Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54055

⸱

13 maja 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Streszczenie

Ciernik trójgrzbietowy okazał się potężnym systemem do badania genetycznych podstaw szerokiej gamy morfologicznych, fizjologicznych i behawioralnych fenotypów. Niezwykle zróżnicowane fenotypy, które ewoluowały, gdy populacje morskie przystosowują się do niezliczonych środowisk słodkowodnych, w połączeniu ze zdolnością do krzyżowania form morskich i słodkowodnych, zapewniają rzadki system kręgowców, w którym genetyka może być wykorzystana do mapowania regionów genomu kontrolujących wyewoluowane cechy. Obecnie dostępne są doskonałe zasoby genomiczne, które ułatwiają molekularną analizę genetyczną wyewoluowanych zmian. Podczas gdy eksperymenty mapowania generują listy interesujących genów kandydujących, wymagane są funkcjonalne manipulacje genetyczne w celu przetestowania roli tych genów. Regulację genów można badać za pomocą transgenicznych plazmidów reporterowych i BAC zintegrowanych z genomem za pomocą systemu transpozazy Tol2. Funkcje określonych genów kandydujących i elementów cis-regulatorowych można ocenić poprzez indukcję ukierunkowanych mutacji za pomocą odczynników do edycji genomu TALEN i CRISPR/Cas9. Wszystkie metody wymagają wprowadzenia kwasów nukleinowych do zapłodnionych jednokomórkowych zarodków ciernika, co jest zadaniem utrudnionym ze względu na grubą kosmówkę zarodków ciernika oraz stosunkowo mały i cienki blastomer. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół mikroiniekcji kwasów nukleinowych do zarodków ciernika dla zastosowań transgenicznych i edycji genomu w celu badania ekspresji i funkcji genów, a także technik oceny sukcesu transgenezy i odzyskiwania stabilnych linii.

Wprowadzenie

Jednym z podstawowych elementów zrozumienia, jak powstaje bioróżnorodność, jest określenie genetycznych i rozwojowych podstaw wyewoluowanych zmian fenotypowych w przyrodzie. Ciernik trójgrzbietowy, Gasterosteus aculeatus, stał się doskonałym modelem do badania genetycznych podstaw ewolucji. Cierniki przeszły wiele adaptacyjnych zmian ewolucyjnych, ponieważ ryby morskie skolonizowały niezliczone środowiska słodkowodne na półkuli północnej, co spowodowało dramatyczne zmiany morfologiczne, fizjologiczne i behawioralne1. Genomy osobników z dwudziestu jeden populacji ciernika zostały zsekwencjonowane i złożone, a następnie wygenerowano mapę połączeń o wysokiej gęstości w celu dalszego ulepszenia składania2,3. Eksperymenty z mapowaniem genetycznym zidentyfikowały regiony genomowe leżące u podstaw wyewoluowanych fenotypów 4-6, a w kilku przypadkach przetestowano funkcjonalne role określonych genów kandydujących7,8. Zidentyfikowano szereg regionów genomu leżących u podstaw zmian morfologicznych z obiecującymi genami kandydującymi, ale kandydaci ci nie zostali jeszcze przebadani funkcjonalnie 9-12. Ponadto cierniki są powszechnymi modelami w badaniach genetyki/genomiki populacyjnej13,14, specjacji15, zachowania16, ekotoksykologii17, immunologii18 i parazytologii19. Przyszłe badania w każdej z tych dziedzin skorzystają z możliwości wykonywania funkcjonalnych manipulacji genetycznych u cierników. Oprócz manipulowania ich sekwencjami kodującymi, role genów kandydujących można oceniać, badając ich sekwencje cis-regulatorowe oraz funkcjonalnie zwiększając, zmniejszając lub eliminując ekspresję genu kandydującego. Metody mikroiniekcji i transgenezy u cierników są dobrze znane7,8,20 i zostały początkowo opracowane przy użyciu metody za pośrednictwem meganukleazy21, po raz pierwszy opisanej w medaka22. Przedstawiona tutaj zmodyfikowana metoda mikroiniekcji została zoptymalizowana zarówno pod kątem transgenezy za pośrednictwem Tol2, jak i niedawno opracowanych odczynników do edycji genomu, w tym TALEN-ów i CRISPR-ów.

Uważa się, że zmiany w elementach cis-regulatorowych są kluczowe dla ewolucji morfologicznej, ponieważ zmiany cis-regulatorowe pozwalają uniknąć negatywnych plejotropowych konsekwencji mutacji kodujących23. Dlatego testowanie i porównywanie przypuszczalnych sekwencji cis-regulatorowych stało się głównym celem coraz większej liczby badań ewolucyjnych. Ponadto większość wariantów choroby u ludzi to warianty regulatorowe24,25, a modelowe systemy kręgowców są pilnie potrzebne do badania funkcji i logiki elementów cis-regulatorowych. Ryby, które w dużych ilościach zapładniają swoje zarodki zewnętrznie, oferują potężne systemy kręgowców do badania regulacji cis. System transpozonów Tol2, w którym obce DNA, które ma zostać zintegrowane z genomem, jest otoczone miejscami wiązania transpozazy Tol2 i wstrzykiwane jednocześnie z mRNA transpozazy Tol2, działa z wysoką wydajnością w celu pomyślnej integracji konstruktów plazmidowych z genomami ryb26-28. Zazwyczaj potencjalny wzmacniacz jest klonowany przed podstawowym promotorem (takim jak hsp70l29) i fluorescencyjnym genem reporterowym, takim jak EGFP (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne) lub mCherry w szkielecie Tol2 i wstrzykiwany z transpozazą mRNA26. Obserwacja ekspresji fluorescencyjnego reportera, zarówno w wstrzykniętych zarodkach, jak i potomstwie ze stabilnie zintegrowanymi transgenami, dostarcza informacji na temat czasoprzestrzennej regulacji ekspresji genów napędzanej przez domniemany wzmacniacz. W dalszych eksperymentach zwalidowane wzmacniacze mogą być stosowane do napędzania specyficznej tkankowo nadekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.

