Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Podsumowanie

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Streszczenie

Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, znana również jako ilościowy PCR (q-PCR), jest szeroko stosowanym narzędziem w ekologii mikrobiologicznej do ilościowego określania obfitości genów grup taksonomicznych i funkcjonalnych w próbkach środowiskowych. Stosowany w połączeniu z reakcją odwrotnej transkryptazy (RT-q-PCR), może być również stosowany do ilościowego oznaczania transkryptów genów. q-PCR wykorzystuje bardzo czułe chemikalia do detekcji fluorescencyjnej, które umożliwiają ilościowe oznaczanie amplikonów PCR podczas wykładniczej fazy reakcji. W związku z tym unika się odchyleń związanych z PCR "punktu końcowego" wykrytym w fazie plateau reakcji PCR. Dostępny jest protokół ilościowego oznaczania genów i transkryptów bakteryjnego 16S rRNA z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Po pierwsze, przedstawiono metodę koekstrakcji DNA i RNA z osadów przybrzeżnych, w tym dodatkowe etapy wymagane do przygotowania RNA wolnego od DNA. Po drugie, przedstawiono przewodnik krok po kroku dotyczący kwantyfikacji genów 16S rRNA i transkryptów z wyekstrahowanych kwasów nukleinowych za pomocą q-PCR i RT-q-PCR. Obejmuje to szczegóły dotyczące budowy standardowych krzywych DNA i RNA. Uwzględniono kluczowe zagadnienia dotyczące stosowania testów RT-q-PCR w ekologii drobnoustrojów.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy są kamieniem węgielnym biosfery napędzającej funkcjonowanie ekosystemu. Większość mikroorganizmów pozostaje niehodowlana¹. Dlatego podejścia oparte na molekularach mają zasadnicze znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat różnorodności i funkcji mikroorganizmów w środowisku. Kluczowe znaczenie dla tych podejść ma ekstrakcja kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych, a następnie amplifikacja docelowych genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Pierwszy etap ekstrakcji DNA/RNA ma na celu lizę ścian komórkowych obecnej społeczności mikrobiologicznej, usunięcie niepożądanych cząsteczek niebędących kwasami nukleinowymi (np. substancji organicznych i nieorganicznych) oraz zachowanie DNA/RNA w roztworze do dalszej analizy. Wśród kilku opcji dostępnych w literaturze^2,3,4,5, w tym szeregu komercyjnych zestawów do ekstrakcji, metoda Griffithsa⁶ jest szeroko stosowana^7,8,9. Jest ekonomiczny i szczególnie dobrze nadaje się do osadów, ponieważ wykorzystuje etap ubijania kulek do lizy komórek i zawiera etapy minimalizujące koekstrakcję inhibitorów PCR, takich jak kwasy humusowe, przy jednoczesnym odzyskiwaniu DNA i RNA.

Drugi krok wykorzystuje reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do amplifikacji docelowych genów, takich jak marker taksonomiczny 16S rRNA, z wyekstrahowanych kwasów nukleinowych. Takie podejście ułatwiło i nadal ułatwia eksplorację niescharakteryzowanej mikrobiologicznej czarnej skrzynki^10,11. Jednak metody oparte na PCR w punkcie końcowym mają różne ograniczenia, które mogą wpływać na charakterystykę społeczności drobnoustrojów¹². Aby dokładnie określić ilościowo obfitość genów/transkryptów, należy zastosować PCR w czasie rzeczywistym, znany również jako ilościowy PCR (qPCR). qPCR wykorzystuje fluorescencyjne systemy barwników reporterowych, które śledzą akumulację amplikonów po każdym cyklu PCR. Jest to istotne, ponieważ oznacza, że kwantyfikacja może nastąpić we wczesnej fazie wykładniczej, a nie w końcowej fazie reakcji PCR, kiedy wydajność amplikonu jest nadal wprost proporcjonalna do początkowej obfitości docelowego genu.

Dwa systemy reporterowe są powszechnie używane: interkalacyjne barwienie kwasem nukleinowym¹³ i aktywność egzonukleazy 5' 3' polimerazy DNA¹⁴. Ponieważ poprzedni system reporterowy wiąże się niewyraźnie ze wszystkimi dwuniciowymi DNA, może to prowadzić do przeszacowania sekwencji docelowej, jeśli wystąpią niepożądane niespecyficzne amplikony lub dimery starterów produktów ubocznych. Aby temu zapobiec, może być wymagana znaczna optymalizacja wzmocnienia. W tym drugim systemie amplifikacja matrycy jest śledzona za pomocą kombinacji aktywności nukleazy 5' polimerazy Taq, która rozszczepia fluorofor z wewnętrznej sondy. Ta cecha zwiększa specyficzność testu ze względu na wykorzystanie sondy fluorogenicznej, która wiąże się tylko z komplementarną sekwencją specyficzną dla celu między parą starterów. W przypadku obu substancji chemicznych kwantyfikacja jest osiągana poprzez określenie punktu przecięcia (Cp), w którym akumulacja amplikonów PCR, mierzona wzrostem fluorescencji, jest znacznie wyższa niż fluorescencja tła.

qPCR jest szeroko stosowany w ekologii mikrobiologicznej do określania obfitości genów w różnych środowiskach¹⁵. Co więcej, odwrotna transkrypcja RNA do cDNA jest łączona z qPCR i RT-qPCR w celu ilościowego określenia ekspresji genów. W związku z tym qPCR i RT-qPCR stanowią szybkie i skuteczne metody ilościowego oznaczania liczby genów i/lub transkryptów w próbkach środowiskowych.

