Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

Podsumowanie

Analizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu nanocząsteczkowego aptamera i złota do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań terenowych. Dodatkowo zatwierdzono aplikację kolorymetryczną (smart-device) oraz ustalono długoterminowe przechowywanie testu do użytku w terenie.

Streszczenie

Przeanalizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu aptamino-złoto-nanocząsteczkowego (AuNP) do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań w terenie. Selektywne testy kolorowe oparte na AuNP zostały opracowane w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych proof-of-concept. Jednak te schematy nie zostały wykorzystane do granic porażki, aby określić ich praktyczne zastosowanie poza warunkami laboratoryjnymi. Praca ta opisuje ogólne podejście do projektowania, opracowywania i rozwiązywania problemów kolorymetrycznego testu aptamer-AuNP dla analizowanych cząsteczek oraz stosowania testu w terenowych warunkach. Test jest korzystny, ponieważ adsorbowane aptamery pasywują powierzchnie nanocząstek i umożliwiają ograniczenie oraz eliminację fałszywie pozytywnych odpowiedzi na anality niebędące celami. Przejście tego systemu do praktycznych zastosowań wymagało nie tylko określenia okresu przydatności testu aptamer-AuNP, ale także ustanowienia metod i procedur rozszerzających możliwości długoterminowego przechowywania. Jednym z rozpoznanych problemów związanych z odczytem kolorymetrycznym jest obciążenie analityków, którzy muszą dokładnie identyfikować często subtelne zmiany koloru. Aby zmniejszyć odpowiedzialność analityków w terenie, opracowano protokół analizy kolorów, który umożliwiał wykonywanie obowiązków identyfikacji kolorów bez konieczności wykonywania tego zadania na sprzęcie laboratoryjnym. Opisano metodę tworzenia i testowania protokołu analizy danych. Jednak aby zrozumieć i wpłynąć na projektowanie adsorbowanych testów aptamerowych, interakcje związane z aptamerem, celem i AuNP wymagają dalszych badań. Zdobyta wiedza może doprowadzić do dostosowania aptamerów pod kątem poprawy funkcjonalności.

Wprowadzenie

Kolorymetria jest jedną z najstarszych technik stosowanych w chemii analitycznej. W tej technice jakościowe lub ilościowe określa się analit na podstawie produkcji związku kolorowego¹. Zazwyczaj testy kolorowe wykorzystują odczynniki, które ulgają zmianie koloru w obecności gatunku analitu, co skutkuje obserwowalną lub wykrywalną zmianą koloru w widzialnym spektrum światła. Kolorimetria była wykorzystywana do wykrywania celów obejmujących atomy, jony i małe cząsteczki po złożone cząsteczki biologiczne, takie jak kwasy deoksyrybonukleinowe (DNA), peptydy i białka^2-4. Przez ostatnie dwie dekady nanomateriały zrewolucjonizowały dziedzinę testów detekcyjnych, szczególnie w przypadku testów kolorowych^5-6. Połączenie unikalnych właściwości chemicznych i fizycznych nanomateriałów z elementem selektywnego rozpoznawania celów, takimi jak przeciwciała, oligonukleotydowe aptamery czy aptamery peptydowe, doprowadziło do odrodzenia projektowania i rozwoju kolorymetrycznych testów detekcyjnych⁷.

Nanocząstki metalu wykazują udokumentowaną zależność od rozmiaru właściwości zmiany koloru, co zostało wykorzystane w projektowaniu licznych testów kolorymetrycznych. Nanocząstki złota (AuNP) są szczególnie interesujące ze względu na charakterystyczne przejście koloru z czerwono-niebieskiego, gdy rozproszony roztwór cząstek zostaje indukowany do agregacji⁸, zazwyczaj poprzez precyzyjne dodanie soli. Możliwość kontrolowania przejścia ze stanów rozproszonych (czerwonych) do zagregowanych (niebieskich) doprowadziła do powstania czujników kolorymetrycznych dla celów jonowych, małych molekularnych, peptydowych, białkowych i komórkowych^2-4,9. Wiele z tych czujników wykorzystuje aptamery jako motyw rozpoznania celów.