Do analizy większych regionów cis-regulatorowych, stworzono wysokiej jakości biblioteki genomiczne z dużymi wstawkami, wykorzystujące sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) zarówno dla morskich, jak i słodkowodnych cierników30. Te BAC mogą być rekombinowane w celu zastąpienia genu fluorescencyjnym genem reporterowym w kontekście dużego (150-200 kb) regionu genomowego31. Reporter fluorescencyjny jest następnie wyrażany we wzorcu czasoprzestrzennym, określonym przez sekwencje regulatorowe w BAC. W przypadku badań na rybach miejsca Tol2 można dodać do BAC, aby ułatwić integrację genomową32,33. W późniejszych stadiach rozwoju, gdy hybrydyzacja in situ jest technicznie trudna, fluorescencyjny odczyt BAC może być wykorzystany do badania wzorców ekspresji genów, jak wykazano w przypadku ciernika Bone morphogenetic protein 6 (Bmp6)20. Dodatkowo, wzorce ekspresji fluorescencyjnej u danej osoby mogą być śledzone w czasie, czego nie można osiągnąć za pomocą hybrydyzacji in situ. BAC mogą być również używane do dodawania dodatkowej kopii regionu genomowego w celu zwiększenia dawki genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Do badania funkcji genów, edycja genomu to gwałtownie rozwijająca się dziedzina, która może być wykorzystana do tworzenia ukierunkowanych zmian w sekwencjach genomowych w wielu różnych organizmach34. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) to modułowe, specyficzne dla sekwencji nukleazy pierwotnie wyizolowane z patogenów roślinnych, które można precyzyjnie zaprojektować, aby wiązały się bezpośrednio z wybraną sekwencją genomową i generowały podwójne pęknięcie nici35,36. Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/systemy CAS zostały pierwotnie znalezione w bakteriach i wykorzystują przewodnik RNA i białko Cas9 do wygenerowania przerwy w docelowej sekwencji DNA komplementarnej do przewodnika37. Późniejsza naprawa podwójnej przerwy nici utworzonej zarówno przez TALEN, jak i CRISPR często pozostawia niewielką insercję lub delecję, co może zakłócić funkcję sekwencji docelowej35-37. U cierników TALEN-y zostały użyte do zakłócenia ekspresji genów poprzez ukierunkowanie na wzmacniacz20, a zarówno TALEN-y, jak i CRISPR z powodzeniem wytworzyły mutacje w sekwencjach kodujących (dane niepublikowane). Szczegółowy protokół generowania CRISPR do stosowania u danio pręgowanego może posłużyć jako wytyczne do opracowania CRISPR dla cierników38.

Eksperymenty transgeniczne i edycja genomu wymagają wprowadzenia kwasów nukleinowych do nowo zapłodnionego zarodka jednokomórkowego. Wprowadzenie transgenu lub narzędzia do edycji genomu na wczesnym etapie rozwoju, maksymalizuje się liczbę genetycznie zmanipulowanych komórek potomnych w zarodku. Wstrzyknięte zarodki są następnie poddawane wizualnym badaniom przesiewowym pod kątem fluorescencji lub molekularnym badaniom przesiewowym pod kątem modyfikacji genomu. Jeśli komórki przyczyniające się do linii zarodkowej zostaną skutecznie namierzone, transgen lub mutacja może zostać przekazana podgrupie potomstwa, nawet jeśli śmiertelność po wstrzyknięciu jest wysoka. Ryby mozaikowe mogą być krzyżowane lub krzyżowane, a ich potomstwo poddawane badaniom przesiewowym w celu odzyskania zmutowanych alleli lub stabilnie zintegrowanego transgenu będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół ten opisuje metody wprowadzania transgenów i odczynników do edycji genomu do jednokomórkowych zarodków ciernika oraz monitorowania udanych modyfikacji genomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace z udziałem ryb zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley (numer protokołu R30).

