowania BAC)
    1. Przygotuj BAC z E. coli za pomocą zestawu do oczyszczania BAC zgodnie z protokołem producenta. Użyj wytrącania etanolu, aby odzyskać DNA za pomocą standardowej ekstrakcji octanem sodu i etanolem40 i ponownie zawiesić DNA przy ~ 250 ng / μl w wodzie wolnej od RNaz.
    2. Przygotować mRNA transpozazy jak w punkcie 1.1.
  2. Indukcja mutacji za pomocą TALEN-ów (patrz Cermak35 w celu projektowania TALEN-ów)
    1. Skorzystaj z aplikacji internetowej, aby zaprojektować TALEN-y dla genu będącego przedmiotem zainteresowania42. Jeśli to możliwe, zaprojektuj TALEN-y tak, aby zakłócały miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego, aby ułatwić analizę molekularną.
    2. Sklonuj TALEN-y i przygotuj plazmidy do transkrypcji zgodnie z opublikowanym protokołem35.
    3. Transkrybować mRNA TALEN z reakcją transkrypcji Sp6 zgodnie z instrukcjami producenta i oczyszczać mRNA zgodnie z opisem dla transpozazy w sekcji 1.1.4. Określić ilościowo za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć do 200 ng/μl w wodzie wolnej od RNaz. Uruchom mRNA TALEN na żelu, aby upewnić się, że ma on odpowiedni rozmiar i nie ulega degradacji, jak opisano w kroku 1.1.6.
    4. Zaprojektuj parę starterów PCR, aby amplifikować około 100-200 pz otaczających sekwencję docelową TALEN za pomocą narzędzia do projektowania starterów i docelowej sekwencji DNA43. Zamów odpowiedni enzym restrykcyjny do zbadania zmian chorobowych w miejscu docelowym w oparciu o krok 1.3.1.
  3. Transgeneza CRISPR (patrz Talbot i Amacher38 dla projektowania i przygotowania CRISPR):
    1. Zaprojektuj i przygotuj CRISPR i mRNA Cas9 zgodnie z protokołem38 oraz zamów odpowiednie startery weryfikacyjne i enzymy restrykcyjne, jak opisano w kroku 1.3.4.