Mikroorganizmy w osadach przybrzeżnych napędzają różne procesy ekosystemowe, w tym mineralizację materii organicznej, degradację zanieczyszczeń i biogeochemiczny obieg makroskładników, takich jak azot^16,17,18. Wyczerpujące zrozumienie tych przemian wymaga kompleksowego opisu przyczyniających się do nich populacji drobnoustrojów, w tym danych ilościowych dotyczących obfitości genów i transkryptów. W tym miejscu przedstawiamy szereg dokładnie przetestowanych, uproszczonych i ustandaryzowanych protokołów do ilościowego oznaczania genu 16S rRNA bakterii i obfitości transkryptów w osadach przybrzeżnych. Protokół określa pobieranie próbek, jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA, otrzymywanie RNA bez DNA, kontrolę jakości wyekstrahowanych kwasów nukleinowych, generowanie wzorców 16S rRNA-DNA i -RNA oraz kwantyfikację próbek środowiskowych. Dane ilościowe uzyskane za pomocą opisanych tu metod są potrzebne, aby rzucić światło na społeczności mikrobiologiczne napędzające ekosystemy przybrzeżne.

Protokół

1. Ekstrakcja DNA i RNA z morskich osadów przybrzeżnych

1. Przygotowanie materiału wolnego od rybonukleaz (RNAzy) i przestrzeni roboczej
   1. Przygotować wodę destylowaną wolną od RNAzy (_dH2O) przez potraktowanie 0,1% dietylowęglanem (DEPC) i inkubować w temperaturze 37 °C O/N. Usunąć pozostałości DEPC przez autoklawowanie dH₂O w temperaturze 121 °C przez 15 min. Użyć dH₂O poddanego działaniu DEPC, aby przygotować wszystkie roztwory.
   2. Piecz wszystkie szklane naczynia w temperaturze 180 °C O/N. Zdejmij plastikowe pokrywki i brzegi, namocz je w roztworze 2 M NaOH O/N i przed użyciem spłucz je środkiem dH₂O nasączonym DEPC.
   3. Przygotować roztwór buforowy CTAB-fosforan zgodnie z tabelą 1.
   4. Przygotować roztwór do wytrącania PEG-NaCl zgodnie z tabelą 2.
   5. Przed rozpoczęciem należy oczyścić wszystkie powierzchnie robocze (tj. stół, mikrowirówkę, wyciąg) i mikropipety za pomocą roztworu odkażającego RNAse. Podczas całego zabiegu należy nosić rękawiczki.
   6. Używaj plastikowych naczyń bez RNAse wraz z końcówkami filtra do mikropipet, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki.
2. Pobieranie i przechowywanie próbek środowiskowych
   1. Zbierz osad przybrzeżny podczas odpływu za pomocą sterylnej probówki sokoła o pojemności 50 ml od góry 2,5 cm. Zbierz około 15-20 g osadów. Po pobraniu próbki ostrożnie zamknij pokrywę. Natychmiast przetransportować do laboratorium w chłodziarce o temperaturze 4 °C w celu natychmiastowego przetworzenia.
   2. Homogenizować próbkę, mieszając sterylną szpatułką i podwielokrotność 0,5 g osadu w mokrej masie w probówce do ubijania kulek o pojemności 2 ml. Podwielokrotność dodatkowych powtórzeń, błyskawiczne zamrażanie przez umieszczenie w ciekłym azocie. Przechowywać porcje w temperaturze -80 °C. Ostrzeżenie: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić rękawice ochronne i okulary ochronne.
      Uwaga: Jeśli miejsce polowe nie znajduje się w pobliżu laboratorium, podwielokrotność 0,5 g osadu należy rozprowadzić w miejscu polowym do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml. Błyskawiczne zamrożenie probówek poprzez natychmiastowe umieszczenie ich w ciekłym azocie i przetransportowanie do laboratorium. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.
3. Koekstrakcja DNA i RNA z osadu
   Uwaga: Poniższy protokół jest zmodyfikowaną wersją metody^{Griffithsa 6}.
   1. Dodać 500 μl buforu fosforanowego CTAB i 500 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) do 2 ml probówki do lizy perełkowej zawierającej 0,5 g osadu i odwrócić probówkę 5-10 razy w celu homogenizacji próbki.
      Ostrzeżenie: Tę czynność należy wykonywać w dygestorium, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny (tj. fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne) przez cały czas.
   2. Wirować z pełną prędkością przez 2,5 minut. Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Z dygestorium ekstrahuje się górną warstwę wody i przenosi do nowej sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Utrzymując próbki na lodzie, dodać 500 μl lodowatego chloroformu:alkoholu izoamylowego (24:1).
   4. Odwróć kilka razy, aż emulsja będzie widoczna. Wirować przez 10 minut przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C.
   5. Z dygestorium ekstrahować górną warstwę wody i umieszczać ją w nowej sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. Wytrącić kwasy nukleinowe, dodając dwie objętości 30% roztworu PEG-NaCl i dobrze wymieszać.
   6. Inkubować na lodzie przez 2 godziny lub pozostawić próbki w temperaturze 4 °C O/N.
   7. Pod koniec inkubacji odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Na dnie rurki może być widoczny granulek.
   8. Delikatnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety, uważając, aby nie naruszyć osadu. Pozostaw około 10 μl roztworu PEG w probówce i dodaj 1 ml lodowatego 70% etanolu.
   9. Wirować przez 20 minut przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C. Powoli usunąć etanol za pomocą mikropipety, uważając, aby nie dotknąć granulki.
   10. Wirować przez 5 sekund i usunąć resztki etanolu za pomocą mikropipety. Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez około 5 minut.
   11. Ponownie zawiesić osad w 50 μl H₂O, poddanym działaniu DEPC. Zbadaj jakość i wydajność DNA/RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w ilości 5 μl na 1% żelu agarozowym¹⁹. Podziel kwasy nukleinowe na dwie podwielokrotności, 15 μl dla DNA i 30 μl dla RNA.
   12. Przechowywać DNA w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebne. Wyizoluj RNA zgodnie z opisem w następnej sekcji.

