Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54072

⸱

16 października 2016

 ,  ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z synowicytów podobnych do fibroblastów pochodzących od pacjenta, przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek zasilających.

Streszczenie

Dojrzałe komórki somatyczne mogą zostać odwrócone do stanu podobnego do pluripotencjalnej komórki macierzystej za pomocą zdefiniowanego zestawu czynników przeprogramowujących. Liczne badania wygenerowały indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z różnych typów komórek somatycznych poprzez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Badania nad iPSC pozostają w czołówce badań biologicznych i klinicznych. W szczególności specyficzne dla pacjenta iPSC mogą być wykorzystywane jako pionierskie narzędzie do badania patobiologii choroby, ponieważ iPSC mogą być indukowane z tkanki dowolnej osoby. Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą chorobą zapalną, klasyfikowaną przez zniszczenie struktury chrząstki i kości w stawie. Przerost błony maziowej jest jedną z głównych przyczyn lub objawów, które prowadzą do tych wyników w RZS. Synocyty podobne do fibroblastów (FLS) są głównymi komórkami składowymi błony maziowej hiperplastycznej. FLS w stawie rozmnażają się nieograniczenie, ostatecznie atakując sąsiednią chrząstkę i kość. Obecnie błonę maziową przerost można usunąć tylko za pomocą zabiegu chirurgicznego. Usunięta błona maziowa jest wykorzystywana do badań nad RZS jako materiał odzwierciedlający stan zapalny stawu. Jako główny gracz w patogenezie RZS, FLS mogą być wykorzystywane jako materiał do generowania i badania iPSC pacjentów z RZS. W tym badaniu wykorzystaliśmy FLS pacjenta z RZS do wygenerowania iPSC. Korzystając z systemu lentiwirusowego, odkryliśmy, że FLS mogą generować iPSC specyficzne dla pacjenta w kierunku RZS. Komórki iPS wygenerowane z FLS mogą być w przyszłości wykorzystywane jako narzędzie do badania patofizjologii RZS.

Wprowadzenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste to platforma nowej generacji w różnych dziedzinach klinicznych i biologicznych. Są obiecującym narzędziem, które można wykorzystać w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) wykorzystano głównie do badania i zrozumienia komórek pluripotencjalnych. Jednak wyizolowane przez zniszczenie ludzkiej blastocysty hESC wiążą się z kilkoma problemami etycznymi. W 2007 roku dr Shinya Yamanaka i jego zespół odwrócili proces programowania komórek i opracowali komórki macierzyste z ludzkich dorosłych komórek somatycznych1,2. W związku z tym, w przeciwieństwie do hESC, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być generowane z dojrzałych komórek somatycznych, unikając przeszkód etycznych.

Zazwyczaj, iPSC są generowane przez dostarczenie czterech egzogennych genów: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Te czynniki Yamanaka są pierwotnie dostarczane za pomocą systemów lentiwirusowych i retrowirusowych. Pierwsze iPSC pochodziły z mysich komórek somatycznych3. Następnie technikę tę zastosowano do ludzkich fibroblastów skóry1,2. Kolejne badania z powodzeniem wygenerowały iPSC z różnych źródeł, takich jak mocz4,krew 5,6, keratynocyty7 i kilka innych typów komórek. Istnieją jednak pewne komórki somatyczne, które nie zostały wykorzystane w przeprogramowaniu, a badania przesiewowe zdolności przeprogramowywania różnych typów komórek z określonych tkanek w stanie chorobowym są nadal wymagane.

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą, która może zaatakować wszystkie stawy i prowadzić do chorób autoimmunologicznych w innych narządach. RZS dotyka około 1% dorosłych w krajach rozwiniętych. Jest to dość powszechna choroba, a jej częstość występowania wzrasta z każdym rokiem8. Jednak RZS jest trudny do zidentyfikowania we wczesnych stadiach, a gdy dojdzie do zniszczenia kości, nie ma leczenia, które mogłoby naprawić uszkodzenie. Co więcej, skuteczność leku różni się w zależności od pacjenta i trudno jest przewidzieć, jaki lek jest wymagany. W związku z tym konieczne jest opracowanie metody badań przesiewowych leków i wymagany jest materiał komórkowy, który może odzwierciedlać warunki RZS.