2. Przygotuj odczynniki do iniekcji

  1. Użyj kapilar borokrzemianowych do przygotowania igieł zgodnie z poniższym opisem.
    Uwaga: te kapilary nie są standardowymi kapilarnami używanymi do mikroiniekcji danio pręgowanego i są wykonane z grubszego i mocniejszego szkła, które ma kluczowe znaczenie dla przebicia twardej kosmówki ciernika.
    1. Podczas ciągnięcia igieł należy zawsze nosić rękawice nitrylowe lub lateksowe i nie dopuszczać do kontaktu igieł ze skórą lub olejkami skórnymi.
    2. Parametry wyciągania mikropipet należy określić empirycznie za pomocą testów rampowych zgodnie z instrukcjami producenta ściągacza do mikropipet. Na przykład w przypadku filamentu pudełkowego następujące parametry zostały określone jako optymalne: (Ciepło = 515, Ciąg = 60, Prędkość = 60, Opóźnienie = 85, Ciśnienie = 500). Te ustawienia tworzą igłę, która zwęża się stromo pod kątem około 12° dla ~2 mm, a następnie długie przedłużenie, które zwęża się pod kątem około 2° dla ~6 mm (Rysunek 2).
      Uwaga: Właściwe parametry będą się różnić w zależności od ściągacza i filamentu, a ślepe korzystanie z programu bez uprzedniego określenia parametrów poprzez testy rampowe może trwale zniszczyć filament ściągacza, którego wymiana jest trudna i kosztowna.
    3. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyciągnąć co najmniej 4 igły do mikropipet ze szkła borokrzemianowego z ustawieniami określonymi w ppkt 2.1.2.
    4. Przechowuj igły pionowo w kapilarnym słoiku do przechowywania, ostrym końcem skierowanym w dół.
    5. Przed wstrzyknięciem umieść słoik do przechowywania naczyń włosowatych na lodzie, aby schłodzić igły. Dodaj kawałek wilgotnego ręcznika papierowego do słoika, aby zapobiec parowaniu po napełnieniu igieł.
  2. Zapłodnienie jaj (wszystkie etapy wykonywane w temperaturze pokojowej)
    1. Oderwij lęg jajowy od ciężarnej samicy ciernika, delikatnie ściskając brzuch i głaszcząc w kierunku od przodu do tyłu, aby wypchnąć jaja przez kloakę i na szalkę Petriegoo wymiarach 35 x 10 mm 2. Dodaj wilgotny kawałek ręcznika papierowego po jednej stronie szalki Petriego (nie dotykając jajek), aby utworzyć komorę wilgotności. Przykryj szalkę Petriego, aby jajka pozostały wilgotne.
    2. Poddaj eutanazji samca ciernika w 0,025% Tricaine-S buforowanym 0,1% wodorowęglanem sodu.
    3. Rozciąć brzuch, usunąć jądra i macerować w 250 μl roztworu Hanka (patrz Westerfield44, aby zapoznać się z pełnym protokołem przygotowania roztworu Hanka).
    4. Zapłodnić maksymalnie 100 komórek jajowych roztworem nasienia w 50 μl i delikatnie wymieszać końcówką pipety, aby upewnić się, że wszystkie jaja zostały zapłodnione. Jeśli lęg wynosi >100 jaj, połowę jaj należy zapłodnić później, aby upewnić się, że wszystkie zarodki są w stadium jednokomórkowym w momencie wstrzyknięcia. Jaja mogą pozostać niezapłodnione w temperaturze pokojowej do godziny, a plemniki zwykle utrzymują się przez 1-7 dni w temperaturze 4 °C w roztworze Hanka.
    5. Po zapłodnieniu należy przykryć zarodki pokrywką szalki Petriego, aby zapobiec wysuszeniu. Odczekaj 20-25 minut, aż pierwsza komórka wyłoni się i pęcznieje (w tym czasie przygotuj materiał do wstrzykiwań).
    6. Napełnij szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm wodą z ciernika. (Aby zrobić wodę ciernika, najpierw przygotuj 10% wodorowęglan sodu rozpuszczony w wodzie dejonizowanej. Następnie dodaj 3,5 g mieszanki sztucznej wody morskiej i 0,217 ml 10% wodorowęglanu sodu na 1 l wody dejonizowanej i energicznie wymieszaj/wstrząśnij, aby rozpuścić sól.)
  3. Przygotuj roztwór do wstrzykiwań (podczas zapłodnienia jaj)
    1. Przygotować roztwór do wstrzykiwań zgodnie z tabelą 1 i przechowywać na lodzie.
      Uwaga: stężenia niektórych kwasów nukleinowych zostały zwiększone w stosunku do tych opublikowanych dla danio pręgowanego ze względu na zwiększoną objętość blastomeru ciernika.
Odczynnik Tol2 wstrzyknięcie Wtrysk BAC Wtrysk TALEN Wtrysk CRISPR Tol2 mRNA 350 ng 350 ng - - DNA Plazmid 150-200 ng 200-300 ng BAC - - mRNA TALEN - - 200 ng każdy - Przewodnik RNA CRISPR - - - 200 ng mRNA Cas9 - - - 400 ng 0,5% czerwieni fenolowej w PBS firmy Dulbecco 0,5 μl 0,5 μl 0,5 μl 0,5 μl Woda wolna od RNA do 5 μl do 5 μl do 5 μl do 5 μl

Tabela 1: Odczynniki do wstrzykiwań. Wszystkie mieszaniny należy przygotować do całkowitej objętości na 5 μl i przechowywać na lodzie.

  1. Wypełnij igły (na lodzie; Odczekaj co najmniej 10 minut, aby igły się napełniły).
    1. Wypełnij co najmniej trzy igły, pipetując 0,5 μl roztworu do wstrzykiwań na górny koniec igły, podczas gdy igły zwisają pionowo w kapilarnym słoiku do przechowywania. Uważaj, aby kropla pozostała na wierzchu i nie spływała po boku i unikała pęcherzyków.
    2. Po tym, jak czerwony płyn w większości odpłynie do spiczastego końca igły, dodaj kolejne 0,5 μl do końca igły i pozwól mu spłynąć.

3. Przygotuj zestaw do iniekcji i igłę do mikroiniekcji

Uwaga: Te kroki można zwykle wykonać po zapłodnieniu jaj.

