Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54056

⸱

7 maja 2016

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Szkielet rozgałęziony, w tym grabie skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe, służy jako główne miejsce przetwarzania żywności u większości ryb. Tutaj opisujemy protokół preparowania i płaskiego montażu tego wewnętrznego szkieletu u cierników trójgrzbietowych. Ta metoda ma również zastosowanie do wielu innych gatunków ryb.

Streszczenie

Tylne segmenty gardłowe głowy kręgowca dają początek szkieletowi rozgałęzionemu, głównemu miejscu przetwarzania żywności u ryb. Morfologia szkieletu skrzelowego ryby jest dopasowana do diety gatunku. Ciernik trójkolczasty (Gasterosteus aculeatus) pojawił się jako system modelowy do badania genetycznych i rozwojowych podstaw wyewoluowanych różnic w różnych cechach. Morskie populacje cierników wielokrotnie kolonizowały niezliczone nowe słodkowodne jeziora i potoki. Adaptacja do nowej diety w tych słodkowodnych środowiskach prawdopodobnie leży u podstaw serii zmian twarzoczaszki, które wielokrotnie ewoluowały w niezależnie wyprowadzonych populacjach słodkowodnych. Należą do nich trzy główne zmiany w szkielecie skrzelowym: zmniejszenie liczby i długości kości skrzeli, zwiększenie liczby zębów gardłowych i zwiększenie długości kości skrzelowych. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół preparowania i płaskiego montażu wewnętrznego szkieletu rozgałęzionego u cierników trójgrzbietowych. Rozwarstwienie całego trójwymiarowego szkieletu rozgałęzionego i zamontowanie go płasko w dużej mierze dwuwymiarowym preparacji pozwala na łatwą wizualizację i kwantyfikację morfologii szkieletu skrzelowego. Ta metoda preparacji jest niedroga, szybka, stosunkowo łatwa i ma zastosowanie do wielu różnych gatunków ryb. W przypadku cierników ta skuteczna metoda umożliwia ilościowe określenie morfologii szkieletu w krzyżówkach genetycznych w celu zmapowania regionów genomu kontrolujących wzorzec twarzoczaszki.

Wprowadzenie

Niesamowita różnorodność występuje w szkielecie głowy wśród kręgowców, zwłaszcza wśród ryb. W wielu przypadkach ta różnorodność ułatwia różne strategie żywieniowe 1-4 i może wiązać się z poważnymi zmianami zarówno w zewnętrznym, jak i wewnętrznym wzorcu twarzoczaszki. Szkielet skrzelowy znajduje się wewnętrznie w gardle ryby i otacza większość jamy policzkowej. Szkielet rozgałęziony składa się z 5 szeregowo homologicznych segmentów, z których przedni cztery podtrzymują skrzela. Razem te pięć segmentów funkcjonuje jako interfejs między rybami a ich pokarmem5. Różnorodność wielu cech, w tym grabie skrzelowe, zęby gardłowe i kości skrzelowe, przyczynia się do wydajnego żerowania na różnych rodzajach pokarmu.

Cierniki przeszły adaptacyjną radiację po tym, jak przodkowie formy oceaniczne skolonizowały słodkowodne jeziora i potoki na całej półkuli północnej. Zmiana diety z małego zooplanktonu w oceanie na większą zdobycz w wodach słodkich spowodowała dramatyczną zmienność troficzną kilku cech twarzoczaszki6. Podczas gdy wiele badań koncentrowało się na zewnętrznych różnicach w twarzorośli u cierników 7-13, ważne zmiany twarzoczaszki ewoluują wielokrotnie w wewnętrznym szkielecie skrzelowym. Zdolność do tworzenia płodnych hybryd między morfologicznie odrębnymi populacjami ciernika stanowi doskonałą okazję do zmapowania genetycznych podstaw wyewoluowanych zmian w szkielecie skrzelowym.