2. Przygotowanie RNA i kontrola jakości RNA wolnego od DNA

1. Trawienie DNA
   1. Dodać 3 μl buforu DNAzy I i 1,5 μl DNAzy I do objętości 30 μl kwasów nukleinowych, inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   2. Mieszać odczynnik do inaktywacji DNAzy przez wirowanie przez 30 sekund. Dodać 4,8 μl roztworu do próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, od czasu do czasu postukać w dno probówek, aby wymieszać roztwór.
   3. Wirować przy 10 000 x g przez 90 sekund w temperaturze pokojowej, przenieść supernatant (RNA) do nowej probówki, uważając, aby nie przenieść osadu, który może zahamować dalsze reakcje.
2. Kontrola jakości RNA
   1. Dodać 2 μl RNA do 18 μl sterylnego dH₂O wolnego od RNAz, aby rozcieńczyć w stosunku 1:10.
      1. W oddzielnych reakcjach PCR dodaj 1 μl czystego lub 1:10 rozcieńczenia RNA do sterylnej probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Dodać składniki reakcji PCR w celu amplifikacji genu 16S rRNA zgodnie z tabelą 3. Obejmują "dodatnią" (np. DNA wyekstrahowaną z czystej kultury bakteryjnej), kontrolę "inhibitora PCR" (tj. 1 μl dodatniego DNA czystej kultury i 1 μl starannie wyekstrahowanego RNA) oraz "ujemną" kontrolę sterylnego dH₂O wolnego od RNAzy.
   2. Ustaw termocykler z następującymi parametrami amplifikacji: 95 °C 5 min, (95 °C 30 sek., 57 °C 30 sek., 72 °C 1 min) x 35 cykli, 72 °C 10 min.
   3. Uruchomić 10% produktu PCR na 1% żelu agarozowym przy napięciu 85 V przez 40 minut. Powtórzyć zabieg DNAzy I, jeśli w próbkach RNA środowiska powstaje produkt PCR.

3. Generowanie pierwszej nici cDNA z RNA

1. Dodać odczynniki zgodnie z tabelą 4 do probówki PCR o pojemności 0,2 ml wolnej od RNAzy/DNAzy.
2. Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Umieścić na lodzie przez co najmniej 1 minutę, a następnie inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
3. Do tej samej probówki dodać odczynniki wymienione w tabeli 5.
4. Inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 50 minut. Dezaktywować reakcję w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
5. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