  1. Włącz światło transilluminacyjne dla mikroskopu preparacyjnego i umieść szklaną płytkę o wymiarach ~13 cm x 13 cm na podstawie mikroskopu z 15 cm brzeszczotem do gipsu na szklanej płycie7. Ustawić piłę prostopadle do aparatu iniekcyjnego z wgłębieniami skierowanymi w stronę uchwytu igły.
  2. Włącz dopływ powietrza i upewnij się, że ciśnienie z regulatora jest ustawione na ~200 kPa.
  3. Włącz skrzynkę kontrolną i dostosuj ustawienia. Ustaw ciśnienie na ~150-175 kPa. Ustaw czas wstrzyknięcia na 180 ms.
  4. Poluzuj uchwyt igły, włóż napełnioną igłę do uchwytu, aż będzie można wyczuć opór gumowego uchwytu, i dokręć, aż dokręcisz palcem.
  5. Ustawić kąt nachylenia igły na około 45°.
  6. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby wyregulować igłę tak, aby koniec był wyśrodkowany w polu view. Powiększ do ~40-krotnego powiększenia i skup się na końcówce igły, która nie powinna dotykać szkła poniżej.
  7. Delikatnie złamij końcówkę igły, chwytając ją kleszczami zegarmistrzowskimi. Najlepiej, aby nie łamać prostopadle, ale raczej pod kątem ~60°. Złamij blisko końcówki (nie więcej niż 2-3 szerokości kleszczy od końca, rysunek 2).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Niezłamane i złamane igły do mikroiniekcji. Górna igła jest nieprzerwana, a końcówka dolnej igły została złamana kleszczami (strzałka). Igły wypełnia się roztworem zawierającym 0,05% czerwieni fenolowej. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Naciśnij kilkakrotnie pedał nożny do wstrzykiwań, aby sprawdzić, czy igła jest złamana. Po kilku dotknięciach z końca powinny zacząć wypływać maleńkie czerwone kropelki. Jeśli nie, spróbuj złamać igłę nieco wyżej.
  2. Jeśli na igle znajduje się pęcherzyk powietrza, zwiększ jednostkę ciśnienia wstecznego i szybko naciśnij pedał kilka razy, aby usunąć pęcherzyk.
  3. Dostosuj ciśnienie wsteczne:
    1. Użyj jednorazowej pipety transferowej, aby umieścić kilka kropel wody ciernika na szklanej płytce.
    2. Delikatnie zanurz igłę w wodzie.
    3. Zwiększać ciśnienie wsteczne, aż z igły wynurzy się słaby strumień różowego płynu (wskazujący na nadciśnienie).
      Uwaga: Jeśli nie ma wystarczającego ciśnienia wstecznego, igła wciągnie cytoplazmę przez działanie kapilarne. Jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt duże, objętość wtrysku może być przypadkowo zbyt duża.
    4. Cofnąć igłę tak daleko, jak to możliwe, aby nie uległa uszkodzeniu podczas przygotowywania zarodków (patrz poniżej).
  4. Alternatywnie, dostosuj ciśnienie wsteczne do wyższego ustawienia ciśnienia, tak aby stały, silny strumień cieczy opuszczał igłę, gdy jest ona zanurzona w wodzie. Następnie naciskanie pedału nożnego w celu wstrzyknięcia staje się zbędne; Wstrzyknięcie należy jednak wykonać szybko, aby uniknąć nadmiernego wstrzyknięcia.
    Uwaga: Nie należy próbować tej techniki, gdy po raz pierwszy uczysz się wstrzykiwać.