Jedną z cech troficznych o znaczeniu ekologicznym jest wzór grabi skrzelowych, okresowych kości skórnych, które wyściełają przednią i tylną powierzchnię kości skrzelowych i są używane do filtrowania zdobyczy. Ryby, które zazwyczaj żywią się małymi zdobyczami, mają zwykle dłuższe i gęściej rozmieszczone grabie skrzelowe w porównaniu z rybami, które żywią się większą zdobyczą14,15. Zmienność grabiarek skrzelowych odnotowano zarówno w obrębie gatunków14-19, jak i między nimi, a aspekty wzoru grabienia skrzeli przyczyniają się do nisz troficznych i sprawności16. Dziesięciolecia badań obszernie udokumentowały zmienność liczby i długości cierników skrzelowych wwieku 17-21 lat; Jednak badania te zazwyczaj koncentrują się na pierwszym rzędzie zgrabiarek skrzelowych. Niedawne prace wykazały modułowość w genetycznej kontroli liczby zgrabiarek skrzelowych w całym szkielecie skrzelowym22,23 oraz w pojedynczym rzędzie w odstępach między zgrabiarkamiskrzelowymi 23 i długości24, podkreślając znaczenie badania więcej niż pierwszego rzędu lub pojedynczego zgrabiarki skrzelowej w celu zrozumienia rozwojowych podstaw genetycznych redukcji zgrabiarek skrzelowych.

Drugą cechą troficzną, zarówno ekologiczną, jak i biomedyczną, jest wzór zębów gardłowych. Zęby u ryb mogą znajdować się zarówno w szczęce ustnej, jak iw szkielecie skrzelowym, znanym jako zęby gardłowe. Zęby jamy ustnej służą przede wszystkim do chwytania zdobyczy, podczas gdy zęby gardłowe służą do żucia i manipulacji zdobyczą25-27. Oba zestawy powstają poprzez wspólne mechanizmy rozwojowe i są uważane za rozwojowo homologiczne28. Interesująca modularność występuje w sytuacji, gdy niektóre gatunki, takie jak danio pręgowany, nie mają zębów gardła ustnego i grzbietowego29, podczas gdy inne gatunki mają wiele ząbkowanych ceratobranchiów, gardłowych, a czasem ząbkowanych podstawnych i hiposkrzeli30. U cierników zęby gardłowe znajdują się brzusznie na piątym odcinku ceratobranchialnym i grzbietowo na przednim i tylnym gardle31. Kinematyka karmienia ciernika pokazuje, że szczęka ustna jest używana głównie do chwytania zdobyczy i ułatwiania karmienia ssącego9, pozostawiając żucie do szczęki gardłowej. U pielęgnic morfologia żuchwy dolnego gardła różni się znacznie32,33 i wykazano, że jest adaptacyjna i skorelowana z niszą troficzną34. Wiele populacji ciernika słodkowodnego wyewoluowało dramatyczny wzrost liczby zębów brzusznych gardła23,35,36. Niedawne prace wykazały, że genetyczna podstawa rozwojowa tego wyewoluowanego przyrostu zębów jest w dużej mierze odmienna w dwóch niezależnie pochodzących populacjach cierników słodkowodnych36. W przeciwieństwie do zębów ssaków, ryby regenerują zęby w sposób ciągły przez całe dorosłe życie37. Obie te wcześniej opisane populacje słodkowodne o wysokim ząbkowaniu wyewoluowały przyspieszone tempo wymiany zębów, zapewniając rzadki system kręgowców do badania genetycznych podstaw regeneracji.

Trzecią cechą troficzną, która wielokrotnie ewoluowała u cierników słodkowodnych, są dłuższe kości epibranchialne i ceratobranchialne, segmentowe homologi górnej i dolnej szczęki, odpowiednio38. Dłuższe kości skrzelowe nadają większą jamę policzkową i prawdopodobnie są adaptacyjne, aby umożliwić spożywanie większych zdobyczy. Ponadto u innych ryb kości nadgałęzione są ważne dla zagłębienia grzbietowych płytek zębowych gardła25. Podobnie jak skrzela i zęby gardłowe, kości skrzelowe są wewnętrzne, a zatem trudne do łatwej wizualizacji lub określenia ilościowego.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do preparowania i płaskiego montażu szkieletu rozgałęzionego, co pozwala na łatwą wizualizację i kwantyfikację różnych ważnych cech twarzoczaszki. Podczas gdy ten protokół opisuje sekcję ciernika, ta sama metoda działa na wielu innych rybach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace z rybami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley (numer protokołu R30). Eutanazję przeprowadzono poprzez zanurzenie w 0,025% Tricaine-S buforowanym 0,1% wodorowęglanem sodu39. Wszystkie etapy są wykonywane w temperaturze pokojowej.

