Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

Podsumowanie

Analizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu nanocząsteczkowego aptamera i złota do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań terenowych. Dodatkowo zatwierdzono aplikację kolorymetryczną (smart-device) oraz ustalono długoterminowe przechowywanie testu do użytku w terenie.

Streszczenie

Przeanalizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu aptamino-złoto-nanocząsteczkowego (AuNP) do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań w terenie. Selektywne testy kolorowe oparte na AuNP zostały opracowane w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych proof-of-concept. Jednak te schematy nie zostały wykorzystane do granic porażki, aby określić ich praktyczne zastosowanie poza warunkami laboratoryjnymi. Praca ta opisuje ogólne podejście do projektowania, opracowywania i rozwiązywania problemów kolorymetrycznego testu aptamer-AuNP dla analizowanych cząsteczek oraz stosowania testu w terenowych warunkach. Test jest korzystny, ponieważ adsorbowane aptamery pasywują powierzchnie nanocząstek i umożliwiają ograniczenie oraz eliminację fałszywie pozytywnych odpowiedzi na anality niebędące celami. Przejście tego systemu do praktycznych zastosowań wymagało nie tylko określenia okresu przydatności testu aptamer-AuNP, ale także ustanowienia metod i procedur rozszerzających możliwości długoterminowego przechowywania. Jednym z rozpoznanych problemów związanych z odczytem kolorymetrycznym jest obciążenie analityków, którzy muszą dokładnie identyfikować często subtelne zmiany koloru. Aby zmniejszyć odpowiedzialność analityków w terenie, opracowano protokół analizy kolorów, który umożliwiał wykonywanie obowiązków identyfikacji kolorów bez konieczności wykonywania tego zadania na sprzęcie laboratoryjnym. Opisano metodę tworzenia i testowania protokołu analizy danych. Jednak aby zrozumieć i wpłynąć na projektowanie adsorbowanych testów aptamerowych, interakcje związane z aptamerem, celem i AuNP wymagają dalszych badań. Zdobyta wiedza może doprowadzić do dostosowania aptamerów pod kątem poprawy funkcjonalności.

Wprowadzenie

Kolorymetria jest jedną z najstarszych technik stosowanych w chemii analitycznej. W tej technice jakościowe lub ilościowe określa się analit na podstawie produkcji związku kolorowego¹. Zazwyczaj testy kolorowe wykorzystują odczynniki, które ulgają zmianie koloru w obecności gatunku analitu, co skutkuje obserwowalną lub wykrywalną zmianą koloru w widzialnym spektrum światła. Kolorimetria była wykorzystywana do wykrywania celów obejmujących atomy, jony i małe cząsteczki po złożone cząsteczki biologiczne, takie jak kwasy deoksyrybonukleinowe (DNA), peptydy i białka^2-4. Przez ostatnie dwie dekady nanomateriały zrewolucjonizowały dziedzinę testów detekcyjnych, szczególnie w przypadku testów kolorowych^5-6. Połączenie unikalnych właściwości chemicznych i fizycznych nanomateriałów z elementem selektywnego rozpoznawania celów, takimi jak przeciwciała, oligonukleotydowe aptamery czy aptamery peptydowe, doprowadziło do odrodzenia projektowania i rozwoju kolorymetrycznych testów detekcyjnych⁷.

Nanocząstki metalu wykazują udokumentowaną zależność od rozmiaru właściwości zmiany koloru, co zostało wykorzystane w projektowaniu licznych testów kolorymetrycznych. Nanocząstki złota (AuNP) są szczególnie interesujące ze względu na charakterystyczne przejście koloru z czerwono-niebieskiego, gdy rozproszony roztwór cząstek zostaje indukowany do agregacji⁸, zazwyczaj poprzez precyzyjne dodanie soli. Możliwość kontrolowania przejścia ze stanów rozproszonych (czerwonych) do zagregowanych (niebieskich) doprowadziła do powstania czujników kolorymetrycznych dla celów jonowych, małych molekularnych, peptydowych, białkowych i komórkowych^2-4,9. Wiele z tych czujników wykorzystuje aptamery jako motyw rozpoznania celów.