Aptamery to cząsteczki DNA lub kwasu rybonukleinowego (RNA) wybierane z losowej puli 10,^12-10,¹⁵ różnych sekwencji,^10-11. Proces selekcji identyfikuje elementy rozpoznawające cele z powinowactwami wiązanymi w niskim reżimie nanomolowym, a systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) jest najczęściej znanym procesem^12-13. Zalety aptamerów opartych na oligonukleotydach do zastosowań pomiarowych to łatwość syntezy, kontrolowana modyfikacja chemiczna oraz stabilność chemiczna^14-15.

Jednym z podejść do tworzenia testu kolorymetrycznego łączącego nanomateriały z elementami rozpoznawczymi jest połączenie tych dwóch gatunków poprzez fizyczną adsorpcję cząsteczek aptamerów DNA na powierzchniach AuNP. Poprzez wiązanie cel-aptamer aptamer ulega zmianie strukturalnej^16-18 , która zmienia interakcję aptamera z powierzchnią AuNP, prowadząc do indukowalnej odpowiedzi koloru czerwono-niebieskiego¹⁹ po dodaniu soli. Ta zdumiewająca cecha AuNP zapewnia obserwowalny mechanizm odpowiedzi kolorymetrycznej dla urządzeń opartych na aptamerze, który może być używany do projektowania kolorymetrycznych testów dla różnych analitów.

Testy kolorowe zaprojektowane z wykorzystaniem niekowalencjnych, fizycznie adsorbowanych aptamerów DNA na powierzchniach AuNP mają piętno słabej platformy sensorowej ze względu na problemy z odpornością, skłonność do awarii poza kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi oraz brak dostępnych informacji do praktycznego zastosowania. Jednak kolorymetryczny test oparty na aptamerze AuNP był interesujący ze względu na prostotę działania i obserwowalną reakcję kolorową. Celem tych prac jest dostarczenie protokołu do projektowania, rozwoju, działania, redukcji fałszywie pozytywnej odpowiedzi na powierzchnię oraz długoterminowego przechowywania kolorymetrycznych testów opartych na DNA-AuNP, wykorzystujących kokainę jako reprezentatywny analit. Ponadto zaproponowaliśmy podejście adsorbowanego testu aptaminowego (Rysunek 1) jako korzystne ze względu na prostotę i łatwość użycia, co skutkowało mniejszą liczbą kroków niż konwencjonalne podejście do tych testów aptamer-AuNP. Do tego testu aptamer najpierw dodano do AuNP, które mogły adsorbować powierzchnię przez dłuższy czas. Dodatkową zaletą tego podejścia było zmniejszenie odpowiedzi na niecelowe cząsteczki analitu związane z interakcjami powierzchniowymi AuNP. Jednak zmniejszenie liczby fałszywie pozytywnych wyników odbyło się kosztem wrażliwości testu. Dlatego konieczne jest zachowanie równowagi między ochroną powierzchniową a dostępnością analitu, aby utrzymać prawidłową funkcjonalność testu. Co więcej, główną wadą analizy testów kolorowych innymi metodami niż instrumentacja jest to, że wyniki są często subiektywne i otwarte na interpretację z perspektywy analityka, szczególnie przy próbie rozróżnienia subtelnych różnic kolorowych. Z kolei istnieje wiele problemów związanych z uzyskiwaniem instrumentów laboratoryjnych poza laboratorium, takich jak dostępność zasilania, praktyczność i przenośność itp. W tej pracy opracowano protokół analizy kolorów dla większej mobilności oraz wyeliminowania części domysłów typowych związanych z interpretacją testów kolorowych^20-21. W porównaniu z wcześniejszymi podejściami, ten wysiłek dążył do wyciągnięcia tych testów do granic możliwości zastosowań wykraczających poza warunki laboratoryjne.