1. Przygotowanie kwasów nukleinowych do iniekcji

  1. Transgeneza z wykorzystaniem plazmidu Tol2 (na podstawie Fisher26).
    1. Przetrawić 10 µg plazmidu transpozazy (pCS-Tp)39 za pomocą 10 U enzymu NotI w dostarczonym buforze przez 1 hr w 37 °C w celu linearyzacji.
      Uwaga: Do uzyskania plazmidów Tol2 mogą być wymagane umowy o przekazaniu materiału (MTA).
    2. Wyekstrahować przetrawiony plazmid mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy w proporcjach 25:24:1 i przeprowadzić precypitację etanolem z octanem sodu zgodnie ze standardowymi protokołami40. Resuspendować plazmid w 50 µl wody wolnej od RNaz.
      Uwaga: Fenol i chloroform należy stosować pod wyciągiem, a odpady utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
    3. Przygotować reakcję transkrypcji Sp6 zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Oczyścić reakcję transkrypcyjną za pomocą zestawu do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta; resuspendować RNA w 50 µL wody wolnej od RNaz.
    5. Pobrać 1 µl alykwoy RNA. Podgrzać do 65 °C przez 5 min w celu denaturacji struktur drugorzędowych, a następnie niezwłocznie schłodzić na lodzie. Pozostałą część reakcji transkrypcyjnej zamrozić w temperaturze -80 °C.
    6. Rozdzielić alykwoy RNA na 1% żelu agarozowym w 0,5x buforze TAE (Tris base, kwas octowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy) z markerem wielkości RNA w jednej z linii. Oczekiwany produkt ma wielkość 2 20 bp; odrzucić próbkę, jeśli >5% całkowitego RNA pojawia się jako rozmycie (smear) mniejsze niż 2 20 bp, co wskazuje na rozległą degradację (Rysunek 1).
    7. Ilościowo oznaczyć RNA za pomocą spektrofotometru przy 260 nm. Rozcieńczyć do 350 ng/µl w wodzie wolnej od RNaz i przechowywać 1 µl alykwoy w -80 °C (stabilne przez co najmniej dwa lata).
    8. Sklonować plazmid reporterowy Tol2 (na przykład, używając pT2HE8 lub plazmidów z zestawu Tol241) z interesującym elementem regulacyjnym cis-. W skrócie: namnożyć PCR docelową sekwencję genomowego DNA za pomocą starterów zawierających miejsca restrykcyjne obecne w plazmidzie, przetrawić produkt PCR i wektor odpowiednim enzymem/enzymami, ligować insert do wektora i przeprowadzić transformację otrzymanego plazmidu do kompetentnych komórek E. coli40. Izolować plazmid za pomocą zestawu zawierającego etap płukania z endotoksyn zgodnie z protokołem producenta.
    9. Przeprowadzić drugą puryfikację plazmidu Tol2 za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR zgodnie z protokołem producenta. Eluować w 30 µl wody wolnej od RNaz.
      Uwaga: wydajność na tym etapie może być niska (czasami poniżej 50% plazmidu wejściowego).
    10. Rozcieńczyć plazmid do poziomu ~125 ng/µl w wodzie wolnej od RNaz.

Elektroforeza żelowa transkrypcji RNA, mRNA transpozazy, minimalna degradacja, drabinka RNA.
Rysunek 1. Żel z mRNA transpozazy. Oczyszczony produkt reakcji transkrypcji (1 µl) podgrzano do 65 °C, schłodzone na lodzie, a następnie rozdzielone w żelu agarozowym o stężeniu 1% z zastosowaniem 0,5x buforu TAE przy napięciu 10 V. Wielkości markerów RNA w kilobazach (kb) są wskazane po lewej stronie. Pełnowymiarowy mRNA transpozazy widoczny jest jako jasny prążek przy ~2,2 kb. Poniżej 2,2 kb widoczna jest niewielka, lecz dopuszczalna ilość zdegradowanego lub niekompletnego mRNA. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Transgeneza BAC (Techniki recombineeringu BAC – patrz Suster32,3)
    1. Wyizolować BAC z E. coli za pomocą zestawu do oczyszczania BAC zgodnie z protokołem producenta. Zastosować wytrącanie etanolem w celu odzyskania DNA poprzez standardową ekstrakcję octan sodu-etanol40 i resuspender DNA w stężeniu ~250 ng/µl w wodzie wolnej od RNaz.
    2. Przygotować mRNA transpozazy zgodnie z sekcją 1.1.
  2. Indukcja mutacji za pomocą TALEN (Projektowanie TALEN – patrz Cermak35)
    1. Użyć aplikacji internetowej do zaprojektowania TALEN dla genu docelowego42. Jeśli to możliwe, zaprojektować TALEN tak, aby przerwały miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego w celu ułatwienia analizy molekularnej.
    2. Sklonować TALEN i przygotować plazmidy do transkrypcji zgodnie z opublikowanym protokołem35.
    3. Przeprowadzić transkrypcję mRNA TALEN za pomocą reakcji transkrypcji Sp6 zgodnie z instrukcjami producenta i oczyścić mRNA w sposób opisany dla transpozazy w sekcji 1.1.4. Ilość określić za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć do stężenia 20 ng/µl w wodzie wolnej od RNaz. Próbkę mRNA TALEN poddać elektroforezie żelowej, aby upewnić się, że posiada ona prawidłowy rozmiar i nie uległa degradacji, zgodnie z opisem w kroku 1.1.6.
    4. Zaprojektować parę starterów PCR do amplifikacji około 10-200 bp otaczających sekwencję docelową TALEN, korzystając z narzędzia do projektowania starterów i sekwencji DNA docelowego43. Zamówić odpowiedni enzym restrykcyjny do badania obecności zmian w miejscu docelowym na podstawie kroku 1.3.1.
  3. Transgeneza CRISPR (Projektowanie i przygotowanie CRISPR – patrz Talbot i Amacher38):
    1. Zaprojektować i przygotować CRISPR oraz mRNA Cas9 zgodnie z protokołem38, a następnie zamówić odpowiednie startery weryfikacyjne i enzymy restrykcyjne, jak opisano w kroku 1.3.4.