4. Ilościowy PCR

1. Generowanie wzorców DNA do qPCR
   1. Amplifikacja bakteryjnej sekwencji 16S rRNA²⁰ (lub dowolnej innej interesującej sekwencji) z genomowego DNA wyekstrahowanego z czystej kultury za pomocą starterów q-PCR (1369F i 1492R²¹).
   2. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Sklonuj oczyszczony produkt PCR do systemu wektorów klonowania z nawisem 3'-T zgodnie z instrukcjami producenta.
   4. Przekształć wektor zawierający wstawkę PCR w kompetentne komórki Escherichia coli JM109 zgodnie z instrukcjami producenta.
   5. Płytka 50 μl przemiany na ampicylinę (100 μg/ml), X-gal (20 μg/ml) i IPTG (0,5 mM) płytki agarowe Luria Bertani (Trypton 10 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L, NaCl 10 g/L, Agar 15 g/L). Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
   6. Wybierz pojedynczy dodatni biały transformant z płyty. Zaszczepić dodatni transformant w 50 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować O/N, wytrząsając z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
   7. Z kultury O/N wyizolować i oczyścić plazmid za pomocą zestawu handlowego zgodnie z instrukcjami producenta.
   8. Linearyzować plazmid za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który jest w stanie jednokrotnie przeciąć plazmid (np. EcoRI).
   9. Przeanalizować czystość plazmidu, mierząc współczynnik absorpcji A₂₆₀/A₂₈₀¹⁹. Jeśli stosunek jest mniejszy niż 1,8, ponownie wyekstrahuj plazmid za pomocą fenolu-chloroformu¹⁹. Uwaga: Czyste DNA ma stosunek 1,8.
   10. Oznaczyć stężenie plazmidowego DNA przez absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru¹⁹.
       Uwaga: Alternatywnie, dokładność oznaczania ilościowego można poprawić, stosując fluorescencyjny barwnik wiążący DNA stosowany w połączeniu z fluorometrem.
   11. Zsekwencjonuj wstawkę plazmidu, aby potwierdzić rozmiar celu w zasadach. Obliczyć ilość (tj. procent) wstawienia DNA w plazmidzie (np. w wektorze 3 000 pz fragment DNA o długości 123 pz stanowi 3,9% całkowitego DNA) i pomnożyć go przez stężenie otrzymane w ppkt 4.1.10, aby określić stężenie DNA w celu (wstawce).
   12. Użyj poniższego równania, aby obliczyć kopie wartości docelowej na μl:
       
   13. Obliczyć docelową masę cząsteczkową (TMW), mnożąc liczbę par zasad docelowego DNA przez średnią masę cząsteczkową dwuniciowego DNA (dsDNA, 660 daltonów na parę zasad).
   14. Rozcieńczyć docelowe DNA w zakresie od 10¹⁰ do 10² kopii, używając 2 μl DNA i 18 μl sterylnego dH₂O. Dobrze wymieszać każde rozcieńczenie i krótko odwirować przed wykonaniem następnego rozcieńczenia.
2. Generowanie krzywej wzorcowej RNA dla qPCR
   1. Począwszy od kroku 4.1.5, należy przeprowadzić badanie przesiewowe pewnej liczby białych kolonii (około 5) za pomocą PCR¹⁹ przy użyciu docelowego startera odwrotnego (tj. R1492) i startera plazmidowego wektora M13F.
      Uwaga: Ta kombinacja starterów wzmocni wstawki sklonowane we właściwej orientacji zmysłowej z miejscem promotora T7 przed nim.
   2. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczyć ilościowo oczyszczony produkt PCR przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru.
   3. Dodać 200 ng produktu PCR w końcowej objętości 20 μl z 7,5 mM każdego rybonukleotydu, 1 buforem reakcyjnym T7 i 1 enzymem polimerazy T7 do reakcji transkrypcji in vitro.
   4. Inkubować reakcję przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać 1 jednostkę DNazy I wolnej od RNaz do reakcji, inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia matrycy DNA.
   5. Odzyskać transkrybowany RNA in vitro przez wytrącanie etanolu¹⁹ i określić ilościowo wyniki RNA za pomocą fluorymetru lub przez absorbancję przy 260 nm.
   6. Oblicz liczbę transkryptu na μl RNA. Dodaj liczbę par zasad w docelowym RNA (np. 123 zasady) do długości promotora T7 (153 zasady) i pomnóż przez średnią masę cząsteczkową RNA, 340 daltonów na zasadę.
   7. Dodać 500 ng ilościowo oznaczonego docelowego RNA do reakcji odwrotnej transkryptazy (RT), jak opisano w sekcji 3. Szeregowo rozcieńczyć cDNA zgodnie z opisem w ppkt 4.1.13 w celu użycia jako krzywej wzorcowej.
3. PCR w czasie rzeczywistym
   1. Rozmrozić środowiskowe próbki DNA/cDNA, wzorce i odczynniki qPCR na lodzie. Chroń sondę fluorogeniczną przed światłem.
   2. Rozcieńczyć wzorce dla krzywej standardowej, jak opisano w ppkt 4.1.14. Rozcieńczyć środowiskowe DNA/cDNA w stosunku 1:10 od czystego do ^10-3, dodając 2 μl próbki do 18 μl sterylnego dH₂O.
   3. Przeprowadzić reakcję mieszaniny wzorcowej dla całkowitej liczby reakcji plus 10%, zgodnie z tabelą 6 (startery i sonda) i tabelą 7 (mieszanina reakcyjna). Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj.
   4. Dodać 19 μl mieszanki wzorcowej i 1 μl matrycy (wzorcowej, próbki środowiskowej lub wody do kontroli ujemnej) do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce optycznej qPCR. Każdą reakcję (wzorce, próbki środowiskowe i kontrole ujemne) należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
   5. Przykryj 96-dołkową płytkę osłoną optyczną q-PCR. Krótko odwirować płytkę. Załaduj płytkę do bloku grzewczego maszyny qPCR i zamknij pokrywę.
   6. Otwórz oprogramowanie menedżera qPCR. Kliknij zakładkę "protokół", kliknij "utwórz nowy", dodaj następujące warunki amplifikacji: 3 min 95 °C, (10 s 95 °C, 30 sec 60 °C) x 40 cykli. Ustaw objętość próbki na 20 μl, kliknij "OK" i zapisz protokół.
   7. Kliknij zakładkę "Płyta". W sekcji "edytuj wybrane" klikamy "select fluorophore", dodajemy barwnik raportowy dla odpowiedniej sondy, np. fluoresceiny. Kliknij "OK".
   8. Podświetl studzienki zawierające wzorce, wybierz "standard" z menu "typ próbki". Kliknij "replikuj serię", aby zmienić "rozmiar replikacji" na 3, kliknij "zastosuj". Kliknij "seria rozcieńczeń", aby dodać obliczone stężenie początkowe dla wzorca 1, wskazać współczynnik rozcieńczenia (10), wybrać "malejąco" lub "rosnąc" w zależności od kolejności, w jakiej krzywa wzorcowa została dodana do tabliczki. Kliknij "Zastosuj".
   9. Zaznacz pozycje studzienek zawierające nieznane próbki, wybierz "nieznany" z menu rozwijanego "typ próbki". Kliknij "replikuj serię" i zmień "rozmiar replikacji" na 3. Kliknij "Zastosuj". Edytuj nazwy próbek w sekcji "nazwa próbki". Powtórz procedurę dla studzienek bez kontrolek szablonu (NTC).
   10. Kliknij "OK" w polu edytora płyt i zapisz plik. Kliknij "rozpocznij uruchamianie".
   11. Po zakończeniu przebiegu otworzy się okno analizy danych. Kliknij zakładkę "kwantyfikacja", aby wyświetlić krzywą standardową, deskryptory krzywej standardowej (Tabela 8) i wykresy amplifikacji.
   12. Kliknij zakładkę "dane ilościowe", aby wyświetlić wartości Cp i odpowiadającą im początkową ilość genu (SQ) nieznanych próbek. W razie potrzeby eksportuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego.
   13. Pomnóż obfitość genów z nieznanych próbek przez współczynnik rozcieńczenia, ilość wyekstrahowanego osadu i całkowitą objętość kwasów nukleinowych zostały wymyte, aby uzyskać kopie genów na gram mokrej masy osadu.
       Uwaga: Wypłukać DNA z 0,5 g osadu w 50 μl, rozcieńczyć w stosunku 1/10, dodać 1 μl jako matrycę do reakcji q-PCR; Obliczać Kopie genów ^G-1 Osad przez mnożenie: kopie genów μl DNA x czynnik rozcieńczenia x objętość elucji x 2.