4. Mikroiniekcja

  1. Około 25 minut po zapłodnieniu użyj dwóch końcówek do pipet o pojemności 10 μl, aby usunąć 5-10 zarodków z lęgu i przenieść je na szklaną płytkę.
  2. Wciąż używając końcówek pipet, delikatnie rozdziel zarodki na poszczególne wgłębienia brzeszczotu. Należy zachować ostrożność, aby nie nakłuwać zarodków.
  3. Używając pipety transferowej z odciętym końcem, aby zarodki ciernika zmieściły się w środku, dodaj tyle wody ciernika, aby przykryć zarodki, pozostaw wodę na 3-5 sekund, a następnie usuń nadmiar wody pipetą, pozostawiając niewielką objętość wody pokrywającą każdy zarodek.
    Uwaga: Zbyt dużo wody spowoduje stwardnienie kosmówki i złamanie igły, ale niewielka ilość wody jest niezbędna, aby oderwać kosmówkę od komórki i żółtka (ryc. 3A-B).
  4. Zaczynając od zarodka znajdującego się najdalej, przesuń szklaną płytkę i powiększ tak, aby pierwszy zarodek wypełnił około 25% pola widzenia.
  5. Opuść igłę w pole widzenia, a następnie użyj końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby delikatnie obrócić zarodek, aby zidentyfikować blastomer, ziarnisty, lekko żółty wypukły guzek cytoplazmy na wierzchu żółtka (ryc. 3B), a następnie obrócić tak, aby blastomer był bezpośrednio prostopadły do końca igły (utrzymując zarodek we wgłębieniu brzeszczotu, Rysunek 3C).
    Uwaga: kropelki żółtka mogą przemieszczać się podczas obracania zarodka, dlatego nie należy ich używać jako punktu odniesienia dla lokalizacji blastomeru.
  6. Opuść igłę do cytoplazmy, ale nie przepychaj się do leżącego poniżej żółtka. Podczas przekłuwania kosmówki należy naciskać powoli i równomiernie, aby uniknąć złamania igły. Jeśli igła mocno się zgina, wycofaj się i spróbuj ponownie w nieco innym miejscu.
  7. Wciśnij pedał nożny 3-4 razy, aby wstrzyknąć tak, aby czerwony bolus z lekko rozproszonymi krawędziami wypełnił około ~1/8 średnicy cytoplazmy (patrz rysunek 3D).
    1. Należy unikać uzyskania czerwonego bolusa z ostrymi krawędziami, które nie zaczynają dyfundować, co wskazuje na wstrzyknięcie do żółtka poniżej cytoplazmy (ryc. 3E).
    2. Jeśli jasna różowo-czerwona plamka szybko się dyfunduje, wbij igłę dalej, aby nakłuć blastomer.
    3. Jeśli bolus iniekcji natychmiast zmieni kolor na żółty, obróć zarodek, aby upewnić się, że blastomer został wycelowany, a następnie wstrzyknij ponownie (ryc. 3F).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Pojawienie się zarodków ciernika przed i po wstrzyknięciu. Wszystkie zarodki są rysowane z perspektywy patrzenia w dół przez mikroskop (z wyjątkiem C' i G). (A) Przed dodaniem wody, zapłodnione zarodki mają jednolity wygląd z kropelkami oleju unoszącymi się w pobliżu górnej części żółtka. (B) Po dodaniu wody, kosmówka pęcznieje, odsłaniając blastomer wystający z żółtka i widoczny z profilu. (C) Rotacja zarodka w taki sposób, że igła wchodzi prostopadle do kosmówki i blastomeru. (C') Widok boczny igły, która przebiła kosmówkę końcówką w cytoplazmie. (D) Wstrzyknięcie do cytoplazmy powoduje powstanie czerwonej plamki z rozproszonymi krawędziami, które z czasem blakną. (E) Wstrzyknięcie do żółtka leżącego pod cytoplazmą powoduje powstanie czerwonej plamki o zdefiniowanych krawędziach. (F) Wstrzyknięcie do żółtka naprzeciwko cytoplazmy powoduje wywołaną przez pH zmianę koloru z czerwonego na żółty. (G) Widok boczny wyników wstrzyknięć, z Xs nad nieidealnymi miejscami wstrzyknięć. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby schować igłę, używając końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby przytrzymać zarodek, jeśli przyklei się do igły.
  2. Po wsunięciu igły należy przesunąć szklaną płytkę, aby wyrównać następny zarodek z igłą.
  3. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy użyć pipety transferowej, aby dodać wodę do zarodków, a następnie zebrać je do pipety transferowej i umieścić na szalce Petriego o średnicy 150 mm wypełnionej wodą ciernika.
  4. Osusz szklaną płytkę ręcznikiem papierowym, aby uniknąć gromadzenia się zbyt dużej ilości wody.
  5. Rozprowadzić świeże zarodki na pile i powtórzyć kroki od 4.4 do 4.10.
  6. Zachowaj ~10% zarodków jako niewstrzyknięte grupy kontrolne, aby zapewnić, że niewstrzyknięte zarodki rozwijają się normalnie i do wykorzystania jako kontrole typu dzikiego w testach molekularnych opisanych poniżej.