2. Przygotowanie odczynników do wstrzykiwania

  1. Użyj kapilar borokrzemowych do przygotowania igieł zgodnie z poniższym opisem.
    Uwaga: kapilary te nie są standardowymi kapilarami stosowanymi do mikroiniekcji u danio pręgowanego; wykonane są z graszego i mocniejszego szkła, co jest kluczowe dla przebicia twardej otoczki jaj kolca.
    1. Podczas wyciągania igieł zawsze noś rękawiczki nitrylowe lub lateksowe i nie dopuszczaj do kontaktu igieł ze skórą lub tłuszczami skórnymi.
    2. Parametry wyciągania mikropipety określ empirycznie za pomocą testów rampowych zgodnie z instrukcjami producenta wyciągacza mikropipet. Na przykład, przy zastosowaniu włókna w przekroju kwadratowym, za optymalne uznano następujące parametry: (Heat = 515, Pull = 60, Velocity = 60, Delay = 85, Pressure = 50). Ustawienia te pozwalają uzyskać igłę, która zwęża się gwałtownie pod kątem około 12° na długości ~2 mm, a następnie posiada długie przedłużenie zwężające się pod kątem około 2° na długości ~6 mm (Rysunek 2).
      Uwaga: Odpowiednie parametry będą się różnić w zależności od urządzenia i włókna. Stosowanie programu bez wcześniejszego określenia parametrów poprzez testy rampowe może trwale zniszczyć włókno wyciągacza, którego wymiana jest trudna i kosztowna.
    3. Zgodnie z instrukcjami producenta wyciągnij co najmniej 4 igły mikropipet z borokrzemianowego szkła, stosując ustawienia określone w punkcie 2.1.2.
    4. Przechowuj igły pionowo w słoiku do przechowywania kapilar, ostrym końcem skierowanym w dół.
    5. Przed iniekcją umieść słoik do przechowywania kapilar na lodzie, aby schłodzić igły. Do słoika dodaj kawałek wilgotnego ręcznika papierowego, aby zapobiec odparowaniu po napełnieniu igieł.
  2. Zapłodnienie jaj (wszystkie etapy wykonywane w RT)
    1. Odbierz skrzydło jaj od ciążnej samicy kolca, delikatnie ściskając brzuch i przesuwając w kierunku od przedniej do tylnej części ciała, aby wypchnąć jaja przez kloakę do szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm2. Po jednej stronie szalki Petriego (nie dotykając jaj) umieść kawałek wilgotnego ręcznika papierowego, aby stworzyć komorę wilgotnościową. Nałóż pokrywkę na szalkę Petriego, aby jaja pozostały wilgotne.
    2. Uśmierć samca kolca w 0,025% Tricaine-S buforowanym 0,1% wodorowęglanem sodu.
    3. Rozetnij brzuch, wyjmij jądra i zmiażdż je w 250 µl roztworu Hanksa (pełny protokół przygotowania roztworu Hanksa znajduje się u Westerfield4).
    4. Zapłodnij maksymalnie 10 jaj przy użyciu 50 µl roztworu plemników i delikatnie zamieszaj końcówką pipety, aby upewnić się, że wszystkie jaja zostały zapłodnione. Jeśli skrzydło zawiera >10 jaj, zapłodnij pozostałą połowę później, aby zapewnić, że wszystkie embriony będą w stadium jednej komórki w momencie iniekcji. Jaja mogą pozostać niezapłodnione w RT do godziny, a plemniki zazwyczaj zachowują aktywność przez 1-7 dni w temperaturze 4 °C w roztworze Hanksa.
    5. Po zapłodnieniu trzymaj embriony pod pokrywką szalki Petriego, aby zapobiec wysychaniu. Odczekaj 20-25 min, aż pojawi się i napuchnie pierwsza komórka (w tym czasie przygotuj materiały do iniekcji).
    6. Napełnij szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm wodą dla kolców. (Aby przygotować wodę dla kolców, najpierw przygotuj 10% wodorowęglan sodu rozpuszczony w wodzie dejonizowanej. Następnie dodaj 3,5 g mieszanki sztucznej wody morskiej oraz 0,217 ml 10% wodorowęglanu sodu na 1 L wody dejonizowanej i intensywnie mieszaj/wstrząsaj, aby rozpuścić sól).
  3. Przygotowanie roztworu do iniekcji (podczas zapłodnienia jaj)
    1. Przygotuj roztwór do iniekcji zgodnie z Tabelą 1 i przechowuj na lodzie.
      Uwaga: stężenia niektórych kwasów nukleinowych zostały zwiększone w stosunku do wartości opublikowanych dla danio pręgowanego ze względu na większą objętość blastomeru kolca.
OdczynnikIniekcja Tol2Wstrzyknięcie BACiniekcja TALENIniekcja CRISPR
mRNA Tol2350 ng350 ng --
DNA150–20 ng plazmidu20–30 ng BAC--
mRNA TALEN--po 200 ng każdego -
 przewodnikowe RNA CRISPR---20 ng
mRNA Cas9---40 ng
0,5% czerwieni fenolowej w buforze PBS Dulbecco0.5 µl0.5 µl0.5 µl0.5 µl
woda wolna od RNazProszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. 5 µlProszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który należy przetłumaczyć. 5 µlProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 5 µlProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 5 µl

Tabela 1: Odczynniki do iniekcji. Wszystkie mieszaniny należy przygotować do całkowitej objętości 5 µl i przechowywać w lodzie.

  1. Napełnienie igieł (na lodzie; odczekać co najmniej 10 min na napełnienie igieł).
    1. Napełnić od tyłu co najmniej trzy igły, naniosając pipetą 0,5 µl roztworu do iniekcji na tępy koniec igły, gdy igły zwisają pionowo w słoiku do przechowywania kapilar. Należy uważać, aby kropla pozostała na górze i nie spłynęła po boku oraz unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
    2. Po tym, jak czerwony płyn w większości spłynie do ostrego końcówki igły, dodać kolejne 0,5 µl do tępego końca igły i pozwolić mu spłynąć.