1. Przygotowanie

Uwaga: Kroki 1.1-1.5 należy przeprowadzić w probówkach stożkowych lub fiolkach scyntylacyjnych, które można szczelnie zamknąć i ułożyć poziomo. Ryby nie wymagają ciągłego wstrząsania, jednak należy starać się mieszać roztwór tak często, jak to możliwe, delikatnie odwracając lub potrząsając statywem z probówkami lub fiolkami, aby wszystkie strony ryb miały kontakt z roztworem barwiącym i aby barwnik mógł równomiernie wniknąć w tkankę. Nie należy umieszczać dużych partii ryb na wstrząsarce platformowej, ponieważ duża masa cieczy może doprowadzić do uszkodzenia urządzenia.

  1. Utrwal świeżo uśpione ryby lub ryby przechowywane w etanolu w 10% neutralnej buforowanej formalinie (NBF) przez noc. Alternatywnie, zamiast 10% NBF można zastosować 4% paraformaldehyd w roztworze 1x PBS.
    Uwaga: W przypadku ekstrakcji DNA należy przed utrwaleniem odciąć niewielki fragment płetwy ogonowej lub piersiowej i przechowywać go w etanolu.
  2. Usunąć utrwalacz w odpowiedni sposób w dygestorium chemicznym i zastąpić go wodą z kranu (o pH ~7,0) na 2 h. Należy unikać stosowania wody dejonizowanej, ponieważ często jest ona kwasowa i może doprowadzić do dekalcyfikacji kości.
  3. Odlać wodę i barwić ryby 0,08% roztworem Alizarin Red S w 1% KOH w wodzie przez 24 h. Dla ryb o długości standardowej poniżej 20 mm należy zastosować 0,04% Alizarin Red S. (Należy przygotować 10-krotny (0,8%) roztwór zapasowy Alizarin Red S, który można następnie rozcieńczyć).
  4. Usunąć barwnik (przelewając go do odpowiedniego pojemnika na odpady w dygestorium) i umieścić ryby w wodzie z kranu na kilka godzin. Wymieniać wodę w razie potrzeby, aż do momentu, gdy woda z płukania będzie prawie przejrzysta.
  5. Odlać wodę i umieścić ryby w 50% glicerolu z 0,25% KOH w celu lekkiego przejaśnienia i późniejszej sekcji.
    Uwaga: Niniejszy protokół barwienia jest modyfikacją metod opisanych wcześniej40,41.

2. Disekcja

Uwaga: Patrz Rycina 1 w celu przeanalizowania odpowiedniej morfologii szkieletu głowy.