Aptamery to cząsteczki DNA lub kwasu rybonukleinowego (RNA) wybierane z losowej puli 10,^12-10,¹⁵ różnych sekwencji,^10-11. Proces selekcji identyfikuje elementy rozpoznawające cele z powinowactwami wiązanymi w niskim reżimie nanomolowym, a systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest najczęściej znanym procesem^12-13. Zalety aptamerów opartych na oligonukleotydach do zastosowań pomiarowych to łatwość syntezy, kontrolowana modyfikacja chemiczna oraz stabilność chemiczna^14-15.

Jednym z podejść do tworzenia testu kolorymetrycznego łączącego nanomateriały z elementami rozpoznawczymi jest połączenie tych dwóch gatunków poprzez fizyczną adsorpcję cząsteczek aptamerów DNA na powierzchniach AuNP. Poprzez wiązanie cel-aptamer aptamer ulega zmianie strukturalnej^16-18 , która zmienia interakcję aptamera z powierzchnią AuNP, prowadząc do indukowalnej odpowiedzi koloru czerwono-niebieskiego¹⁹ po dodaniu soli. Ta zdumiewająca cecha AuNP zapewnia obserwowalny mechanizm odpowiedzi kolorymetrycznej dla urządzeń opartych na aptamerze, który może być używany do projektowania kolorymetrycznych testów dla różnych analitów.

Testy kolorowe zaprojektowane z wykorzystaniem niekowalencjnych, fizycznie adsorbowanych aptamerów DNA na powierzchniach AuNP mają piętno słabej platformy sensorowej ze względu na problemy z odpornością, skłonność do awarii poza kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi oraz brak dostępnych informacji do praktycznego zastosowania. Jednak kolorymetryczny test oparty na aptamerze AuNP był interesujący ze względu na prostotę działania i obserwowalną reakcję kolorową. Celem tych prac jest dostarczenie protokołu do projektowania, rozwoju, działania, redukcji fałszywie pozytywnej odpowiedzi na powierzchnię oraz długoterminowego przechowywania kolorymetrycznych testów opartych na DNA-AuNP, wykorzystujących kokainę jako reprezentatywny analit. Ponadto zaproponowaliśmy podejście adsorbowanego testu aptaminowego (Rysunek 1) jako korzystne ze względu na prostotę i łatwość użycia, co skutkowało mniejszą liczbą kroków niż konwencjonalne podejście do tych testów aptamer-AuNP. Do tego testu aptamer najpierw dodano do AuNP, które mogły adsorbować powierzchnię przez dłuższy czas. Dodatkową zaletą tego podejścia było zmniejszenie odpowiedzi na niecelowe cząsteczki analitu związane z interakcjami powierzchniowymi AuNP. Jednak zmniejszenie liczby fałszywie pozytywnych wyników odbyło się kosztem wrażliwości testu. Dlatego konieczne jest zachowanie równowagi między ochroną powierzchniową a dostępnością analitu, aby utrzymać prawidłową funkcjonalność testu. Co więcej, główną wadą analizy testów kolorowych innymi metodami niż instrumentacja jest to, że wyniki są często subiektywne i otwarte na interpretację z perspektywy analityka, szczególnie przy próbie rozróżnienia subtelnych różnic kolorowych. Z kolei istnieje wiele problemów związanych z uzyskiwaniem instrumentów laboratoryjnych poza laboratorium, takich jak dostępność zasilania, praktyczność i przenośność itp. W tej pracy opracowano protokół analizy kolorów dla większej mobilności oraz wyeliminowania części domysłów typowych związanych z interpretacją testów kolorowych^20-21. W porównaniu z wcześniejszymi podejściami, ten wysiłek dążył do wyciągnięcia tych testów do granic możliwości zastosowań wykraczających poza warunki laboratoryjne.