3. Przygotowanie zestawu do wstrzykiwania i igły do mikroiniekcji

Uwaga: Kroki te można zazwyczaj wykonać po zapłodnieniu jaj.

  1. Włączyć oświetlenie prześwietlające mikroskopu dissecting i umieścić szklaną płytkę o wymiarach ~13 cm x 13 cm na podstawie oświetleniowej mikroskopu, a na niej brzeszczot piły gipsowej 15 cm7. Ustawić piłę prostopadle do aparatury do iniekcji, tak aby wcięcia były skierowane w stronę uchwytu igły.
  2. Włączyć dopływ powietrza i upewnić się, że regulator jest ustawiony na ciśnienie ~20 kPa.
  3. Włączyć panel sterowania i dostosować ustawienia. Ustawić ciśnienie na ~150-175 kPa. Ustawić czas trwania iniekcji na 180 msec.
  4. Poluzować uchwyt igły, włożyć napełnioną igłę do uchwytu, aż zostanie wyczuty opór gumowego mocowania, a następnie dokręcić ręcznie.
  5. Ustawić kąt nachylenia igły na około 45°.
  6. Za pomocą sterowników mikromanipulatora ustawić igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się w centrum pola widzenia. Powiększyć obraz do ~40X i ustawić ostrość na czubku igły, która nie powinna dotykać znajdującego się poniżej szkła.
  7. Ostrożnie odłamać czubek igły, chwytając go pęsetą zegarmistrzowską. Optymalnie nie należy łamać go prostopadle, lecz pod kątem ~60°. Odłamać fragment blisko czubka (nie dalej niż 2-3 szerokości pęsety od końca, Rycina 2).

Obraz mikroskopowy procesu zwężania włókna światłowodowego, ilustrujący metodę precyzyjnego zwężania końcówki.
Rysunek 2. Nieuszkodzone i uszkodzone igły do mikroiniekcji. Górna igła jest nienaruszona, natomiast końcówka dolnej igły została przełamana za pomocą pęsety (strzałka). Igły są wypełnione roztworem zawierającym 0,05% czerwieni fenolowej. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Kilka razy naciśnij pedał wtryskiwacza, aby sprawdzić, czy igła została złamana. Po kilku uderzeniach z końcówki powinny zacząć wypływać małe czerwone kropelki. Jeśli tak się nie stanie, spróbuj złamać igłę nieco wyżej.
  2. Jeśli w igle znajduje się pęcherzyk powietrza, zwiększ ciśnienie wsteczne i kilka razy szybko naciśnij pedał, aby usunąć pęcherzyk.
  3. Dostosuj ciśnienie wsteczne:
    1. Używając jednorazowej pipety transferowej, nanieś kilka kropel wody z kolca na płytkę szklaną.
    2. Ostrożnie zanurz igłę w wodzie.
    3. Zwiększ ciśnienie wsteczne, aż z igły zacznie wypływać słaby strumień różowego płynu (co wskazuje na występowanie ciśnienia dodatniego).
      Uwaga: Jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt niskie, igła wciągnie cytoplazmę poprzez działanie kapilarne. Jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt wysokie, objętość wtrysku może być przypadkowo zbyt duża.
    4. Cofnij igłę tak daleko, jak to możliwe, aby nie uległa ona uszkodzeniu podczas przygotowywania embrionów (patrz poniżej).
  4. Alternatywnie można ustawić ciśnienie wsteczne na wyższą wartość, tak aby podczas zanurzenia igły w wodzie wypływał z niej stały, silny strumień płynu. Wówczas naciskanie pedału w celu wstrzyknięcia staje się zbędne; jednak wtryskiwanie musi zostać wykonane szybko, aby uniknąć podania zbyt dużej ilości płynu.
    Uwaga: Nie stosuj tej techniki podczas pierwszej nauki wtryskiwania.

4. Mikrowstrzykiwanie

  1. Około 25 min po zapłodnieniu, za pomocą dwóch końcówek pipety 10 µl, należy wyjąć 5-10 embrionów z gromady i przenieść je na szklaną płytkę.
  2. Nadal używając końcówek pipety, należy delikatnie rozdzielić embriony do poszczególnych wgłębień piły. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić embrionów.
  3. Używając pipety transferowej z odciętym końcem, aby embriony kolcolasa zmieściły się wewnątrz, należy dodać odpowiednią ilość wody z akwarium kolcolasa, aby przykryć embriony, pozostawić wodę na 3-5 s, a następnie usunąć nadmiar wody pipetą, pozostawiając małą objętość wody pokrywającej każdy embrion.
    Uwaga: Zbyt duża ilość wody spowoduje utwardzenie chorionów i złamanie igły, jednak mała objętość wody jest niezbędna do oddzielenia chorionu od komórki i żółtka (Rycina 3A-B).
  4. Zaczynając od najdalej oddalonego embrionu, należy przesunąć szklaną płytkę i zwiększyć powiększenie tak, aby pierwszy embrion wypełniał około 25% pola widzenia.
  5. Należy opuścić igłę do pola widzenia, a następnie za pomocą końcówki pipety 10 µl delikatnie obracać embrion, aby zidentyfikować blastomer — ziarnistą, lekko żółtą, wypukłą grudkę cytoplazmy na szczycie żółtka (Rycina 3B), a następnie obrócić go tak, aby blastomer znajdował się prostopadle do końca igły (trzymając embrion we wgłębieniu piły, Rycina 3C).
    Uwaga: kropelki żółtka mogą przemieszczać się podczas obracania embrionu, dlatego nie należy ich używać jako punktu odniesienia dla lokalizacji blastomeru.
  6. Należy wprowadzić igłę do cytoplazmy, ale nie przebijać jej aż do znajdującego się poniżej żółtka. Podczas przebijania chorionu należy naciskać powoli i równomiernie, aby uniknąć złamania igły. Jeśli igła mocno się wygnie, należy ją wycofać i spróbować ponownie w nieco innym miejscu.
  7. Należy nacisnąć pedał 3-4 razy, aby wstrzyknąć materiał w taki sposób, by czerwony bolus o lekko rozmytych krawędziach wypełniał około ~1/8 średnicy cytoplazmy (patrz Rycina 3D).
    1. Należy unikać uzyskania czerwonego bolusa o ostrych krawędziach, które nie zaczynają dyfundować, co wskazuje na wstrzyknięcie do żółtka pod cytoplazmą (Rycina 3E).
    2. Jeśli jasnoróżowo-czerwona plamka szybko dyfunduje, należy wprowadzić igłę głębiej, aby przebić blastomer.
    3. Jeśli bolus wstrzyknięty natychmiast zmieni kolor na żółty, należy obrócić embrion, aby upewnić się, że celem był blastomer, i wstrzyknąć ponownie (Rycina 3F).