Wyniki

Ekstrakcja dobrej jakości DNA i RNA z osadów jest pierwszym krokiem w ilościowym określeniu obfitości genów i transkryptów. Udana ekstrakcja daje wyraźne prążki DNA i RNA, jak wskazano na rysunku 1 dla próbki A-C, gdzie oprócz pasma genomowego DNA o dużej masie cząsteczkowej widoczne są ostre prążki 23S i 16S rRNA.

Rysunek 1. Ekstrakcja DNA/RNA. Typowe wyniki ekstrakcji DNA/RNA z potrójnych (A-B-C) 0,5 g osadów przybrzeżnych. 5 μl DNA/RNA prowadzono na 1,4% agarozie pod napięciem 85 V przez 40 minut. Zastosowano marker molekularny w zakresie 10 037-200 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby przygotować RNA, konieczne jest trawienie współekstrahowanego DNA. Następnie należy przeprowadzić 16S rRNA w punkcie końcowym PCR RNA, aby upewnić się, że DNA zostało pomyślnie usunięte. Jeśli DNA zostało całkowicie usunięte, obserwuje się tylko prążek w kontroli dodatniej. Ważne jest, aby stosować zarówno czyste, jak i rozcieńczone 1:10 RNA, aby upewnić się, że inhibitory nie zapobiegają tworzeniu się produktu PCR. RNA może teraz przejść reakcję odwrotnej transkryptazy, aby przekształcić go w cDNA. Można to wykonać za pomocą starterów specyficznych dla genu lub losowych heksamerów. Zazwyczaj reakcja przeprowadzana jest w maszynie do PCR, aby zapewnić optymalny profil temperaturowy. To cDNA jest używane jako matryca w późniejszej reakcji qPCR. DNA i RNA są oznaczane ilościowo w celu określenia stężenia matrycy stosowanej w każdej reakcji.

