Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54057

⸱

1 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, 2Yan Bian University Hospital, 3Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Streszczenie

Niewydolność serca i zaburzenia rytmu serca są głównymi przyczynami śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Jednak mechanizm patogenezy i nieprawidłowego funkcjonowania mięśnia sercowego w chorym sercu pozostaje do pełnego wyjaśnienia. Ostatnie przekonujące dowody wskazują, że zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2 + wpływają na wewnątrzkomórkową homeostazę Ca2 + i aktywność kanałów jonowych w miocytach serca, podstawowych mechanizmach odpowiedzialnych za potencjał czynnościowy i skurcz serca w zdrowych i chorych sercach. Rzeczywiście, aktywność kanałów jonowych i transporterów leżących u podstaw sercowych potencjałów czynnościowych (np. kanałów Na+, Ca2+ i K+ oraz wymiennika Na+-Ca2+) oraz wewnątrzkomórkowych białek manipulacyjnych Ca2+ (np. receptory ryanodyny i Ca2+-ATPaza w retikulum sarkoplazmatycznym (SERCA2a) lub fosfolamban i jego fosforylacja) są konwencjonalnie mierzone w celu oceny podstawowych mechanizmów serca sprzężenie wzbudzenie-skurcz (EC). Zarówno aktywność elektryczna w błonie, jak i wewnątrzkomórkowe zmiany Ca2 + są sygnałami wyzwalającymi sprzężenie EC, podczas gdy miofilament jest jednostką funkcjonalną skurczu i relaksacji, a wrażliwość miofilamentu Ca2 + jest niezbędna w realizacji działania miofibryli. Niemniej jednak niewiele badań włącza wrażliwość miofilamentu Ca2+ do analizy funkcjonalnej mięśnia sercowego, chyba że jest to przedmiotem badania. Tutaj opisujemy protokół, który mierzy skracanie/ponowne wydłużanie sarkomeru i wewnątrzkomórkowy poziom Ca2 + za pomocą Fura-2 AM (detekcja ratiometryczna) i oceniamy zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2 + w miocytach serca z serc szczurów. Głównym celem jest podkreślenie, że czułość miofilamentu Ca2+ powinna być brana pod uwagę w sprzężeniu E-C do analizy mechanistycznej. Kompleksowe badania kanałów jonowych, transporterów jonów, wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2 + i wrażliwości miofilamentu Ca2 +, które leżą u podstaw kurczliwości miocytów w zdrowych i chorych sercach, dostarczą cennych informacji do projektowania skuteczniejszych strategii o wartości translacyjnej i terapeutycznej.

Wprowadzenie

Sprzężenie pobudzenia-skurczu serca (E-C) jest podstawowym schematem analizy właściwości mechanicznych mięśnia sercowego, tj. funkcji skurczowej serca1,2. Sprzężenie E-C jest inicjowane przez depolaryzację błony wtórną do aktywności kanałów jonowych sarkolemmalnych (np. kanału Na+ bramkowanego napięciem, który można zmierzyć za pomocą technik patch-clamp). Późniejsza aktywacja bramkowanych napięciem kanałów Ca2 + typu L (LTCC) i napływ Ca2 + za pośrednictwem LTCC wyzwalają większość uwalniania Ca2 + przez receptory ryanodyny (RyR), zwiększając stężenie cytozolowego Ca2 + z poziomu nanomolowego (nM) do mikromolowego (μM). Taki wzrost cytozolowego Ca2 + sprzyja wiązaniu Ca2 + z troponiną C (TnC) w cienkich włóknach i wywołuje zmiany konformacyjne kompleksu włókien w celu ułatwienia interakcji aktyna-miozyna i osiąga skurcz mięśnia sercowego3. I odwrotnie, cytozolowy Ca2 + jest ponownie wychwytywany z powrotem do retikulum sarkoplazmatycznego (SR) przez Ca2 + -ATPazę w SR (SERCA2a) lub jest wytłaczany z miocytów przez wymiennik Na + / Ca2 + i plazmalemmalną Ca2 + ATPazę1,2. W konsekwencji spadek cytozolowego Ca2+ inicjuje zmiany konformacyjne cienkich włókien z powrotem do stanu pierwotnego, co skutkuje dysocjacją aktyny-miozyny i relaksacją miocytów1-3. W tym schemacie aktywność SERCA2a jest ogólnie uważana za determinującą szybkość relaksacji mięśnia sercowego, ponieważ odpowiada ona za 70 - 90% cytozolowego usuwania Ca2 + w większości komórek serca ssaków1. W związku z tym nieprawidłowe obchodzenie się z Ca2 + przez LTCC, RyR i SERCA2a itp. zostało uznane za główne mechanizmy upośledzonej kurczliwości i relaksacji w chorym sercu1-4.