Metoda wstrzykiwania do cytoplazmy; schemat przedstawiający wstrzyknięcia idealne, suboptymalne i nieudane.
Rycina 3. Wygląd zarodków kolczatka przed i po wstrzyknięciu. Wszystkie embriony zostały przedstawione z perspektywy widoku przez mikroskop (z wyjątkiem C' i G). (APrzed dodaniem wody zapłodcone zarodki mają jednolity wygląd, z kropelkami tłuszczu unoszącymi się w górnej części żółtka.B) Po dodaniu wody chorion pęcznieje, odsłaniając blastomer, który wystaje z żółtka i jest widoczny z profilu. (C) Obrót zarodka w taki sposób, aby igła wniknęła prostopadle do trofoblastu i blastomeru. (C'Widok boczny igły, która przebiła chorion, z końcówką znajdującą się w cytoplazmie.DWstrzyknięcie do cytoplazmy skutkuje powstaniem czerwonej plamki o rozproszonych krawędziach, która z czasem blednie.EWstrzyknięcie w żółtko znajdujące się pod cytoplazmą skutkuje powstaniem czerwonej plamki o wyraźnych krawędziach.FWstrzyknięcie w miejsce przeciwległe do cytoplazmy w żółtku powoduje zmianę barwy z czerwonej na żółtą, wywołaną zmianą pH.G) Widok boczny efektów wstrzyknięcia, z oznaczeniami X w miejscach wstrzyknięć nieoptymalnych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Używając sterowników mikromanipulatora, wycofaj igłę; jeśli zarodek przywrze do igły, przytrzymaj go końcówką pipety 10 µl.
  2. Po wycofaniu igły przesuń szklaną płytkę, aby ustawić kolejny zarodek w osi igły.
  3. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków użyj pipety transferowej, aby dodać wodę do zarodków, a następnie zbierz je do pipety transferowej i umieść w 150 mm szalce Petriego wypełnionej wodą dla pławkonogów.
  4. Osusz szklaną płytkę ręcznikiem papierowym, aby uniknąć nagromadzenia zbyt dużej ilości wody.
  5. Rozmieść świeże zarodki na podłożu i powtórz kroki od 4.4 do 4.10.
  6. Zachowaj ~10% zarodków jako niekontrolowane grupy kontrolne (niewstrzyknięte), aby upewnić się, że zarodki niewstrzyknięte rozwijają się prawidłowo, oraz aby wykorzystać je jako kontrole typu dzikiego w opisanych poniżej analizach molekularnych.

5. Opieka po wstrzyknięciu

  1. Inkubować zarodki w szalkach Petri w temperaturze 18 °C po wstrzyknięciu aż do wyklucia10. Po wykluciu hodować larwy w akwariach zgodnie z opisem10.
  2. Ostrożnie odlać wodę z ryb ukłuć jeden dzień po wstrzyknięciu i zastąpić ją świeżą wodą z ryb ukłuć. Od tego momentu wymieniać wodę na świeżą co najmniej co drugi dzień.
  3. Codziennie sprawdzać, czy nie ma martwych lub zdeformowanych zarodków. Usuwać takie zarodki, aby zapobiec zanieczyszczeniu wody produktami rozkładu.