Schemat anatomiczny czaszki ryby; opisane kości: Fron, Nas, Max; narzędzie do analizy strukturalnej.
Rysunek 1: Morfologia szkieletu głowy kolca. Głowa kolca dwuzybowego barwiona alizaryną czerwoną, obrazowana z wykorzystaniem fluorescencji przy użyciu zestawu filtrów dla rhodaminy B. Oznaczono istotne elementy morfologiczne: Op = operculum (pokrywa skrzelowa), Subop = suboperculum (podpokrywa skrzelowa), BSRs = promienie skrzelowe, Preop = preoperculum (przedszyba skrzelowa), Infraorb 1-3 = kości podoczodołowe 1-3 (zwane również okołoczodołowymi lub podoczodołowymi), Dent = kość żuchwy dolnej, Premax = kość przedmaxylarna, Max = kość maxylarna, Nas = kość nosowa, Lat. ethm = kość sitowa boczna, Psph = kość parasfenoidalna, Fron = kość czołowa. Bardziej szczegółowy opis szkieletu głowy kolca dwuzybowego znajduje się w pracy Anker (1974)31. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Połóż rybę płasko (Rycina 2A) i wprowadź ostre pęsety zegarmistrzowskie nr 5 do boku oka pod kątem ~45°, aby przebić błonę pokrywającą oko.
  2. Oddziel błonę od oka, podobnie jak przy odrywaniu wieczka od jogurtu (Rycina 2B).
  3. Wprowadź otwartą pęsetę za oko, chwyć nerw wzrokowy za oczem i usuń oko (Rycina 2C). Nie przebijaj oka, ponieważ wycieknie z niego melanina. W przypadku przebicia, melaninę można wypłukać podczas późniejszych etapów.
  4. Powtórz czynność po drugiej stronie.
  5. Zaczynając od strony tylnej, umieść jedno ostrze małych nożyczek sekcyjnych pod pokrywą skrzeli, przesuń ostrze grzbietowo nad pokrywą, a następnie przetnij tkankę miękką aż do oczodołu (Rycina 2D). Przetnij tkankę grzbietowo względem kości pokrywy.
  6. Przetnij kość czołową (grzbietowo względem oczodołu) (Rycina 2E).
  7. Przetnij w linii środkowej kość parasfenoidalną w okolicy centrum oczodołów (Rycina 2F).
  8. Powtórz cięcie pokrywy po przeciwnej stronie.
  9. Wprowadź pęsetę pod pokrywę i powoli odrywaj twarz od ciała, przycinając wszelkie wciąż przytwierdzone tkanki miękkie (Rycina 2G-H). Należy uważać, aby nie uszkodzić pierwszego rzędu tyczek skrzelowych.
    1. Za pomocą pęsety oddziel cerato-hyale po obu stronach od basihyalu w linii środkowej, jednocześnie odrywając i usuwając przedni szkielet czaszowo-twarzowy (całą szczękę, w tym kostkę żuchwowe, przedmaxillę i maxillę; cały szkielet hyoidalny, w tym zewnętrzną dermalną pokrywę, przedpokrywę, podpokrywę i promienie branchiostegalne oraz leżące pod nimi grzbietowe i brzuszne elementy endochondralne; oraz przednią część czaszki, w tym kości nosowe, boczny etmoid i kości podoczodołowe, patrz Ryciny 1 i 2I).
    2. Kolce miedniczne można odchylić od ciała, co w przypadku ich obecności może służyć jako uchwyt dla pęsety. Kolce blokują się w jednej pozycji. Aby je odblokować, delikatnie pociągnij kolca pęsetą bezpośrednio od ciała ryby, a następnie delikatnie zegnij go w stronę tylną, aby docisnąć go płasko do ryby.
  10. Wprowadź zamkniętą pęsetę tylnie i brzusznie względem szkieletu skrzelowego (tuż poniżej przewodu pokarmowego) i przesuń pęsetę przednio, rozdzielając pozostałe mięśnie i więzadła przytwierdzone do szkieletu skrzelowego (Rycina 2J-K).
  11. Używając końcówek zamkniętej pęsety, zeskrob mięśnie łączące grzbietowy szkielet skrzelowy z brzuszną częścią skrzyni mózgowej w kierunku od tyłu do przodu (Rycina 2L).
  12. Powtórz kroki 2.9 i 2.10 po przeciwnej stronie.
  13. Chwyć podstawę przewodu pokarmowego i pociągnij do przodu, aby usunąć szkielet skrzelowy i przewód pokarmowy (Rycina 2M-N).
  14. Oddziel przewód pokarmowy, wykonując cięcie prostopadłe tylnie względem końca piątego ceratobranchialu (Rycina 2O).
  15. Po usunięciu wszelkich pozostałych fragmentów kości ze skrzyni mózgowej na grzbietowej stronie szkieletu skrzelowego, wprowadź nożyczki do koszyka skrzelowego, aby wykonać cięcie grzbietowe (od przodu do tyłu) między obustronnymi zestawami grzbietowych płytek zębowych (Rycina 3A-D). Upewnij się, że cięcie jest wycentrowane, aby uniknąć uszkodzenia grzbietowych płytek zębowych.
  16. Wykonaj dwa płytkie cięcia boczne w gumowatym świetle przewodu pokarmowego na tylnym końcu szkieletu skrzelowego (przednim końcu przewodu pokarmowego), aby ułatwić otwarcie szkieletu skrzelowego (Rycina 3E).
  17. Umieść rybę i wszystkie fragmenty tkanek w słoiku, a szkielet skrzelowy przełóż do probówki do mikrocentryfugi z 50% glicerolem i 0,25% KOH w celu kontynuowania delikatnego przejaśniania lub do 100% glicerolu, jeśli dalsze przejaśnianie nie jest wymagane. Oznacz słoiki i probówki unikalnym identyfikatorem w celu ich śledzenia. Wymagana ilość przejaśniania zależy głównie od rozmiaru ryby; duże dorosłe ryby (o długości standardowej powyżej 40 mm) zazwyczaj wymagają dodatkowego przejaśniania.