W rzeczywistości, wolny cytozolowy Ca2+, który funkcjonuje jako przekaźnik w sprzężeniu E-C, stanowi około 1% całkowitego wewnątrzkomórkowego Ca2+, a większość Ca2+ jest związana z wewnątrzkomórkowymi Ca2+ 5,6. Wynika to z faktu, że w miocytach serca występują obfite Ca2 +, np. fosfolipidy błonowe, ATP, fosfokreatyna, kalmodulina, parwalbumina, miofibryl TnC, miozyna, SERCA2a i kalsekwestryna w SR.5,6,7. Wśród nich dominującymi Ca2+ są SERCA2a i TnC5,6,7. Co więcej, wiązanie Ca2+ z jego jest procesem dynamicznym podczas skurczu (np. 30-50% Ca2+ wiąże się z TnC i dysocjuje od niego podczas stanów przejściowych Ca2+ 7), a zmiana wiązania Ca2+ powoduje dodatkowe "uwolnienie" wolnego Ca2+ do cytozolu, co powoduje zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 +. W konsekwencji zaburzenie wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ indukuje nieprawidłowe ruchy miofilamentów, które są prekursorami dysfunkcji kurczliwości i arytmii8,9. Wiele czynników (zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych) może być źródłem modyfikacji potranskrypcyjnych białek miofilamentowych, które wpływają na buforowanie miofilamentu Ca2+ i wrażliwość miofilamentu Ca2+ 8-10. Niedawno doniesiono, że mutacje w białkach miofilamentowych zwiększają powinowactwo wiązania Ca2 + i wewnątrzkomórkową obsługę Ca2 +, wywołując zależne od pauzy wzmocnienie stanów przejściowych Ca2 +, nieprawidłowe uwalnianie Ca2 + i zaburzenia rytmu8. Zgodnie z tą koncepcją wykazaliśmy również, że odczulanie miofilamentu Ca2 + w nadciśnieniowych sercach szczurów wtórne do regulacji w górę neuronalnej syntazy tlenku azotu wiąże się z podwyższonym rozkurczowym i skurczowym poziomem Ca2 + 11, co z kolei zwiększa podatność LTCC na inaktywację zależną od Ca2 + 12. W związku z tym wrażliwość miofilamentu Ca2 + jest "aktywnym" regulatorem wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2 + i funkcji kurczliwości miocytów. Konieczne stało się przeanalizowanie interakcji między miofilamentem a białkami manipulacyjnymi Ca2 + w celu dokładnego zbadania sprzężenia E-C miocytów i funkcji serca.

Tutaj opisujemy protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ w izolowanych miocytach serca. Kompleksowa analiza wewnątrzkomórkowego profiluCa2+, wrażliwości i skurczu miofilamentuCa2+ pozwoli odkryć nowe mechanizmy leżące u podstaw mechaniki mięśnia sercowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół jest zgodny z Przewodnikiem do Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia ONZ (Publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku). Został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Narodowego w Seulu (numer zatwierdzenia IACUC: SNU-101213-1).