5. Pielęgnacja po wstrzyknięciu

  1. Inkubować zarodki na szalkach Petriego w temperaturze 18 °C po wstrzyknięciu aż do wylęgu10. Po wykluciu larwy chowają się w akwariach zgodnie z opisem10.
  2. Następnego dnia po wstrzyknięciu delikatnie wylać wodę z ciernika i zastąpić ją świeżą wodą. Zastąp świeżą wodą z ciernika co najmniej co drugi dzień.
  3. Codziennie sprawdzaj, czy nie ma martwych lub zniekształconych zarodków. Usuń takie zarodki, aby zapobiec zanieczyszczeniu wody przez próchnicę.

6. Analiza wyników iniekcji

  1. W przypadku wstrzykiwania reporterów fluorescencyjnych należy codziennie monitorować zarodki w zaciemnionym pomieszczeniu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego z filtrem GFP lub RFP (w zależności od transgenu fluorescencyjnego). Rejestruj anatomiczne wzorce ekspresji genów za pomocą zdjęć cyfrowych i/lub pisemnych opisów oraz tabelaryczne zestawienie liczby ryb z różnymi domenami ekspresji (ryc. 4 i 5).
    Uwaga: Cierniki mają autofluorescencyjne, gwiaździste komórki pigmentowe, które są widoczne pod filtrami GFP od 4 dni po zapłodnieniu (dpf).
    1. Aby wytworzyć stabilne linie, należy zachować zarodki z wykrywalną fluorescencją i dorosnąć do dorosłości zgodnie z opisem10.
    2. Krzyżuj dorosłe ryby z rybami typu dzikiego przy użyciu procedury zapłodnienia in vitro opisanej w sekcji 2.2 i przebadaj potomstwo pod kątem fluorescencji, jak opisano w kroku 6.1, w poszukiwaniu fluorescencyjnego potomstwa, wskazującego na udaną transmisję transgenową.
    3. Aby uwidocznić fluorescencję u wyklutych, swobodnie pływających larw, dodaj 500 μl 0,8% trikainy do 150-milimetrowej szalki Petriego, aby znieczulić ryby i poczekaj, aż ryby przestaną się poruszać do obrazu. Natychmiast spłukać kilka razy świeżą wodą z ciernika po obserwacji i obrazowaniu.
    4. Opcjonalnie, aby zachować fluorescencję do dalszego obrazowania, należy poddać eutanazji larwy w 0,025% (250 mg/L) trikainy buforowanej 0,1% wodorowęglanem sodu i utrwalić na 4 godziny w 4% paraformaldehydzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C. Przechowywać w 1x PBS przez okres do dwóch tygodni.
      Uwaga: autofluorescencja tła zwiększa się z czasem.
  2. Genotypowanie diagnostyczne PCR/trawienie w celu indukcji mutacji za pomocą CRISPR lub TALEN-ów - najlepiej wykonać 2 dni po zapłodnieniu.
    1. Za pomocą pipety transferowej umieścić 10 wstrzykniętych zarodków (2 dpf, nadal w kosmówce) w pierwszych 10 dołkach 12-dołkowej probówki z paskami do PCR. Umieść niewstrzyknięte ryby kontrolne w dwóch ostatnich dołkach.
    2. Usuń nadmiar wody ciernika.
    3. Dodaj 50 μl buforu do lizy (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,3% Tween-20 i 0,3% NP-40) do każdej studzienki.
    4. Umieścić nakrętki na probówkach i inkubować w temperaturze 95 °C przez 20 minut w termocyklerze.
      Uwaga: Po gotowaniu żółtko stanie się białe i gumowate.
    5. Zdejmij pokrywki i użyj innej czystej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby macerować zarodek w każdej probówce.
      Uwaga: Białe zanieczyszczenia będą zbierać się na dnie tuby.
    6. Dodać 2,5 μl 10 mg/ml proteinazy K do każdego dołka.
    7. Załóż pokrywki i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę w celu strawienia białka, a następnie w temperaturze 95 °C przez 20 minut w celu dezaktywacji proteinazy K. Przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć rozwoju pleśni.
    8. Wykonaj PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj lizatu zarodkowego jako matrycy DNA.
      Uwaga: Uważaj, aby usunąć płyn z górnej części probówki na matrycę DNA, unikając widocznych resztek kosmówki lub żółtka na dnie probówki.
    9. Wymieszać produkt PCR w równej objętości z główną mieszanką enzymu restrykcyjnego zawierającą 1x bufor specyficzny dla enzymu i 0,25 μl enzymu na próbkę. Zawsze zachowuj połowę nieoszlifowanego produktu PCR do oznaczenia na żelu w celu potwierdzenia, że produkty PCR mają przewidywany rozmiar. Inkubować PCR zmieszany z enzymem w warunkach odpowiednich dla enzymu restrykcyjnego.