Schemat procesu sekcji; kroki z wykorzystaniem narzędzi do oddzielania, cięcia i skrobania tkanek preparatu.
Rycina 2: Disekcja szkieletu skrzelowego kolca. Ryby z gatunku kolczuch trójcierniowy barwione alizaryną czerwoną, przygotowane do sekcji. Oko jest odbarwione w wyniku rozległego przejaśniania. Niebieskie strzałki wskazują kierunek ruchu.AWidok boczny głowy kłobuka, przód znajduje się po prawej stronie.B) Usunięcie błony pokrywającej oko. (C) Usunięcie oka. (D) Cięcie grzbietowe powyżej pokrywy skrzeli. (E) Przecięcie kości czołowej. (F) Przecięcie kości rozdzielnej. (G-I) Usunięcie szkieletu twarzy. (J) Usunięcie połączeń tkanek miękkich z brzusznym szkieletem skrzelowym. (K-L) Usunięcie połączeń grzbietowego szkieletu skrzelowego. (M-N) Usunięcie szkieletu skrzelowego. (O) Oddzielić przewód pokarmowy od szkieletu skrzelowego. Szczegóły znajdują się w krokach od 2.1 do 2.16. Pasek skali = 5 mm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Ponowne barwienie szkieletu skrzelowego (w razie potrzeby)

  1. Aby silniej zabarwić szkielet skrzelowy lub bardziej przejaśnić tkankę, usunąć 50% glicerol i roztwór 0,25% KOH, a następnie dwukrotnie przemyć 1% KOH (pierwsze płukanie przez pięć minut, a następnie drugie przez 24 h przy poziomym wstrząsaniu na wytrząsalce platformowej).
  2. Usunąć 1% KOH i ponownie zabarwić 0,008% Alizarin Red S w 1% KOH przez 24 h.
  3. Usunąć barwnik i zastąpić go 1% KOH na 24 h.
  4. Usunąć roztwór KOH i zastąpić go 50% glicerolem i 0,25% KOH.