1. Przygotowanie bufora (materiały stołu i sprzęt)

  1. Przygotować 300 ml świeżego roztworu izolacyjnego w dniu doświadczenia (w mM: NaCl, 135; KCl, 5.4; MgCl2, 3,5; glukoza, 5; HEPES, 5 LAT; Na2HPO4, 0.4; Tauryna, 20 lat; pH 7,4 z NaOH).
  2. Przygotować 100 ml świeżego roztworu do przechowywania w dniu doświadczenia (w mM: NaCl 120; KCl 5.4; MgSO: 4, 5; CaCl2 0,2; pirogronian sodu 5; glukoza 5,5; tauryna 20; FILTRY 10; Mannitol 29; pH 7,4 z NaOH).
  3. Przygotować 1 l roztworu perfuzyjnego (w mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH2PO4, 0,33; MgCl2, 1; HEPES, 10 LAT; glukoza, 5,5; CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 z NaOH).
  4. Przygotować 30 ml roztworu kolagenazy 1, dodając kolagenazę (1 mg/ml), proteazę (0,1 mg/ml), albuminę surowicy bydlęcej (BSA, 1,67 mg/ml) i Ca2+ (0,05 mM) do 25 ml roztworu izolacyjnego.
  5. Przygotować 20 ml roztworu kolagenazy 2, dodając kolagenazę (1 mg/ml), BSA (1,67 mg/ml) i Ca2+ (0,05 mM) do 16,7 ml roztworu izolacyjnego.
  6. Przygotować 40 ml roztworu BSA, dodając 0,4 g BSA do 40 ml roztworu izolacyjnego. Rozdzielić 10 ml i 30 ml do dwóch zlewek. Dodać Ca2+ do 30 ml roztworu BSA tak, aby końcowe stężenie Ca2+ w roztworze BSA wynosiło 1 mM.

2. Przygotowanie do izolacji miocytów lewej komory (LV)

  1. Przenieś 8-12 tygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley (SD) w czystych klatkach transportowych z obiektu dla zwierząt do pomieszczenia przygotowawczego i izolacyjnego.
  2. Podgrzać dwie łaźnie wodne do temperatury 37 o C.
    Uwaga: Użyj jednej kąpieli wodnej do zbiornika z płaszczem wodnym i rurek perfuzyjnych systemu perfuzyjnego Langendorffa. Użyj drugiej kąpieli wodnej do poruszenia pni tkanki mięśnia sercowego w celu oddzielenia pojedynczych miocytów.
  3. Dodać 5 ml i 3,3 ml roztworu BSA (bez Ca2+) do 25 ml roztworu kolagenazy 1 i 16,7 ml roztworu kolagenazy 2 w celu uzupełnienia objętości odpowiednio do 30 ml i 20 ml.
  4. Dodać roztwór izolacyjny (100 ml) i roztwór kolagenazy 1 (30 ml) odpowiednio do kolumny 1 (Kol. 1) i kolumny 2 (Kol. 2) w systemie perfuzji Langendorffa (ryc. 1A).
  5. Natlenić roztwór izolacyjny i roztwór kolagenazy 1 w Col. 1 i Col.2 przez rurkę łączącą tlen w systemie perfuzji Langendorffa (Figura 1A). Podobnie, natlenić roztwór kolagenazy 2 i roztwór BSA w wytrząsającej łaźni wodnej ze 100%O2 przez rurkę łączącą tlen.