Protokół reakcji qPCR jest opisany jako ukierunkowany na DNA 16S rRNA. W przypadku transkryptów 16S rRNA zastąp krzywą wzorcową i matrycę cDNA. Ponieważ nieznane próbki są oznaczane ilościowo w stosunku do krzywej standardowej, konieczne jest upewnienie się, że krzywa standardowa jest dobrej jakości. Rysunek 2 przedstawia przygotowanie (A) krzywych wzorcowych i środowiskowych rozcieńczeń DNA, (B), amplifikację krzywej wzorcowej i próbek środowiskowych (C), konwersję krzywej standardowej na regresję liniową i obliczenie liczby kopii genów. Gdy 10-krotny zakres rozcieńczeń zostanie prawidłowo przygotowany i wzmocniony, widoczna jest różnica 3,3 cyklu między każdym standardowym rozcieńczeniem (potrzeba 3,3 cykli, aby dziesięciokrotny wzrost matrycy przy 100% wydajności amplifikacji) (rysunek 2Bi). Pożądane są standardowe deskryptory krzywych, w tym wartości R² wynoszące 0,99 i sprawność PCR w zakresie od 90 do 110% (rysunek 2C). Ważne jest, aby zgłaszać wartości Cp z kontrolki braku szablonu (NTC), jeśli jest dostępna. W takim przypadku narzuca się punkt odcięcia Cp dla wzorców i nieznanych próbek o 3,3 cykli (tj. logarytm zagięcia) wyższy niż wartość Cp NTC²⁰ (rysunek 2Cii). Nieznany szablon wyekstrahowany z DNA osadu oznaczono ilościowo z czystych rozcieńczeń ^10-1, ^10-2 i ^10-3 (B). Czysta próbka nie amplifikowała, wartości Cp rozcieńczeń od ^10-1 do ^10-3 wynosiły odpowiednio 24,12, 26,02 i 28,40. NTC Cp wynosił 30,5, nałożono granicę NCT na 27,2. Przekształcenie obfitości genów w osad o mokrej masie ^g-1 dało 2,5 x 10⁷ i 7,1 x 10⁷ odpowiednio dla ^10-1 i ^10-2 dla zakresu rozcieńczenia. Rozcieńczenie ^10-3 Cp znajdowało się poniżej wartości odcięcia NTC i dlatego nie było stosowane. W tym przypadku wybrano ^10-2 jako optymalne rozcieńczenie matrycy.

Rysunek 2. Amplifikacja qPCR genu 16S rRNA wzorców i środowiskowego DNA wyekstrahowanego z osadów przybrzeżnych. Przygotowanie (A) i) krzywej wzorcowej DNA i ii) środowiskowych rozcieńczeń DNA do amplifikacji qPCR, (B) amplifikacji qPCR i) krzywej wzorcowej DNA oraz ii) próbek środowiskowych, Cp dla każdej próbki jest pokazane. (C) i) Regresja liniowa krzywej standardowej z deskryptorami krzywej standardowej; ii) obliczanie obfitości genów na podstawie próbek środowiskowych. NTC: Negatywna kontrola szablonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynnik	kwota
CTAB (Zakład Scal	5 gramów
K2HPO4x3H2O	2,58 grama
KH2PO4	0,1 grama
Zawartość NaCl	2,05 gr
dH2O	do 100 ml

Tabela 1. Przygotowanie buforu fosforanowego CTAB.

Odczynnik	kwota
PEG 6000	30 gramów
Zawartość NaCl	9,35 grama
dH2O	do 100 ml
Uwaga: dodawać PEG 6000 powoli, podgrzewając i mieszając 50 ml dH2O.

Tabela 2. Przygotowanie roztworu do wytrącania PEG-NaCl.

Odczynnik	kwota
Nierozcieńczony RNA / 1:10 rozcieńczony RNA	1,0 μl
10x bufor PCR	5,0 μl
dNTP 10 mM	1,0 μl
Podkład do przodu 63F	1,0 μl
CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC
Podkład odwrotny 518R	1,0 μl
ATT ACC GCG GCT GCT GG
Polimeraza Taq	0,4 μl
Wolne od RNAzy dH2O	40,6 μl

Tabela 3. Kontrola jakości RNA bez DNA PCR master mix.

Odczynnik	kwota
RNA	0,5-5 μg
dNTP 10 mM	1 μl
Podkład odwrotny 10 μM/ Hexamery losowe 50 μM	1 μl
DEPC-H2O	Do 13 μl

Tabela 4. mieszanina reakcji syntezy cDNA A.

cyfrowa

Odczynnik	kwota
Bufor 5x	4 μl
Naziemna telewizja	1 μl
Inhibitor RNAZA	1 μl
Odwrotna transkryptaza	1 μl

Tabela 5. mieszanina reakcji syntezy cDNA B.

cel	Nazwa podkładu	kolejność	Wyżarzanie T (°C)	odniesienie
16S bakterie rRNA	Bact1369F powiedział:	CGG TGA ATA CGT TCY CGG	56	Suzuki et al. 2000 19
	Nr katalogowy: PROK1492R	GGW TAC CTT GTT ACG ACT T
	TM1389F (sonda)	CTT GTA CAC ACC GCC CGT C

Tabela 6. Starter i sondy do testu q-PCR 16S rRNA.