4. Montaż szkieletu skrzelowego

  1. Wyjąć szkielet skrzelowy z 50% glicerolu, 0,25% KOH lub 10% glicerolu i umieścić go w pobliżu dolnej krawędzi szklanego szkiełka przedmiotowego o wymiarach 2 mm x 60 mm, stroną grzbietową do góry (Rysunek 3F). Na szkielet skrzelowy nanieś kilka kropli 50% glicerolu, 0,25% KOH lub 100% glicerolu. W przypadku przejścia z 50% glicerolu lub 0,25% KOH na 100% glicerol, wymień roztwór w probówce do mikrocentryfugi i wstrząsaj przez >5 min przed montowaniem w celu równowagi tkanki.
  2. Uformuj dwie małe kulki z plasteliny i umieść je po obu końcach szkiełka nakrywki, aby służyły jako dystanse.
  3. Luźno nałóż drugie szkiełko nakrywką, wywierając nacisk wystarczający do spłaszczenia przedniego szkieletu skrzelowego (Rycina 3G).
  4. Odsłoń lewą płat grzbietowy wraz z grzbietowymi płytkami zębowymi, rozpłaszcz go i wsuń pomiędzy szkiełka nakrywkowe (Rysunek 3H).
  5. Powtórz technikę w odniesieniu do prawego płata grzbietowego i odsunie cały szkielet skrzelowy od krawędzi szkiełka nakrywkowe (Rysunek 3I).
    1. Alternatywnie należy rozsunąć obie klapy grzbietowe za pomocą pęsety i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywką, spłaszczając szkielet skrzelowy jednym płynnym ruchem.
    2. Alternatywnie, przymocuj szkielet skrzelowy odwróconą stroną do góry do jednego szkiełka nakrywkowego, rozkładając każdą stronę grzbietową na boki, aby grawitacja nie doprowadziła do ponownego zamknięcia się szkieletu skrzelowego. Następnie przykryj go drugim szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 60 mm i odwróć preparat.
      Uwaga: Różne techniki montażu mogą sprawdzać się w różnym stopniu u każdego użytkownika. Należy wypróbować każdą z nich i sprawdzić, która jest najwygodniejsza.
  6. Lekko naciśnij górne szkiełko nakrywkowe, aby spłaszczyć kulki gliny w stopniu umożliwiającym utrzymanie szkieletu skrzelowego w pozycji płaskiej, dbając jednocześnie o to, by nie zmiażdżyć preparatu.
    1. Podczas procesu montażu ceratobranchiale mogą się obrócić i zasłonić rząd rastek. Aby to naprawić, należy wsunąć pęsetę między szkiełka nakrywki i ponownie zorientować ceratobranchiale lub cały szkielet skrzeli.
  7. Próbki należy przechowywać na płasko w tackach na szkiełka w temperaturze pokojowej. Po zamontowaniu w 10% glicerolu próbki mogą być przechowywane między mostkowanymi szkiełkami nakrywkowymi przez co najmniej dekadę. Pincety i nożyczki należy oczyścić izopropanolem lub etanolem, a następnie zabezpieczyć końcówki.

Sekwencja dyssekcji tkanki roślinnej, proces krok po kroku, przygotowanie do mikroskopii, metoda eksperymentalna.
Rysunek 3: Preparat płaski szkieletu skrzelowego. Przedstawiono manipulację i montaż szkieletu skrzelowego. Niebieskie strzałki wskazują kierunek ruchu. (A) Szkielet skrzelowy stroną grzbietową do góry. (B-D) Rotacja i nacięcie pomiędzy grzbietowymi płytkami zębowymi. (E) Cięcie boczne w tkance miękkiej w celu dalszego otwarcia podstawy przewodu pokarmowego. (F) Szkielet skrzelowy umieszczony na spodzie szkiełka nakrywkowego, gotowy do montażu. (G) Drugą szkiełkiem nakrywościankowym umieszczono na przedniej połowie szkieletu skrzelowego (powyżej grzbietowych płytek zębowych). (H-I) Montaż płaski szkieletu skrzelowego poprzez otwarcie płatów kostnych płyt zębowych grzbietowych i wsunięcie pomiędzy dwa szkiełka nakrywkowe. Szczegóły znajdują się w krokach 4.1–4.6. Pasek skali = 5 mm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie wypreparowanego i płasko zamontowanego szkieletu skrzelowego (Rycina 4), w którym można określić ilość różnorodnych, istotnych cech troficznych. W widoku grzbietowym można łatwo zwizualizować i zmierzyć wszystkie rzędy sit szkrzelowych, wszystkie płytki zębowe gardzielowe oraz niemal wszystkie kości skrzelowe2-24,35,36,38,42. Alizaryna czerwona S fluoreskuje również przy zastosowaniu filtra rhodamino...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szkielet skrzelowy to złożony zestaw kości w gardle ryby, który manipuluje, filtruje i przeżuwa produkty spożywcze w drodze do przełyku. Wiele interesujących cech troficznych, w tym wzór grabi skrzelowych, zęby gardłowe i kości skrzelowe, różni się w zależności od gatunku i w jego obrębie. Większość tych cech jest trudna lub prawie niemożliwa do dokładnego zmierzenia za pomocą szkieletu skrzelowego in situ (np. długość skrzeli, długość kości skrzelowej). Ten płaski protokół montażu umieszcza wszystkie r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH R01 #DE021475 dla CTM i NSF Graduate Research Fellowship dla NAE. Podziękowania dla Milesa Johnsona za pomoc w obrazowaniu i Priscilli Erickson za krytyczną lekturę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wodorotlenek potasu (KOH)EMDPX1480-1
GlicerolSigma-AldrichG7893-4L
10% neutralna buforowana formalina (NBF)Azer ScientificNBF-4-G
Alizaryn Red SEMDAX0485-3
Okulary nakrywkowe do mikroskopu 22 mm x 60 mmVWR16004-350
100 mm x 10 mm Szkło Petri NaczynieKimble Chase23064-10010Do preparowania próbek na
zestawie elastomerów silikonowych Sylgard 184Kleje Ellsworth184 SIL ELAST KIT 0,5 KGMożna wlać do szklanych lub plastikowych szalek Petriego w celu wykonania płytek preparacyjnych
ModelinaSargent Art22-40001 funt kremu
Fiolki scyntylacyjne (opakowanie 500 sztuk)Szkło borokrzemianoweWheaton986586
Kleszcze-Dumont #5 Inox (wskazówka Biologie)FST11252-20Dumostars to alternatywne
nożyczki preparacyjne FST15003-08Dostępne są różne rozmiary w zależności od wielkości próbki
Mikroskop preparacyjnyLeicaS6E z KL300 LEDWiele innych modeli działa ładnie, pomaga płaska podstawa
Probówki do mikrowirówek 1,7 mlDenvilleC2170
Kartonowa taca na suwakiFisher12-587-10
z zakrętką