3. Izolacja miocytów LV

  1. Znieczulić szczura SD poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (30 mg / kg) i potwierdzić stan znieczulenia poprzez szczypanie palca u nogi i brak odbicia odstawienia.
  2. Przenieś szczura na tacę do sekcji. W pozycji leżącej przymocuj cztery nogi do boków ciała za pomocą taśmy.
  3. Wykonaj nacięcia środkowe w klatce piersiowej nożyczkami chirurgicznymi, aby otworzyć klatkę piersiową, upewniając się, że nie uszkodzisz serca. Użyj innej pary czystych nożyczek, aby wyciąć serce z naczyń łączących (np. żyły głównej górnej i dolnej, naczyń płucnych i aorty) oraz błony osierdziowej13.
  4. Pozostaw część aorty o odpowiedniej długości (5 - 8 mm), zaciśnij aortę cienkimi kleszczami i szybko zamontuj kaniulę systemu perfuzyjnego Langendorffa w ciągu 1 minuty (ryc. 1A). Zawiąż mocno nić do szwów 4/0 na aorcie.
  5. Włącz zawór na Col. 1 i perfunduj izolowane serce wstępnie podgrzanym i natlenionym roztworem izolacyjnym przez 10 minut (szybkość perfuzji: 12-14 ml/min). Zakręć zawór na Col. 1, włącz zawór na Col. 2 i perfuj serce roztworem kolagenazy 1 przez 8 - 10 min.
  6. Zdemontuj strawione serce, przecinając aortę i przenieś ją, przytrzymując aortę kleszczami do kolby zawierającej świeży roztwór izolacyjny (ryc. 1Bi). Użyj drobnych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć większość wolnej ściany lewej komory (w tym przegrodę) na mniejsze kawałki (~22 mm, ryc. 1Bii).
  7. Przenieść kawałki do kolby zawierającej wstępnie podgrzany i natleniony świeży roztwór kolagenazy 2 (ryc. 1Biii). Wstrząsaj przez 10 minut. Kontynuuj dostarczanie tlenu do roztworu kolagenazy zawierającego miocyty 2.
  8. Przenieść zawiesinę miocytów do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml za pomocą zakraplaczy z gruszką ssącą i dodać roztwór Ca2+ zawierający BSA (objętość 1:1). Wirować przy 30 g przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Zawiesić osad miocytów w 5 ml roztworu BSA. Odwirować i wyrzucić supernatant.
  9. Rozproszyć osady miocytów i utrzymać miocyty w 10 ml wstępnie natlenionego roztworu do przechowywania w temperaturze pokojowej (ryc. 1Biv-vi).
  10. Powtórzyć procedury (kroki 3.7 - 3.9) z pozostałą tkanką lewej dawki w kolbie.
    Uwaga: Powtarzaj procedury (kroki 3.7 - 3.9) ponownie, aż większość tkanki LV zniknie, aby uzyskać dobrą wydajność miocytów.
  11. Miocyty należy przechowywać w roztworze do przechowywania przez 6-8 godzin w temperaturze pokojowej do końca eksperymentów.

4. Równoczesne pomiary wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ i skurczu miocytów

  1. Załaduj miocyty LV estrem acetoksymetylowym Fura-2 AM (2 μM).
    Uwaga: Wykonaj wszystkie procedury ładowania i eksperymenty z załadowanymi miocytami w ciemnej probówce (Figura 1Bvii).
    1. Odwirować zawiesinę miocytów (1 ml) przy 2 000 x g przez 10 sekund. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad miocytów w 1 ml roztworu Tyrode o niskim stężeniu Ca2+ (250 μM, Materiały i Sprzęt Stołowy).
    2. Dodać Fura-2AM i poloksamer 407 (2 μl), delikatnie rozproszyć zawiesinę miocytów i utrzymywać mieszaninę w temperaturze RT (20 - 24o C) przez 15 minut (ryc. 1Bvii).
    3. Odwirować mieszaninę przez 5 sekund, odrzucić supernatant i rozproszyć osad miocytów w 1 ml roztworu perfuzyjnego zawierającego 500 μM Ca2+. Po 10 minutach odwirować mieszaninę przez 5 sekund i wyrzucić supernatant.
    4. Dodać świeży roztwór perfuzyjny (500 μM Ca2+, 1 ml) i przechowywać w tym roztworze osad miocytów Fura-2AM do nagrań.
  2. Pomiar skurczu miocytów LV i wewnątrzkomórkowego Ca2+
    1. Przed nagraniem napełnij rurkę perfuzyjną, która przepływa przez płaszcz wodny, roztworem Tyrode, który jest wstępnie podgrzany do 36 o C.
    2. Umieść kilka kropli zawiesiny miocytów LV Fura 2 AM na komorze odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego na 5 - 8 minut. Powoli perfaktoruj roztwór Tyrode (2,2 ml/min).
    3. Naciśnij przycisk "start" na przednim panelu stymulatora cyfrowego, aby rozpocząć stymulację pola (2 Hz).
      Uwaga: Napięcie wyjściowe (10 V, czas trwania 5 ms) jest doprowadzane do miocytów w komorze za pomocą platynowych przewodów umieszczonych po obu stronach komory.
      1. Wybierz miocyty, które kurczą się stabilnie (nie te, które wykazują hiper- lub hiposkurcz) do rejestracji.
    4. Ustaw wybrane miocyty w pozycji poziomej systemu detekcji sarkomerów opartych na wideo i dostosuj ostrość mikroskopu, aby uzyskać optymalne obrazy sarkomerów. Umieść fioletową prostokątną ramkę w obszarze, w którym wyraźnie obserwuje się wyraźne sarkomery, aż średnia długości sarkomerów (czerwony szczyt) pokaże pojedynczy ostry szczyt (Rysunek 2A, dolny obraz).
    5. Rejestruj zmiany długości sarkomeru w odpowiedzi na stymulację polem (ryc. 2A i B).
      Uwaga: Użyj załadowanych miocytów w ciągu 1 - 2 godzin.
    6. Dostosuj aperturę kamery tak, aby pole w systemie detekcji sarkomeru opartego na wideo było wielkości miocytów (ryc. 2A). Stymuluj miocyty wzbudzeniem przy 360 nm/380 nm i emisją przy 510 nm (częstotliwość akwizycji 1,000 Hz). Zapisz skrócenie sarkomeru i stosunek Fura2 AM ze stymulacją polową (ryc. 2B).