Protokół

1. Synteza nanocząsteczek złota (AuNP) metodą redukcji cytrynianem oraz ich charakterystyka

1. W dygestorium chemicznym oczyść kolbę Erlenmeyera (500 ml) oraz duży magnes w mieszadle za pomocą 5 ml stężonego kwasu azotowego i 15 ml stężonego kwasu solnego.
   1. Zmocz całą powierzchnię kolby roztworem kwasowym, wypłucz kolbę wodą wolną od nukleaz i pozostaw do wyschnięcia.
2. Dodaj 100 ml 1 mM chlorku złota(III); przykryj wlew oczyszczonej kwasem kolby Erlenmeyera arkuszem folii aluminiowej i podgrzewaj na płycie grzejnej przy ciągłym mieszaniu aż do wrzenia.
3. Dodaj 10 ml 38,8 mM cytrynianu sodu. Kolor zmieni się z przeźroczystego/szarego na ciemnoniebieski/czarny, a ostatecznie na ciemnoczerwony w ciągu kilku minut. Kontynuuj mieszanie przez 10 min po wyłączeniu ogrzewania.
4. Pozostaw zawiesinę AuNP do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dodaj 110 µl diethylopirokarbonianu (DEPC) przy ciągłym mieszaniu.
5. Przykryj całą kolbę folią aluminiową i pozostaw do inkubacji z DEPC przez noc. Przechowuj wszystkie AuNP w ciemności, w bursztynowych pojemnikach lub przykryte folią aluminiową.
6. Zautoklawuj zawiesinę AuNP, ostudź do temperatury pokojowej i przefiltruj przez membranę z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 µm. Przefiltrowany i zautoklawowany roztwór stokowy AuNP przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Traktowanie DEPC, sterylizacja w autoklawie oraz przechowywanie w 4 °C przedłużą okres przydatności testu aptamer-AuNP. Przechowywanie w ten sposób pozwoli na zachowanie funkcjonalności testu przez ponad 2 miesiące.
7. Oblicz stężenie AuNP, mierząc absorbancję w zakresie ultrafiolet-widzialnym przy 520 nm, a następnie zastosuj prawo Beera, używając współczynnika ekstynkcji (Ɛ) 2,4 x 10⁸ L mol^-1 cm^-1 do obliczenia stężenia (c). Stężenie określono na 10 nM, a wielkość na 15 nm, co wyznaczono metodą dynamicznego rozpraszania światła.
   UWAGA: Stężenia będą różnić się w zależności od partii. Rozcieńczaj roztwory stokowe AuNP wodą wolną od nukleaz w razie potrzeby, aby uzyskać pożądane stężenie zawiesiny AuNP wynoszące 10 nM.

2. Przygotowanie aptameru DNA, buforu, roztworów i testu

1. Należy zakupić lub zsyntezować poniższe sekwencje aptamerów wiążących kokainę, stosując standardową chemię fosforamidytową²²:
   MN4¹⁹: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3'
   MN6¹⁹: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3'
2. Aptamery należy oczyścić za pomocą standardowego odsalania²³. Oligonukleotydy należy rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz, przygotowując roztwory stokowe o stężeniu 100 µM lub 1 mM. Następnie należy je podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
3. Należy zakupić lub przygotować roztwory stokowe sterylnego 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) o pH 7.4, 100 mM chlorku magnezu (MgCl₂) oraz 1 M chlorku sodu (NaCl).
4. Należy przygotować 50 ml buforu w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniach 20 mM HEPES i 2 mM MgCl₂, pH 7.4, a następnie przechowywać go w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
5. DNA należy inkubować z roztworem stokowym AuNP (10 nM) przez 3-4 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Objętość AuNP można dostosować w zależności od potrzeb, aby zapewnić wystarczającą ilość próbki do planowanych testów (2.5-7.5 ml).
   1. W niniejszej pracy zastosowano gęstości załadunku wynoszące odpowiednio 90, 120, 150 i 180 cząsteczek DNA/AuNP. Objętość i stężenia DNA należy dostosować odpowiednio. Stopień pokrycia DNA należy zoptymalizować, aby zredukować niezamierzone odpowiedzi kolorystyczne analitów niecelowych związane z powierzchnią AuNP.
      UWAGA: Zwiększenie stopnia pokrycia DNA obniży czułość testu. Gęstości załadunku oblicza się na podstawie stężenia roztworu stokowego AuNP oraz całkowitej liczby AuNP obecnych w objętości przeznaczonej do eksperymentów. W celu uzyskania rzeczywistych gęstości pokrycia istnieją odpowiednie protokoły⁷. Stopień pokrycia DNA określono, wykorzystując kolumnę wirową z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa w celu oddzielenia DNA związanego z AuNP od DNA wolnego. Cząsteczki AuNP są zbyt duże, aby przejść przez kolumnę wirową, podczas gdy wolne DNA przechodzi przez nią bez przeszkód. Kolejnym krokiem jest ilościowe oznaczenie zebranego wolnego DNA za pomocą pomiarów absorbancji lub fluorescencyjnego barwnika do jednoniciowego DNA.
6. Należy dodać taką samą objętość buforu 20 mM HEPES, 2 mM MgCl₂, pH 7.4 i pozostawić próbkę w temperaturze 4 °C w ciemności przez noc. Test aptamer-AuNP przeprowadzono w buforze testowym: 10 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, pH 7.4.