Protokół

1. Synteza poprzez redukcję cytrynianu nanocząstek złota (AuNP) i charakteryzacja

1. Oczyść kolbę Erlenmeyera (500 ml) i duży batonik mieszający 5 ml skoncentrowanego kwasu azotowego i 15 ml skoncentrowanego kwasu solnego w okapie chemicznym.
   1. Zwilż całą powierzchnię kolby kwasowym washem, opłucz kolbę wodą wolną od nukleazy i pozwól kolbie wyschnąć.
2. Dodaj 100 ml chlorku złota(III) o zawartości 1 mM zawartości złota; użyj arkusza folii aluminiowej, aby przykryć wierzch kolby Erlenmeyera oczyszczonej kwasem i podgrzewać z ciągłym mieszaniem na gorącej płycie, aż zagotuje.
3. Dodaj 10 ml cytrynianu sodu o stężeniu 38,8 mM. Kolor zmienia się od przezroczystego/szarego, przez ciemnoniebieski/, aż do ciemnoczerwonego przez kilka minut. Kontynuuj mieszanie z wyłączonym ogniem przez 10 minut.
4. Pozostawić zawiesinę AuNP do temperatury pokojowej i dodać 110 μl dietylopirowęglanu (DEPC) z ciągłym mieszaniem.
5. Całą kolbę przykryj folią aluminiową i pozwól zabiegowi DEPC inkubować przez noc. Przechowuj wszystkie AuNP w ciemności, w bursztynowych pojemnikach lub przykrytych folią aluminiową.
6. Autoklaw zawiesinę AuNP, schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować przez membranę celulozową o średnicy 0,22 μm. Przechowuj filtrowany, autoklawowany roztwór AuNP w ciemności w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Leczenie DEPC, sterylizacja autoklawem i przechowywanie w temperaturze 4 °C poprawią trwałość testu aptamer-AuNP. Takie przechowywanie pozwoli testowi pozostać funkcjonalnym przez ponad 2 miesiące.
7. Oblicz stężenie AuNP, uzyskując absorpcję w ultrafioletowym świetle widzialnym na 520 nm, a współczynnik wygaszania (Ɛ) 2,4 x 10 8 L ^{mol-1 cm-1} według prawa Beera, obliczając stężenie (c). Stężenie zostało określone na 10 nM, a wielkość 15 nm, określone przez dynamiczne rozpraszanie światła.
   UWAGA: Stężenia będą się różnić w poszczególnych partiach. Rozcieńczaj zasoby AuNP wodą wolną od nukleazy w razie potrzeby, aby utrzymać pożądaną zawieszinę AuNP 10 nM.