5. Ocena wrażliwości miofilamentu Ca2+

  1. Uśrednić długości sarkomerów i stany przejściowe Ca2+ w stanie ustalonym (10 - 20 śladów) i wykreślić pętlę płaszczyzny fazowej stosunku Fura-2 w funkcji długości sarkomeru tego samego miocytu (zarówno z wartościami zmierzonymi, jak i zmianami delta; Rysunek 2C).
  2. Na każdym wykresie zdefiniuj stosunek Fura -2 przy 50% relaksacji (EC50, rysunek 2C). Porównaj zarówno pętlę, jak i EC50 każdej interwencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kardiomiocyty z lewej komory (LV) są izolowane z serc szczurów zdrowych i nadciśnieniowych. Za optymalne kardiomiocyty, wybrane do pomiarów, uznaje się komórki o kształcie pręcikowatym z wyraźnymi prążkowaniem (reprezentującym sarkomery) i stabilnymi skurczami w odpowiedzi na stymulację polową (Rysunek 2A). W przykładzie przedstawionym na Rysunku 2A kardiomiocyt LV obciążony Fura 2 AM jest ustawiony poziomo, a przysłona kamery jest regulowana tak, aby kar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokoły oceny zmian wrażliwości miofilamentu Ca2 + w pojedynczych izolowanych miocytach serca i podkreślamy znaczenie pomiaru tego parametru wraz z właściwościami elektrofizjologicznymi, wewnątrzkomórkowymi stanami przejściowymi Ca2 + i dynamiką miofilamentów. Dzieje się tak, ponieważ zapisy jednego lub dwóch parametrów mogą nie wyjaśniać mechanizmów leżących u podstaw skurczu i rozluźnienia serca. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, które indywidualnie mierzą skur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (2013068067); przez Brain Korea 21 Graduate Programme Koreańskiego Ministerstwa Edukacji, Nauki i Technologii, Narodowy Szpital Uniwersytecki w Seulu, Koreańskie Towarzystwo Nadciśnienia (2013), SK Telecom Research Fund (nr 3420130290) oraz przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 31460265; NSFC 81260035).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprague Dawley ratKoatech8-12 tygodni
Pentobarbital SodiumHanlim Pharmaceutical (Korea)AHN901Kod ubezpieczenia:645301220
NaClSigmaS9625
KClSigmaP4504
NaH2PO4SigmaS8282
HEPESSigmaH3375
GlukozaSigmaG8270
CaCl2BiosesangC2002
MgCl2BiosesangM2001
MannitolSigmaM4125
MgSO4SigmaM5921
Sód PirogronianSigmaP2256
TaurynaMerck8.08616.1000
Na2HPO4  Sigma71649
Albumina płodu bydlęcegoSigmaA7906
Kolagenaza typu 2Proteaza WorthingtonLS004177
SigmaP6911
Fura-2 (AM)Sondy molekularneF1221
Pluronic F127 20% roztwór w DMSOInvitrogenP3000MP
Kąpiel wodna z wytrząsaniemChang Shin Model naukowy: C-108
IonWizard Softwae SuiteIonOptix LtdEksperymentalny budowniczyAkwizycja i analiza danych sprzężenia EC w miocytach
Wapń miocytów i System rejestracji kurczliwościIonOptix Ltd
Kąpiel w wodzie obiegowejBS-TechBW2-8
Mikroskop fluorescencyjny miocytówNikonDIATPHOTO 200
MyoCam-S PowerIonOptix
Fluorescencja i Detekcja wideoIonOptixMyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescencja i Interfejs systemuIonOptixFSI700
Wzbudzenie Źródło światłaIonOptixmSTEP
Lampa łukowa o wysokiej intensywności ZasilaczCairn Reseach
Filter kontroler kołaIonOptixGB / MUS200
Cyfrowy stymulatorSystemy medyczne CorportionS-98 Mutimode
Kompozycje roztworów eksperymentalnych