6. Analiza wyników wstrzykiwania

  1. W przypadku wstrzykiwania reporterów fluorescencyjnych należy codziennie monitorować embriony w zaciemnionym pomieszczeniu, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z filtrem GFP lub RFP (zależnie od fluorescencyjnego transgenu). Anatomiczne wzorce ekspresji genu należy rejestrować za pomocą fotografii cyfrowych i/lub opisów pisemnych oraz tabelarycznego zestawienia liczby ryb z różnymi domenami ekspresji (Rysunki 4 i 5).
    Uwaga: Pigaczowate posiadają autofluorescencyjne, gwiaździste komórki pigmentowe, które są widoczne pod filtrami GFP od 4 dni po zapłodnieniu (dpf).
    1. Aby stworzyć linie stabilne, należy zachować embriony z wykrywalną fluorescencją i hodować je do wieku dorosłego zgodnie z opisem10.
    2. Dorosłe ryby po wstrzyknięciu należy skrzyżować z rybami typu dzikiego, stosując procedurę zapłodnienia in vitro opisaną w sekcji 2.2, a następnie przesiewać potomstwo pod kątem fluorescencji zgodnie z opisem w punkcie 6.1, aby zidentyfikować fluorescencyjne potomstwo, co wskazuje na udaną transmisję transgenu.
    3. Aby zwizualizować fluorescencję w wyklutych, swobodnie pływających larwach, należy dodać 50 µl 0,8% Tricaine do 150 mm szalki Petriego w celu znieczulenia ryb i poczekać, aż ryby przestaną się poruszać, przed wykonaniem obrazowania. Bezpośrednio po obserwacji i obrazowaniu należy kilkukrotnie przepłukać ryby świeżą wodą dla pigaczowatych.
    4. Opcjonalnie, aby zachować fluorescencję do dalszego obrazowania, należy eutanazować larwy w 0,025% (250 mg/L) Tricaine buforowanym 0,1% wodorowęglanem sodu i utrwalać przez 4 h w 4% paraformaldehydzie w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) w temperaturze 4 °C. Przechowywać w 1x PBS do dwóch tygodni.
      Uwaga: Autofluorescencja tła zwiększa się wraz z upływem czasu.
  2. Diagnostyczny PCR/trawienie w celu genotypowania indukcji mutacji za pomocą CRISPRs lub TALENs — najlepiej przeprowadzić w 2 dni po zapłodnieniu.
    1. Za pomocą pipety transferowej umieścić 10 wstrzykniętych embrionów (2 dpf, nadal w chorionach) w pierwszych 10 dołkach paskowej probówki PCR z 12 dołkami. W dwóch ostatnich dołkach umieścić ryby kontrolne niewstrzyknięte.
    2. Usunąć nadmiar wody dla pigaczowatych.
    3. Do każdego dołka dodać 50 µl buforu lizującego (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,3% Tween-20 oraz 0,3% NP-40).
    4. Zamknąć probówki i inkubować w temperaturze 95 °C przez 20 min w termocyklerze.
      Uwaga: Po etapie gotowania żółtko stanie się białe i gumowate.
    5. Zdjąć nakrętki i użyć innego, czystego końcówki do pipety 1 0 µl, aby rozgnieść embrion w każdej probówce.
      Uwaga: Białe szczątki zbiorą się na dnie probówki.
    6. Do każdego dołka dodać 2,5 µl proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml.
    7. Zamknąć probówki i inkubować w temperaturze 5 °C przez 1 h w celu strawienia białek, a następnie w 95 °C przez 20 min, aby inaktywować proteinazę K. Przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć wzrostu pleśni.
    8. Przeprowadzić PCR przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności zgodnie z instrukcją producenta. Jako matrycy DNA należy użyć lizatu embrionu.
      Uwaga: Należy uważać, aby pobrać ciecz z górnej części probówki jako matrycę DNA, unikając widocznych fragmentów chorionu lub żółtka na dnie probówki.
    9. Produkt PCR zmieszać w równym stosunku objętości z master miksem enzymu restrykcyjnego zawierającym 1x bufor specyficzny dla enzymu i 0,25 µl enzymu na próbkę. Zawsze należy zachować połowę nieciętego produktu PCR do analizy na żelu w celu potwierdzenia, że produkty PCR mają przewidywany rozmiar. Inkubować mieszaninę PCR z enzymem w warunkach odpowiednich dla danego enzymu restrykcyjnego.
      Uwaga: Niektóre enzymy mogą wymagać innych stosunków buforu enzymatycznego do produktu PCR; należy skorygować stężenie buforu, jeśli kontrole niewstrzyknięte nie wykazują całkowitego strawienia.
    10. Po strawieniu przenieść produkty na 1% żel agarozy obok drabinki wielkości DNA, aby potwierdzić oczekiwane rozmiary produktów.
      Uwaga: Niecięte prążki wstrzykniętych embrionach wskazują na obecność zmian molekularnych (Rysunek 6), a kontrole niewstrzyknięte muszą być w pełni strawione, aby móc interpretować wyniki.
    11. Aby potwierdzić zmiany, należy wyciąć niecięte prążki z żeli agarozowych i oczyścić DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Do potwierdzenia zmian należy zastosować sekwencjonowanie metodą Sangera, najlepiej z użyciem primera sekwencyjnego wewnętrznego względem primerów PCR. W wstrzykniętych embrionach F0 prawdopodobnie obecna będzie mieszanina zmian, co spowoduje pogorszenie jakości odczytu Sangera w pobliżu miejsca docelowego.
    12. Aby wytworzyć linię stabilną, należy zachować wszystkie wstrzyknięte embriony z miotów, które w przesiewie wykazały obecność zmian molekularnych. Wyhodować ryby, przeprowadzić krzyżowanie, a następnie przesiewać podzbiór embrionów F1 pod kątem zmian molekularnych zgodnie z opisem w punktach 6.2.1–6.2.1. Jeśli zidentyfikowano nosicieli heterozygotycznych, należy wyhodować pozostałe embriony F1 do wieku dorosłego i zidentyfikować osobniki heterozygotyczne przy użyciu DNA wyekstrahowanego z wycinka płetwy ogonowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku transgenów genu reporterowego wykazujących aktywność enhansera, udana iniekcja doprowadzi do specyficznej, komórkowej ekspresji transgenu (Ryc. 4A, 4C). Iniektowane ryby mogą następnie zostać poddane krzyżówkom wstecznym w celu wytworzenia stabilnych linii (przykład stabilnej linii BAC przedstawiono na Ryc. 4B). Iniekcja DNA do embrionów kolca wschodniego zazwyczaj skutkuje znacznie wyższą śmiertelnością niż w przypadku