3. Miareczkowanie solą i przygotowanie testu

1. Wyznaczyć początkowe stężenie soli niezbędne do wywołania odpowiedzi barwnej testu poprzez miareczkowanie solą próbki ślepej. Dodać 20 µl metanolu (próba ślepa) do 180 µl aliquotów testu aptamer-AuNP na płytce 96-dołkowej. Miareczkować próbki zwiększającymi się objętościami roztworu zakładowego NaCl (1 M lub 2 M) i wyznaczyć punkt równoważności (Rysunek 2).
   UWAGA: Skalę testu można zmniejszyć do mniejszych objętości, zachowując ten sam stosunek metanolowej próby ślepej (lub rozpuszczonego anality) do testu aptamer-AuNP.
   1. Na tym etapie wyznaczyć objętość NaCl niezbędną do wywołania najmniejszej zmiany barwy poprzez obserwację wizualną. Początkowe stężenie dla testu wynosiło odpowiednio 75 mM dla MN4 oraz 130 mM dla MN6 przy gęstości pokrycia wynoszącej 60 cząsteczek DNA/AuNP.
      UWAGA: W przypadku ilościowego wyznaczania początkowego stężenia soli, dobrym punktem wyjścia jest punkt środkowy krzywej miareczkowania. Stosowane stężenia będą się różnić w zależności od aptameru, gęstości pokrycia DNA, wyników z poszczególnych dni oraz serii produktów.
2. W celu optymalizacji odpowiedzi testu, dodać 20 µl cząsteczek anality rozpuszczonych w metanolu do 180 µl aliquotów testu aptamer-AuNP na płytce 96-dołkowej w temperaturze pokojowej. Niezwłocznie dodać stężenie NaCl wyznaczone w poprzednim kroku, aby zainicjować odpowiedź barwną testu.
   UWAGA: Do jednoczesnego przeprowadzenia wielu eksperymentów należy użyć pipety wielokanałowej.
3. Uzyskać jak największą zmianę barwy poprzez zwiększanie lub zmniejszanie stężenia NaCl oraz porównanie odpowiedzi docelowej z odpowiedzią próby ślepej. Zastosować stężenie NaCl, które zapewnia największą różnicę w odpowiedzi.
4. Zaobserwować lub zmierzyć odpowiedź testu po 150 s od dodania NaCl. Przeanalizować absorbancję przy 650 nm i 530 nm za pomocą spektrometru lub wykonać zdjęcie cyfrowe odpowiedzi testu (protokół analizy zdjęć znajduje się w sekcji 4).
   UWAGA: Do uzyskania pomiarów w niniejszej pracy wykorzystano czytnik mikropłytek.
5. Przedstawić wyniki w postaci stosunku absorbancji uzyskanej przy 650 nm i 530 nm (E₆₅₀/E₅₃₀) jako funkcji stężenia anality. Znormalizować odpowiedź testu względem sygnału próby ślepej, zgodnie z procedurą zastosowaną w niniejszej pracy.