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór izolacyjny (pH: 7,4, NaOH)
NaClSigmaS9625Stężenie (mmol) 135
KClSigmaP4504Stężenie (mmol) 5,4
HEPESSigmaH3375Stężenie (mmol) 5
Stężenie glukozySigmaG8270(mmol) 5
MgCl2BiosesangM2001Stężenie (mmol) 3,5
Stężenie TaurynySigmaCB2742654(mmol) 20
Na2HPO4  Sigma71649Stężenie (mmol) 0,4
Roztwór do przechowywania (pH: 7,4, NaOH)
NaClSigma S9625Stężenie (mmol) 120
KClSigmaP4504Stężenie (mmol) 5,4
HEPESSigmaH3375Stężenie (mmol) 10
GlukozaSigmaG8270Stężenie (mmol) 5,5
CaCl2BiosesangC2002Stężenie (mmol) 0,2
MannitolSigmaM4125Stężenie (mmol) 29
MgSO4SigmaM5921Stężenie (mmol) 5
Pirogronian soduSigmaP2256Stężenie (mmol) 5
TaurynaSigmaCB2742654Stężenie (mmol) 20
Roztwór perfuzyjny (roztwór tylody, pH: 7,4, NaOH)
NaClSigma S9625Stężenie (mmol) 141,4
KClSigmaP4504Stężenie (mmol) 4
NaH2PO4SigmaS8282Stężenie (mmol) 0,33
HEPESSigmaH3375Stężenie (mmol) 10
Stężenie glukozySigmaG8270(mmol) 5,5
CaCl2BiosesangC2002Stężenie (mmol) 1,8          W przypadku ładowania Fura 2AM stężenia CaCl2 wynoszą 0,25 mM i 0,5 mM
MgCl2BiosesangM2001Stężenie (mmol) 1
MannitolSigmaM4125Stężenie (mmol) 14,5
Roztwór kolagenenazy 1
roztwór izolacyjny (30 ml)
Albumina bydlęca płodu (roztwór BSA 5 ml)Stężenie (mmol) 1,67 mg / ml
Kolagenaza typu 2WorthingtonLS004177Stężenie (mmol) 1 mg / ml
ProteazaSigmaP6911Stężenie (mmol) 0,1 mg / ml
CaCl2BiosesangC2002Stężenie (mmol) 0,05
mM Roztwór kolagenenazy 2
Roztwór izolacyjny ( 20 ml)
Albumina bydlęca (roztwór BSA 3,3 ml)Stężenie (mmol) 1,67 mg / ml
Kolagenaza typu 2WorthingtonLS004177 Stężenie (mmol) 1 mg / ml
CaCl2BiosesangC2002Stężenie (mmol) 0,05
mM roztwór
Roztwór izolacyjny ( 40 ml)
Albumina bydlęca płoduSigmaA7906Stężenie (mmol) 400 mg
CaCl2BiosesangC2002Stężenie (mmol) 1mM
BSA

Bibliografia

  1. Bers, D. M., et al. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  2. Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
  3. Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
  4. Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
  5. Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
  6. Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
  7. Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
  8. Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
  9. Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
  10. Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336(2013).
  11. Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
  12. Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
  15. Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
  16. Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
  17. Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
  18. Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
  19. Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
  20. Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
  21. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  22. Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wra liwo miofilament w na wapskracanie sarkomer wgospodarka wewn trzkom rkowa wapniemadowanie Fura 2AMperfuzja Langendorffakardiomiocytyaktywno kana w jonowychpatch clampniewydolno serca
Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.