Odczynnik	kwota
2x Mistrzowska Mieszanka	10 μl
Podkład do przodu (10 μM)	0,8 μl
Podkład odwrotny (10 μM)	0,8 μl
Sonda (10 μM)	0,4 μl
Woda	7,0 μl
Ostatni tom	19 μl

Tabela 7. Mieszanina reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

Deskryptora	znaczenie
Współczynnik korelacji (R2)	Miara liniowości krzywej standardowej. Idealnie powinno to być R2 = 1. Wartość R2 = 0,98-0,99 jest dopuszczalna.
Nachylenie (α)	Miara wydajności reakcji. Idealnie powinno to być równoważne -3,32. Wartość z zakresu od -3,58 do -3,1.
Wydajność (=10(-1/nachylenie)-1)	Jeśli wynosi 100%, szablony podwajają się po każdym cyklu termicznym podczas wzmocnienia wykładniczego. Dobry zakres sprawności wynosi od 90 do 110%.
Punkt przecięcia Y (β)	Teoretyczna granica wykrywalności reakcji. Chociaż nie jest używany do ilościowego określania czułości reakcji, jest ważny przy porównywaniu różnych krzywych standardowych tego samego celu.

Tabela 8. Deskryptory reakcji qPCR.

Dyskusja

Połączenie ekstrakcji DNA/RNA z qPCR zapewnia szybką, dokładną i stosunkowo opłacalną metodę czułej kwantyfikacji obfitości genów i transkryptów z szeregu próbek środowiskowych, takich jak osady przybrzeżne.

Wstępna ekstrakcja kwasów nukleinowych jest kluczowym krokiem zapewniającym uzyskanie reprezentatywnego obrazu obecnej społeczności drobnoustrojów²². W protokole ekstrakcji należy wziąć pod uwagę szereg ograniczeń: a) osiągnięcie całkowitej lizy komórek, b) koekstrakcja związków hamujących (np. kwasów humusowych lub polifenoli), c) zanieczyszczenie DNA we frakcji RNA, d) szybka degradacja wyekstrahowanych kwasów nukleinowych podczas przechowywania. Należy podjąć środki ostrożności w celu obejścia tych ograniczeń. Na przykład należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby ekstrakcja kwasów nukleinowych była zoptymalizowana dla rodzaju próbki (np. osady, gleba, ścieki itp.). Znaczną poprawę wydajności i jakości kwasów nukleinowych zarówno dla DNA, jak i RNA można osiągnąć poprzez przeprowadzenie wstępnych eksperymentów²³. Aby zminimalizować wpływ związków hamujących na aplikacje oparte na PCR²⁴, należy przetestować szereg rozcieńczeń z wyekstrahowanego DNA i RNA. Aby uniknąć szybkiej degradacji wyekstrahowanego DNA/RNA z wielu cykli zamrażania i rozmrażania oraz uniknąć możliwej utraty informacji genetycznej, należy przechowywać wiele podwielokrotności o małej objętości w temperaturze -80 °C.

Starannie zaprojektowana metoda qPCR jest solidną, wysoce powtarzalną i czułą metodą. Warto zauważyć, że metody amplifikacji i konstrukcji krzywej standardowej przedstawione w tym protokole mogą być dostosowane do dowolnego celu genów, w tym innych markerów filogenetycznych (tj. archeonów 16S rRNA, grzybów 18S rRNA) lub genów zaangażowanych w ważne funkcje w środowisku. Znane ograniczenia w stosowaniu qPCR to: a) generowanie powtarzalnej krzywej wzorcowej wysokiej jakości do bezwzględnej kwantyfikacji ilościowej, b) wybór startera/sondy i optymalizacja warunków testu q-PCR, c) stosowanie niskiej jakości/ściętych kwasów nukleinowych, d) wybór roboczego rozcieńczenia DNA/RNA w celu uniknięcia zahamowania. Ponadto należy wziąć pod uwagę, że technika qPCR zapewnia obfitość genów/transkryptów, która może nie być równoznaczna z liczbą komórek: dzieje się tak szczególnie w przypadku, gdy celem są geny 16S i 18S rRNA, ponieważ mikroorganizmy mają różną liczbę kopii genu rybosomalnego w swoim genomie²⁵.