2. Przygotowanie do aptamera DNA, buforu, roztworu i testu

1. Kup lub zsyntetyzuj następujące sekwencje aptamera wiążącego kokainę, używając standardowej chemii fosforamiditowej²²:
   MN4¹⁹: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3'
   MN6¹⁹: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3'
2. Oczyść aptamery za pomocą standardowego odsolania²³. Rekonstytucja oligonukleotydów w wodzie wolnej od nukleazy w roztworach zapasowych o pojemności 100 μM lub 1 mM. Zachowaj i przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
3. Kup lub przygotuj zapasy sterylnego 1 M 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowego (HEPES) o pH 7,4, 100 mM chlorku magnezu (_MgCl2) oraz 1 M chlorku sodu (NaCl).
4. Przygotuj 50 ml buforu w wodzie wolnej od nukleazy o stężeniach 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2_{, pH} 7,4 i przechowuj w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
5. Inkubuj DNA w oryginalnym roztworze AuNP (10 nM) przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej i chroń przed światłem. Zmieniaj objętość AuNP według potrzeb, aby uzyskać wystarczającą ilość próbki do przeprowadzenia testów (2,5-7,5 ml).
   1. W tej pracy użyj gęstości obciążenia 90, 120, 150 i 180 cząsteczek DNA/AuNP. Odpowiednio zmieniaj objętość i stężenie DNA. Dostrajaj pokrycie DNA, aby zmniejszyć niezamierzone odpowiedzi kolorystyczne związane z powierzchnią AuNP u analitów niebędących celami.
      UWAGA: Zwiększenie pokrycia DNA zmniejszy czułość testu. Gęstości obciążenia oblicza się na podstawie znajomości stężenia zapasów AuNP oraz całkowitej liczby obecnych AuNP w objętości pożądanej do eksperymentów. Jeśli pożądane są rzeczywiste gęstości pokrycia, istnieją protokoły pozwalające uzyskać te wartości⁷. Pokrycie DNA zostało określone za pomocą kolumny spinowej o masie cząsteczkowej 50 kDa, która oddzieliła DNA związane z AuNP od wolnego. AuNP są zbyt duże, by przejść przez kolumnę spinową, podczas gdy wolne DNA przechodzi przez nią bez problemu. Kolejnym krokiem jest ilościowe określenie wolnego DNA pobranego za pomocą pomiarów absorpcji lub pojedynczej nici fluorescencyjnego barwnika DNA.
6. Dodaj równą objętość 20 mM HEPES, 2 mM_MgCl2, bufor pH 7,4 i umieść próbkę w temperaturze 4 °C w ciemności na noc. Test aptamer-AuNP wykonano w 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2_{, pH} 7,4 (bufor testowy).

3. Titracja solą i przygotowanie testu

1. Określ początkowe stężenie soli potrzebne do wywołania odpowiedzi kolorowej testu poprzez miareczkowanie soli za pomocą pustego materiału testowego. Dodaj 20 μl metanolu (pustego) do 180 μl aliquotów aptamer-AuNP w płytce z 96 dołkami. Titruj próbki z rosnącą ilością roztworu NaCl (1 M lub 2 M) i określ punkt równoważności (Rysunek 2).
   UWAGA: Test można skalować do mniejszych objętości, utrzymując ten sam stosunek metanolu pustego (lub rozpuszczonego analitu) do aptamera-AuNP.
   1. Tutaj określ objętość NaCl potrzebną do wywołania najmniejszej zmiany koloru na podstawie obserwacji wzrokowej. Początkowe stężenie testu wynosiło odpowiednio 75 mM i 130 mM dla MN4 i MN6, przy gęstości pokrycia 60 cząsteczek DNA/AuNP.
      UWAGA: Do ilościowego określenia początkowego stężenia soli dobrym punktem wyjścia jest środek krzywej miareczki. Ponadto stężenia stosowane będą się różnić w zależności od aptamera, gęstości pokrycia DNA, codziennych wyników oraz partii do partii.
2. Aby zoptymalizować odpowiedź testu, dodaj 20 μl cząsteczek analitu rozcieńczonych w metanolu do 180 μl aliquotów aptamer-AuNP w płytce z 96 dołkami w temperaturze pokojowej. Natychmiast dodaj stężenie NaCl ustalone w poprzednim kroku, aby rozpocząć odpowiedź kolorową testu.
   UWAGA: Użyj pipety wielokanałowej do przeprowadzania wielu eksperymentów jednocześnie.
3. Uzyskaj możliwą możliwą zmianę koloru, zwiększając lub zmniejszając stężenie NaCl oraz porównując docelową odpowiedź z odpowiedzią pustą. Użyj stężenia NaCl, które daje największą różnicę w odpowiedzi.
4. Obserwuj lub mierz odpowiedź testu 150 sekund po dodaniu NaCl. Przeanalizuj absorpcję na 650 nm i 530 nm za pomocą spektrometru lub pobierz zdjęcie odpowiedzi testu aparatem cyfrowym (patrz sekcja 4 protokołu analizy zdjęć).
   UWAGA: Do uzyskania pomiarów do tej pracy użyto czytnika mikropłyt.
5. Wyniki przedstawiamy jako stosunek absorpcji uzyskany przy 650 nm i 530 nm (E₆₅₀/E₅₃₀) w funkcji stężenia analitu. Znormalizuj odpowiedź testu na sygnał pusty, tak jak zrobiono w tej pracy.