Bibliografia

  1. Cooper, W. J., Westneat, M. W. Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches. BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).
  2. Albertson, R. C., Kocher, T. D. Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity. Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).
  3. Martin, C. H., Wainwright, P. C. Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish. Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).
  4. Wainwright, P. C., et al. The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond. Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).
  5. Sibbing, F. Food capture and oral processing. Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).
  6. Bell, M., Foster, S. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. New York. (1994).
  7. Kimmel, C. B., et al. Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).
  8. Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback. Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).
  9. McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback. BMC Evol. Biol. 13, 277(2013).
  10. McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback. Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).
  11. Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus. Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).
  12. Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback. Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).
  13. Jamniczky, H. a, Barry, T. N., Rogers, S. M. Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus). Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).
  14. Magnuson, J., Heitz, J. Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins. Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).
  15. Kahilainen, K. K., et al. The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish. Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).
  16. Arnegard, M. E., et al. Genetics of ecological divergence during speciation. Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).
  17. Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).
  18. Hagen, D., Gilbertson, L. Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America. Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).
  19. McPhail, J. D. Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia. Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).
  20. Schluter, D., McPhail, J. D. Ecological character displacement and speciation in sticklebacks. Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).
  21. Robinson, B. Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes. Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).
  22. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. Evodevo. 5 (1), (2014).
  23. Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
  24. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5, 1463-1472 (2015).
  25. Wainwright, P. Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus. Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).
  26. Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws. Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).
  27. Lauder, G. Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes. Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).
  28. Fraser, G. J., et al. An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws. PLoS Biol. 7 (2), e1000031(2009).
  29. Stock, D. Zebrafish dentition in comparative context. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).
  30. Liem, K., Greenwood, P. A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts. Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).
  31. Anker, G. C. Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus. Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).
  32. Meyer, A. Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape. J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).
  33. Huysseune, A. Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae). Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).
  34. Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes. Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).
  35. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
  36. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. (142), 2442-2451 (2015).
  37. Tucker, A. S., Fraser, G. J. Evolution and developmental diversity of tooth regeneration. Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).
  38. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. B. 281, (2014).
  39. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL. (2013).
  40. Bell, M. A. Evolutionary phenetics and genetics. Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).
  41. Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study. Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).
  42. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
  43. Miller, C. T., et al. cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans. Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).
  44. Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).
  45. Pasco-Viel, E., et al. Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi). PLoS One. 5 (6), e11293(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja szkieletu skrzelowegotechnika preparatyki p askiejanaliza grabi skrzelowychilo ciowe okre lanie z b w gard owychmorfologia kraniofacjalnametoda przeja niania glicerynmontowanie na szkie ku nakrywcepreparatyka szkieletu rybewolucyjna biologia rozwoju
Rozwarstwienie i płaskie ułożenie szkieletu skrzelowego ciernika trójkolcowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.