4. Protokół analizy kolorystycznej zdjęć i obrazów cyfrowych

1. Przygotować próbki do analizy zgodnie z opisem (sekcje 3.2-3.3). Umieścić płytkę 96-dołkową na transiluminatorze.
   UWAGA: Standardowy laboratoryjny transiluminator jest zazwyczaj zbyt jasny, aby uzyskać użyteczne obrazy cyfrowe do tej analizy. Transiluminatory te powodują pojawienie się w obrazie cyfrowym regularnie rozmieszczonych „ciemnych linii” ze względu na intensywność źródła światła. Dobrze sprawdza się transiluminator wykonany z lightboxa opartego na diodach elektroluminescencyjnych (LED) i kawałka nieprzezroczystego plastiku.
2. Wykonać zdjęcia płytki 96-dołkowej 150 s po dodaniu NaCl, zaimportować obrazy do oprogramowania do analizy obrazu i obliczyć średnie wartości czerwieni, zieleni i niebieskiego (RGB), stosując technikę średniej kroczącej, zgodnie z równaniem 1²⁴:
   (1)
3. Przekształcić wartości RGB z standardowej przestrzeni barw RGB (sRGB) na przestrzeń diagramu chromatyczności (CIExyY), korzystając z następujących równań²⁴:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Przekształcić wykładnicze wartości RGB na liniowe wartości RGB za pomocą równania 2. Macierz określona w równaniu 3 służy do obliczenia wartości X, Y i Z przestrzeni barw CIE²⁴.
5. Obliczyć wartości chromatyczności x i y za pomocą równania 4, reprezentujące średni kolor pikseli w obszarze wybranym do analizy²⁴.
6. Przeprowadzić analizę w każdym dołku i wykreślić wartości chromatyczności w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej (Rysunek 4). Wyznaczyć błąd standardowy poprzez analizę koloru różnych obszarów tego samego dołka.

5. Test z zamrażaniem aptamerów-AuNP w celu długoterminowego przechowywania

1. Przygotować komponenty testu aptamer-AuNP zgodnie z opisem w sekcjach 2.4 i 2.5. Przygotować oddzielne roztwory zawierające 1 g/ml trehalozy i 1 g/ml sacharozy w wodzie wolnej od nukleaz w celu przygotowania roztworu krioprotekcyjnego.
   UWAGA: Zastosowano wysokie stężenia trehalozy i sacharozy, aby zmniejszyć czynnik rozcieńczenia podczas przygotowywania testu do zamrażania. Przed użyciem podgrzać roztwory cukrów na płycie grzejnej w zlewce z wodą, aby całkowicie rozpuścić cukry.
2. Przygotować roztwór zawierający 19,2 mg/ml trehalozy i 4,8 mg/ml sacharozy z testem 60 MN4-DNA/AuNP do końcowej objętości 200 µl w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Końcowe stężenia roztworu krioprotekcyjnego będą się różnić w zależności od stopnia pokrycia DNA.
   UWAGA: Objętość próbek przeznaczonych do zamrażania nie powinna przekraczać 300 µl. Większe objętości mogą nie zamarznąć prawidłowo.
3. Próbki zamrozić gwałtownie w zamrażarce o temperaturze -146 °C lub w ciekłym azocie. Próbki przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia. Po zakończeniu gwałtownego zamrażania przechowywanie może odbywać się w temperaturze -80 °C lub -20 °C.
4. W tej pracy próbki pozostawiono w zamrażarce -146 °C na noc, a następnie przeniesiono do zamrażarki -20 °C do długoterminowego przechowywania.
   UWAGA: Gwałtowne zamrażanie może powodować agregację aptamer-AuNP. Sprawdzić prawidłowość procesu zamrażania poprzez monitorowanie profilu absorbancji i porównanie go z próbką niezamrożoną. W przypadku zaobserwowania agregacji zwiększyć ilość roztworu krioprotekcyjnego, aby zniwelować ten problem.
5. Próbki rozmrozić w temperaturze pokojowej i wykorzystać tylko taką ich ilość, jaka jest niezbędna do przeprowadzenia eksperymentu. Uzyskać widma absorbancji rozmrożonych próbek i porównać je z widmami bazowymi próbki traktowanej roztworem krioprotekcyjnym, która nie była zamrażana. Absorbancję mierzyć w zakresie od 400 nm do 700 nm.
6. Przeprowadzić miareczkowanie solą (sekcja 3.1), przetestować test (sekcja 3.2) i nanieść wyniki na wykres (sekcje 3.3 i 3.4) zgodnie z wcześniejszym opisem.