      Uwaga: Niektóre enzymy mogą wymagać innych proporcji buforu enzymatycznego do produktu PCR; Dostosować stężenie buforu, jeśli niewstrzyknięte kontrole nie wykazują całkowitego roztrawienia.
    10. Po strawieniu umieść produkty na 1% żelu agarozowym obok drabinki rozmiarów DNA, aby potwierdzić oczekiwane rozmiary produktów.
      Uwaga: Nieobcięte prążki w wstrzykniętych zarodkach wskazują na obecność zmian molekularnych (ryc. 6), a niewstrzyknięte grupy kontrolne muszą być w pełni strawione w celu interpretacji wyników.
    11. Aby potwierdzić zmiany chorobowe, wytnij nieobcięte pasma z żeli agarozowych i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Użyj sekwencjonowania Sangera, najlepiej przy użyciu startera sekwencjonowania wewnętrznego do starterów PCR, aby potwierdzić zmiany chorobowe. W zarodkach, którym wstrzyknięto F0, prawdopodobnie będzie obecna mieszanka zmian chorobowych, co spowoduje pogorszenie jakości odczytu Sangera w pobliżu miejsca docelowego.
    12. Aby wytworzyć stabilną linię, należy zachować wszystkie wstrzyknięte zarodki z lęgów, które wykazują dodatnie wyniki badań przesiewowych pod kątem zmian molekularnych. Wyhoduj ryby, krzyżuj się, a następnie przebadaj podzbiór zarodków F1 pod kątem zmian molekularnych, jak opisano w krokach od 6.2.1 do 6.2.11. Jeśli zidentyfikowani zostaną heterozygotyczni nosiciele, należy wyhodować pozostałe zarodki F1 do dorosłości i zidentyfikować osobniki heterozygotyczne za pomocą DNA wyekstrahowanego z klipsa płetwy ogonowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla transgenów reporterowych, które mają aktywność wzmacniającą, udane wstrzyknięcie spowoduje specyficzną, komórkową ekspresję transgenu (Rysunek 4A, 4C). Wstrzyknięte ryby można następnie krzyżować w celu wytworzenia stabilnych linii (przykład stabilnej linii BAC pokazany na rysunku 4B). Wstrzyknięcie DNA do zarodków ciernika zazwyczaj skutkuje znacznie wyższą śmiertelnością niż samo RNA. Typowe jest obserwowanie do 50% (czasem nawet wi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzykiwanie jednokomórkowych zarodków ciernika w celu transgenezy lub edycji genomu wiąże się z trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, w porównaniu z zarodkami danio pręgowanego, embrionalna kosmówka ciernika jest twarda i często łamie igły. Problem ten można częściowo rozwiązać, stosując grubsze i mocniejsze szklane mikropipety i wstrzykując je prostopadle do kosmówki (patrz protokół, ryc. 2). Upewnienie się, że do zarodków dodaje się jak najmniej wody (tylko tyle, aby kosmówka pęcznieje i odrywa si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH R01 #DE021475 (CTM), NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE) oraz NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Dziękujemy Kevinowi Schwalbachowi za przeprowadzenie rekombinacji i wstrzyknięć BAC, Nickowi Donde za wygenerowanie danych sekwencjonowania CRISPR Sanger oraz Katherine Lipari za pomocne informacje zwrotne na temat protokołu iniekcji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop stereoskopowy z transilluminacjąLeicaS6e/ KL300 LED
Ręczny mikromanipulatorStosowane oprzyrządowanie naukoweMM33Marzhauser M33 Mikromanipulator
System pomiaru ciśnieniaStosowane oprzyrządowanie naukoweMPPI-3
Jednostka ciśnienia zwrotnegoStosowane oprzyrządowanie naukoweBPU
Zestaw uchwytów do mikropipetStosowane oprzyrządowanie naukoweMPIP
Magnetyczny uchwyt podstawyStosowane oprzyrządowanie naukowePodstawa
Przełącznik nożnyStosowane oprzyrządowanie naukoweFSW
Żelazna płyta (podstawa magnetyczna)NarishigeIP
Płonący/brązowy ściągacz do mikropipetInstrumentSutterP-97
Jednorazowe pipety transferoweFisher13-711-7M
0,5% czerwieni fenolowej w DPBSSigma P0290znacznik iniekcyjny
#5 kleszcze, biologia dumoxel Fine Science Tools11252-30do łamania igieł
Słoik do przechowywania mikropipetWorld Precision InstrumentsE210mieści igły