4. Analiza protokołu analizy kolorów zdjęć i obrazów cyfrowych

1. Przygotuj próbki testów zgodnie z opisem (sekcje 3.2-3.3). Umieść płytę z 96 dołkami na transiluminatorze.
   UWAGA: Standardowy laboratoryjny transiluminator jest zazwyczaj zbyt jasny, aby uzyskać użyteczne obrazy cyfrowe do tej analizy. Te transiluminatory powodują, że w obrazie cyfrowym pojawiają się regularnie rozmieszczone "ciemne linie" ze względu na intensywność źródła światła. Zrobienie transiluminatora z lampy LED i kawałka nieprzezroczystego plastiku sprawdza się dobrze.
2. Pobierz zdjęcia płyty 96-dołkowej 150 sekund po dodaniu NaCl, zaimportuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazów i oblicz średnie wartości czerwonego, zielonego i niebieskiego (RGB), stosując technikę uśredniania przyrostowego, jak pokazano w równaniu¹²⁴:
   (1)
3. Przekonwertuj wartości RGB ze standardowej przestrzeni kolorów RGB (sRGB) na przestrzeń kolorów diagramu chromatyczności (CIExyY), używając następujących równań²⁴:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Przelicz wykładnicze wartości RGB na liniowe RGB, stosując równanie 2. Macierz określona w równaniu 3 służy do obliczenia wartości X, Y i Z w przestrzeni kolorów CIE²⁴.
5. Oblicz wartości chromatyczności x i y za pomocą równania 4, które reprezentuje średni kolor pikseli w wybranym obszarze do analizy²⁴.
6. Wykonaj analizę w każdej studni i wykreśl wartości chromatyczności, aby wygenerować krzywą kalibracyjną (Rysunek 4). Uzyskaj błąd standardowy, analizując kolor różnych obszarów tej samej studni.

5. Test Aptamer-AuNP do długotrwałego przechowywania

1. Przygotuj komponenty testu aptamer-AuNP zgodnie z sekcjami 2.4 i 2.5. Przygotuj oddzielne roztwory zawierające 1 g/ml trehalozy i 1 g/ml sacharozy w wodzie wolnej od nukleazy, aby uzyskać roztwór kriogenu.
   UWAGA: Wysokie stężenia trehalozy i sacharozy zostały użyte do zmniejszenia współczynnika rozcieńczenia podczas przygotowywania testu do zamrażania. Podgrzej roztwory cukru na gorącej płycie w zlewce z wodą, aby dokładnie rozpuścić cukry przed użyciem.
2. Przygotować roztwór zawierający 19,2 mg/ml trehalozy i 4,8 mg/ml sacharozy z testem 60 MN4-DNA/AuNP o końcowej objętości 200 μl w rurkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Końcowe stężenia roztworu kriogenowego będą się różnić w zależności od pokrycia DNA.
   UWAGA: Próbki mrożone nie powinny przekraczać 300 μl. Większe objętości mogą nie zamrożeni prawidłowo.
3. Próbki zamrozić błyskawicznie za pomocą zamrażarki o temperaturze -146 °C lub w ciekłym azocie. Przechowuj próbki zamrożone do czasu użycia. Po zakończeniu błyskawicznego zamrażania magazyn może mieć temperaturę -80 °C lub -20 °C.
4. Do tej pracy należy zostawić próbki na noc w zamrażarce o temperaturze -146 °C, a następnie przenieść je do zamrażarki o temperaturze -20 °C na długoterminowe przechowywanie.
   UWAGA: Błyskawiczne zamrożenie może powodować agregację aptamer-AuNP. Sprawdź integralność procesu zamrażania, monitorując profil absorpcji i porównując go z niezamrożoną próbką. Jeśli zaobserwuje się agregację, należy zwiększyć ilość roztworu kriogenu, aby zrekompensować ten problem.
5. Rozmraź próbki w temperaturze pokojowej i używaj tylko tylu potrzebnych do eksperymentów. Pobierz spektra absorpcji rozmrożonych próbek i porównaj je z widmami bazowymi próbki obtraktowanej roztworem kriogenu. Zmierz absorpcję od 400 nm do 700 nm.
6. Wykonaj miareczkowanie soli (sekcja 3.1), przetestuj test (sekcja 3.2) i narysuj wyniki (sekcje 3.3 i 3.4) zgodnie z opisaniem wcześniej.