Wyniki

Głównym celem niniejszej pracy było opracowanie oraz zbadanie stabilności i odporności kolorymetrycznych testów opartych na AuNP i aptamerach do zastosowań terenowych. Jak podkreślono w poprzedniej publikacji, zbadano dwie odrębne strategie opracowania testu⁷. Testy te nazwano testem z wolnym aptamerem (Free Aptamer Assay) oraz testem z zaadsorbowanym aptamerem (Adsorbed Aptamer Assay). Test z zaadsorbowanym aptamerem był bardziej odpowiedni do celów terenowego testu detekcyjne...

Dyskusja

W ciągu ostatniej dekady opracowano kolorymetryczne testy oparte na nanocząsteczkach do wykrywania celów takich jak małe cząsteczki, DNA, białka oraz komórki^2-4. Testy wykorzystujące aptaminy DNA z nanocząstkami zyskują na znaczeniu. Zazwyczaj testy kolorymetryczne wykonuje się przez zmieszanie aptamiera DNA z cząsteczkami analitu, a następnie dodaje się AuNP^9-10. Jednak te testy były wykorzystywane w demonstracjach dowodzenia koncepcji w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych oraz przy ograniczon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydrat chlorku złota(III)	Sigma	254169	Czystość 99,999% jest ważna, a rozwiązania były za każdym razem świeże
Cytrynian sodu dwuwęglanu	Sigma	W302600-1KG-K	Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP, a roztwory były za każdym razem przygotowywane na świeżo
Synergia	Bio-TEK	HT	Każdy spektrometr absorpcji będzie działał, ale czytnik płyt umożliwia analizę wielu próbek
4-(2-hydroksyetylo)piperazyna-1-etanolowy kwas (HEPES) Bufor, 1  M sterylizowany	Amresco	J848	Każda sterylna marka będzie odpowiednia
Corning, system filtrujący 250 ml, 0,22 i nbsp; &mikro; Octan celulozy m	Rybak	430767	Inne błony zostały stwierdzone, że usuwają AuNP
Spektrofotometr UV	Varian	Cary 300	Każdy spektrometr absorpcji będzie działał
Chlorek magnezu – heksahydrat	Fluka	63068	≥ 98% każdej marki się sprawdzi
DNA	IDT	Zwyczaj	DNA zostało oczyszczone kolumną odsolniającą, można stosować wyższe techniki oczyszczania
Prokaina chlorowodorek	ACROS	AC20731-1000	Przygotowano 99% zapasów 1 mg/ml metanolu
Kwas solny	Rybak	A144S-500	36,5-38,0% innych marek będzie działać
Kokainowy chlorek	Lipomed	COC-156-HC-1LM	Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP
Kwas azotowy	Rybak	A509-SK212	65% innych marek będzie działać
Roztwór chlorku sodu, o stężeniu bioreagentów 5 M	Sigma	S5150-1L	Roztwory sterylne wykonane z materiałów stałych będą skuteczne
Pirowęglan dietylu	Sigma	D5758-25 mL	≥ W 97% każda marka się sprawdzi
Ekgoninoemetylester chlorowodorkowodórkowy	Lipomed	COC-205-HC-1LM	Uzyskaliśmy kontrolę EME od tego samego producenta, co cel kokainowy
Rurki mikrowirówkowe, Axygen Scientific, niesterylne, 1,7  Ml	VWR	10011-722	Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP, a probówki były autoklawowane na miejscu
Woda wolna od nukleazy
metanol