6", 6 zębów na cal piła do płyt kartonowo-gipsowychLenox20571 (S636RP)trzymaj jaja do wstrzykiwań
13 cm x 13 cm szklana płytadowolny sklep z narzędziami-kapilary
ze szkła borokrzemianowego, 1,0 mm OD/0,58 mm ID World Precision Instruments1B100-F4*twardsze szkło niż kapilary iniekcyjne danio pręgowanego
150 x 15mm szalka PetriegoFisherFB0875714wychowywać zarodki ciernika
35 mm x 10 mm szalka PetriegoFisher08-757-100Aprzechowywać jaja przed wstrzyknięciem
Instant Ocean SaltInstant OceanSS15-10
Wodorowęglan soduSigmaS5761-500G
Metanosulfonian trikainy/MS-222Western Chemical IncMS222znieczulenie/eutanazja
ryb Zestaw do transkrypcji Sp6AmbionAM1340Do transkrypcji TALEN-ów i transpozazy mRNA
Zestaw do czyszczenia RNeasyQiagen74104oczyszcza transpozazę lub TALEN RNA
Zestaw do czyszczenia QiaQuick PCRQiagen28104oczyszcza plazmidy dla iniekcja
Proteinaza K 20 mg/mlAmbionAM2546do preparacji DNA
Zestaw Nucleobond BAC 100Clontech740579do preparatu DNA BAC
NotINEBR0189L
Polimeraza PhusionFisherF-530L
Zestaw Qiagen PlasmidPlus MidiQiagen12943zawiera bufor do płukania endotoksyn
QIAQuick Ekstrakcja żeluQiagen28704 do sekwencjonowania mutacji wywołanych
Fenol:chloroform:Alkohol izoamylowySigmaP2069-100ML
Octan soduSigmaS2889-250G
Etanol (klasa biologii molekularnej)SigmaE7023-500ML
AgarozaSigmaA9539
50x Bufor tris-octan EDTAThermoFisherB49
0,5-10 Kb drabinkaRNAThermoFisher15623-200
Nanokropla  SpektrofotometrThermo ScientificNanodrop 2000
ParaformaldehydSigma158127-500G
10x PBSThermoFisher70011-044
1 kb Plus Drabinka DNAThermoFisher10787-018
Chlorek potasuSigmaP9541-500G
Chlorek magnezuSigmaM8266-100G
NP-40ThermoFisher28324
Tween 20SigmaP1379-500ML
Tris pH 8,3TeknovaT1083
12-paskowa probówka do PCRThermo ScientificAB-1113
magnetyczna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
  2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
  3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
  4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
  5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
  6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
  7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  8. O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290(2015).
  9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
  10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).
  11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
  12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
  13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
  14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).
  15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
  16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
  17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
  18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
  19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
  20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
  21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
  24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
  27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
  29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
  30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
  31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
  32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).
  34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  40. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
  42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
  43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).
  44. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
  45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
  46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stickleback EmbryosMicroinjection TechniqueTransgenesis ApplicationsGenome EditingTol2 TransposaseTALEN CRISPRBlastomere InjectionChorion PenetrationTransgene ExpressionStable Lines

Related Articles