Niskiej jakości krzywe standardowe spowodują niedokładną kwantyfikację genu będącego przedmiotem zainteresowania. Dobrą praktyką jest przechowywanie zapasu wzorców wysokiego stężenia w małych porcjach, z których można uzyskać świeże krzywe wzorcowe. Nie przechowuj standardowych krzywych, zawsze przygotowuj świeże rozcieńczenia z zapasu o najwyższym stężeniu za każdym razem. W celu dokładnego ilościowego określenia próbek środowiskowych należy upewnić się, że zakres stężeń krzywej wzorcowej obejmuje oczekiwane wartości Cp nieznanych próbek. Podczas ilościowego określania transkryptów skonstruuj krzywą standardową z RNA, a nie z dwuniciowego DNA. Tam, gdzie jest to możliwe, oznaczanie ilościowe próbek, które mają być bezpośrednio porównane, powinno być zakończone w ramach jednego testu, aby uniknąć różnic między testami²⁰. Nie zawsze jest to możliwe. Dlatego, aby porównać obfitość genów generowanych między testami, zaleca się przeprowadzenie losowego podzbioru próbek replikowanych między testami. Obecnie dostępny jest szeroki wybór zestawów starterów i sond do qPCR ukierunkowanych na taksony drobnoustrojów i grupy funkcyjne^15. Przy ich wyborze należy starannie rozważyć, aby zapewnić zarówno maksymalny zasięg, jak i specyficzność dla grupy docelowej. Jeśli wydajność reakcji testu qPCR nie jest zadowalająca, rozwiązywanie problemów rozpoczyna się od zbadania różnych warunków cykli termicznych (takich jak czas i/lub temperatura wyżarzania) i/lub warunków reakcji, np. różnych stężeń starter-sonda. Po zoptymalizowaniu testu q-PCR i warunków reakcji należy zawsze przeprowadzić wstępny test szeregu rozcieńczeń DNA/cDNA w celu określenia odpowiedniego stężenia matrycy. Należy wybrać zakres rozcieńczenia, który daje najwyższą liczbę kopii, jako optymalne rozcieńczenie matrycy do dalszych testów.

Obecnie technologie sekwencjonowania nowej generacji skutecznie rzucają światło na strukturę i funkcje społeczności drobnoustrojów w wielu środowiskach^26,27,28. Jednak te zestawy danych są często oparte na bibliotekach amplikonów PCR w punkcie końcowym, a zatem dostarczają jedynie półilościowych ocen liczebności poszczególnych taksonów. W związku z tym zdolność techniki opartej na PCR w czasie rzeczywistym do celowania w określone markery taksonomiczne (od wyższej domeny do poziomu szczepu) umożliwia skuteczną walidację wyników uzyskanych przez sekwencjonowanie nowej generacji. Co więcej, qPCR jest z powodzeniem stosowany w połączeniu z innymi metodami molekularnymi ekologii drobnoustrojów, takimi jak sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) lub filogenetyczne/funkcjonalne mikromacierze. W połączeniu z poprzednim narzędziem, qPCR może być stosowany do ilościowego oznaczania społeczności aktywnej metabolicznie^29,30. W połączeniu z analizą mikromacierzy, qPCR zapewnia kluczową ilościową interpretację opartych na markerach filogenetycznych i funkcjonalnych badaniach genów w środowiskach^31,32.

W związku z tym, niezależnie od tego, czy jest stosowany samodzielnie, czy w połączeniu z innymi (często opartymi na procesie) ocenami funkcji ekosystemu, ilościowy PCR jest niezbędnym narzędziem dla ekologów mikrobiologicznych w badaniu nieuchwytnego związku między społecznościami mikrobiologicznymi a funkcjami ekosystemów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dwuwodorowęglan dietylu	Sigma	40718	Toksyczny, otwarty pod chemicznym kapturem
bromek cetrimonium (CTAB)	Sigma	52365	Drażniący, otwarty pod kapturem chemicznym
fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma	RES20765
fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	P9791
Fenol : Chloroform : Alkohol izoamylowy pH 8	Sigma	P2069	Zrównoważyć pH 8 przed użyciem
Chloroform : Alkohol izoamylowy	Sigma	25666
chlorek sodu	VWR	1.06404.0500
glikol polietylenowy 6000	VWR	528877-100
Etanol klasy molekularnej	Sigma	E7148
Rurki Lysing Matrix E	MP Biomedical	116914050
Turbo DNAse	Ambion	AM1907
Polimeraza Taq	Sigma	D1806
dNTPs	Bioline	BIO-39028
SuperScript III	Life Technologies	18080044
Inhibitory RNAZ	Technologie życia	10777019
wolne od RNAzy/DNAz 0,2  ml probówek do PCR	Sarstedt	72.985.002
SureCleanPlus	Bioline	BIO-37047
pGEM Easy T Vector	Promega	A1360
E. coli JM109 kompetentne komórki	Promega	L2005
Tryptone	Sigma	T7293
Ekstrakt drożdżowy	Sigma	70161
Ampicillin	Sigma	59349
X-Gal	Bioline	BIO-37035
IPTG	Bioline	BIO-37036
Agar	VWR	20768.235
Zestaw plazmidowy Midi	Qiagen	12143
Qubit	Life Technologies	Q33216
Test Quant-IT DNA HS	Technologie życia	Q-33120
Test Quant-IT RNA HS	Life Technologies	Q32855
Zestaw MEGAshortscript	Ambion	AM1354
TaqMan SensiFast Probe Zestaw Lo-ROX	Maszyna