samego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wstrzykiwanie jednokomórkowych zarodków ciernika w celu transgenezy lub edycji genomu wiąże się z trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, w porównaniu z zarodkami danio pręgowanego, embrionalna kosmówka ciernika jest twarda i często łamie igły. Problem ten można częściowo rozwiązać, stosując grubsze i mocniejsze szklane mikropipety i wstrzykując je prostopadle do kosmówki (patrz protokół, ryc. 2). Upewnienie się, że do zarodków dodaje się jak najmniej wody (tylko tyle, aby kosmówka pęcznieje i odrywa si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH R01 #DE021475 (CTM), NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE) oraz NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Dziękujemy Kevinowi Schwalbachowi za przeprowadzenie rekombinacji i wstrzyknięć BAC, Nickowi Donde za wygenerowanie danych sekwencjonowania CRISPR Sanger oraz Katherine Lipari za pomocne informacje zwrotne na temat protokołu iniekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy z transilluminacjąLeicaS6e/ KL300 LED
Ręczny mikromanipulatorStosowane oprzyrządowanie naukoweMM33Marzhauser M33 Mikromanipulator
System pomiaru ciśnieniaStosowane oprzyrządowanie naukoweMPPI-3
Jednostka ciśnienia zwrotnegoStosowane oprzyrządowanie naukoweBPU
Zestaw uchwytów do mikropipetStosowane oprzyrządowanie naukoweMPIP
Magnetyczny uchwyt podstawyStosowane oprzyrządowanie naukowePodstawa
Przełącznik nożnyStosowane oprzyrządowanie naukoweFSW
Żelazna płyta (podstawa magnetyczna)NarishigeIP
Płonący/brązowy ściągacz do mikropipetInstrumentSutterP-97
Jednorazowe pipety transferoweFisher13-711-7M
0,5% czerwieni fenolowej w DPBSSigma P0290znacznik iniekcyjny
#5 kleszcze, biologia dumoxel Fine Science Tools11252-30do łamania igieł
Słoik do przechowywania mikropipetWorld Precision InstrumentsE210mieści igły
6", 6 zębów na cal piła do płyt kartonowo-gipsowychLenox20571 (S636RP)trzymaj jaja do wstrzykiwań
13 cm x 13 cm szklana płytadowolny sklep z narzędziami-kapilary
ze szkła borokrzemianowego, 1,0 mm OD/0,58 mm ID World Precision Instruments1B100-F4*twardsze szkło niż kapilary iniekcyjne danio pręgowanego
150 x 15mm szalka PetriegoFisherFB0875714wychowywać zarodki ciernika
35 mm x 10 mm szalka PetriegoFisher08-757-100Aprzechowywać jaja przed wstrzyknięciem
Instant Ocean SaltInstant OceanSS15-10
Wodorowęglan soduSigmaS5761-500G
Metanosulfonian trikainy/MS-222Western Chemical IncMS222znieczulenie/eutanazja
ryb Zestaw do transkrypcji Sp6AmbionAM1340Do transkrypcji TALEN-ów i transpozazy mRNA
Zestaw do czyszczenia RNeasyQiagen74104oczyszcza transpozazę lub TALEN RNA
Zestaw do czyszczenia QiaQuick PCRQiagen28104oczyszcza plazmidy dla iniekcja
Proteinaza K 20 mg/mlAmbionAM2546do preparacji DNA
Zestaw Nucleobond BAC 100Clontech740579do preparatu DNA BAC
NotINEBR0189L
Polimeraza PhusionFisherF-530L
Zestaw Qiagen PlasmidPlus MidiQiagen12943zawiera bufor do płukania endotoksyn
QIAQuick Ekstrakcja żeluQiagen28704 do sekwencjonowania mutacji wywołanych
Fenol:chloroform:Alkohol izoamylowySigmaP2069-100ML
Octan soduSigmaS2889-250G
Etanol (klasa biologii molekularnej)SigmaE7023-500ML
AgarozaSigmaA9539
50x Bufor tris-octan EDTAThermoFisherB49
0,5-10 Kb drabinkaRNAThermoFisher15623-200
Nanokropla  SpektrofotometrThermo ScientificNanodrop 2000
ParaformaldehydSigma158127-500G
10x PBSThermoFisher70011-044
1 kb Plus Drabinka DNAThermoFisher10787-018
Chlorek potasuSigmaP9541-500G
Chlorek magnezuSigmaM8266-100G
NP-40ThermoFisher28324
Tween 20SigmaP1379-500ML
Tris pH 8,3TeknovaT1083
12-paskowa probówka do PCRThermo ScientificAB-1113
magnetyczna

Bibliografia

  1. Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
  2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
  3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
  4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
  5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
  6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
  7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  8. O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290(2015).
  9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
  10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).
  11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
  12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
  13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
  14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).
  15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
  16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
  17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
  18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
  19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
  20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
  21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
  24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
  27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
  29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
  30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
  31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
  32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).
  34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  40. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
  42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
  43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).
  44. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
  45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
  46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zarodki kolcolawatechnika mikroiniekcjizastosowania transgenezytranspozaza Tol2TALEN CRISPRiniekcja blastomer wpenetracja chorionuekspresja transgenulinie stabilne

Powiązane artykuły