Wyniki

Głównym celem tych badań było opracowanie i zbadanie stabilności oraz odporności kolorymetrycznych testów AuNP opartych na aptamerach do zastosowań w terenie. Jak podkreślono w poprzedniej publikacji, badane były dwie odrębne strategie tworzenia testu⁷. Testy te nazywano Wolnym Aptamierowym Testem oraz Adsorbowanym Aptamerowym Testem. Asej adsorbowany był bardziej atrakcyjny dla celów testu wykrywalnego (Rysunek 1).

Dyskusja

W ciągu ostatniej dekady opracowano kolorymetryczne testy oparte na nanocząsteczkach do wykrywania celów takich jak małe cząsteczki, DNA, białka oraz komórki^2-4. Testy wykorzystujące aptaminy DNA z nanocząstkami zyskują na znaczeniu. Zazwyczaj testy kolorymetryczne wykonuje się przez zmieszanie aptamiera DNA z cząsteczkami analitu, a następnie dodaje się AuNP^9-10. Jednak te testy były wykorzystywane w demonstracjach dowodzenia koncepcji w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych oraz przy ograniczon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydrat chlorku złota(III)	Sigma	254169	Czystość 99,999% jest ważna, a rozwiązania były za każdym razem świeże
Cytrynian sodu dwuwęglanu	Sigma	W302600-1KG-K	Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP, a roztwory były za każdym razem przygotowywane na świeżo
Synergia	Bio-TEK	HT	Każdy spektrometr absorpcji będzie działał, ale czytnik płyt umożliwia analizę wielu próbek
4-(2-hydroksyetylo)piperazyna-1-etanolowy kwas (HEPES) Bufor, 1  M sterylizowany	Amresco	J848	Każda sterylna marka będzie odpowiednia
Corning, system filtrujący 250 ml, 0,22 i nbsp; &mikro; Octan celulozy m	Rybak	430767	Inne błony zostały stwierdzone, że usuwają AuNP
Spektrofotometr UV	Varian	Cary 300	Każdy spektrometr absorpcji będzie działał
Chlorek magnezu – heksahydrat	Fluka	63068	≥ 98% każdej marki się sprawdzi
DNA	IDT	Zwyczaj	DNA zostało oczyszczone kolumną odsolniającą, można stosować wyższe techniki oczyszczania
Prokaina chlorowodorek	ACROS	AC20731-1000	Przygotowano 99% zapasów 1 mg/ml metanolu
Kwas solny	Rybak	A144S-500	36,5-38,0% innych marek będzie działać
Kokainowy chlorek	Lipomed	COC-156-HC-1LM	Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP
Kwas azotowy	Rybak	A509-SK212	65% innych marek będzie działać
Roztwór chlorku sodu, o stężeniu bioreagentów 5 M	Sigma	S5150-1L	Roztwory sterylne wykonane z materiałów stałych będą skuteczne
Pirowęglan dietylu	Sigma	D5758-25 mL	≥ W 97% każda marka się sprawdzi
Ekgoninoemetylester chlorowodorkowodórkowy	Lipomed	COC-205-HC-1LM	Uzyskaliśmy kontrolę EME od tego samego producenta, co cel kokainowy
Rurki mikrowirówkowe, Axygen Scientific, niesterylne, 1,7  Ml	VWR	10011-722	Zauważyliśmy, że producent ma duży wpływ na testy AuNP, a probówki były autoklawowane na miejscu
Woda wolna od nukleazy
metanol