Synocyty podobne do fibroblastów (FLS) są aktywnym uczestnikiem komórkowym w patogenezie RA9,10. FLS występują w błonie maziowej błony wewnętrznej między torebką stawową a jamą, która jest również określana jako błona maziowa. Wspierając strukturę stawu i dostarczając składniki odżywcze do otaczającej chrząstki, FLS zwykle odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu i utrzymaniu stawów. Jednak FLS w RZS mają fenotyp inwazyjny. RZS FLS mają fenotyp podobny do raka, ostatecznie niszcząc otaczającą kość przez nieskończoną proliferację10. Dzięki tej unikalnej charakterystyce, FLS mogą być stosowane jako obiecujący materiał, który może odzwierciedlać patobiologię RZS. Jednak komórki te są rzadko produkowane, a fenotypy komórek zmieniają się, gdy komórki przechodzą przez kilka przejść w warunkach in vitro. W związku z tym użycie RA FLS jako narzędzia, które może reprezentować stan pacjenta, może być skomplikowane.

Teoretycznie, iPSC pochodzące od pacjentów z RZS (RA-iPSC) mogą stać się idealnym narzędziem do badań przesiewowych leków i dalszych badań. Wygenerowane komórki iPS mają zdolność do samoodnawiania się i mogą być utrzymywane i namnażane in vitro. Dzięki pluripotencji komórki te mogą być różnicowane w dojrzałe linie chondrocytów i osteocytów, które mogą stanowić materiał komórkowy do konkretnych badań nad RZS i innymi chorobami związanymi z kośćmi11.

W tym badaniu pokazujemy, jak izolować i rozszerzać FLS z chirurgicznie usuniętej błony maziowej oraz jak generować RA-iPSC z FLS za pomocą lentiwirusów zawierających czynniki Yamanaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861).

1. Izolacja i ekspansja synocytów

  1. Izolacja synocytów
    1. Wysterylizuj dwie pary nożyczek chirurgicznych i jedną parę kleszczy.
    2. Przenieść tkankę maziową do naczynia o średnicy 100 mm i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% penicyliny/streptomycyny.
    3. Odetnij żółtawą tkankę tłuszczową i resztki kości. Przenieść przyciętą tkankę do dołka na płytce 6-dołkowej i dodać 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    4. Posiekaj chusteczki nożyczkami, aż kawałki będą wystarczająco małe, aby przebić jednorazową pipetę.
    5. Przenieść pożywkę zawierającą tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zebrać pozostały materiał, dodając 5 ml DMEM z 20% FBS do płytki 6-dołkowej, a następnie przenieść do probówki.
    6. Rozmrozić kolagenazę na lodzie. Dodaj kolagenazę do końcowego stężenia 0,01% i uszczelnij probówkę parafilmem. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 4 godziny.
    7. Po inkubacji napełnić probówkę DMEM 20% FBS, aż całkowita objętość wyniesie 50 ml i odwirować przy 300 x g, RT przez 10 min.
    8. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i dodać 40 ml pożywki w celu ponownego zawieszenia osadu.
    9. Powtórz kroki 1.1.10-1.1.11.
    10. Ponownie zawiesić osad w 25 ml DMEM z 20% FBS i poczekać, aż duże grudki tkanki opadną na dno.
    11. Przenieść supernatant na szalkę o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 14 dni.
  2. Utrzymanie i ekspansja synocytów
    1. Wyrzucić zużyte podłoże z płytki i przemyć komórki 5 ml PBS.
    2. Dodać 1 ml PBS/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 2 minuty.
    3. Delikatnie postukaj w naczynie i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g, RT przez 2 min.
    4. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 30 ml DMEM z 20% FBS.
    5. Przenieś komórki do szalek 3 x 100 mm, nie pozostawiając widocznych resztek materiału.
    6. Wymieniaj pożywkę na świeżą pożywkę co 3 dni. Podziel komórki przy 80% zbieżności, używając 1 ml PBS/1 mM EDTA. Utrzymać do przejścia 3 przed użyciem. Podziel każde naczynie z komórkami na 3 szalki w każdym podziale.
      UWAGA: Po osiągnięciu przejścia 3 komórki, które nie zostaną natychmiast użyte, mogą zostać zamrożone.

2. Przeprogramowanie FLS-ów za pomocą czynników Yamanaka kodujących Lentiwirusy

  1. Transdukcja (D0)
    1. Nasiona 3 × 104 komórki na basenie 6-dołkowej płytki w pożywce wzrostowej (500 ml DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny). Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    2. Następnego dnia wyjąć z zamrażarki jedną fiolkę lentiwirusa zawierającą 4 czynniki Yamanaka: Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc i rozmrozić w temperaturze 4 °C. Uwaga: Lentiwirus został wyprodukowany w procedurze opisanej w naszym poprzednim badaniu11.
    3. Podczas rozmrażania wirusa należy zmienić pożywkę na pożywkę wzrostową FLS (20% FBS plus antybiotyki w DMEM) zawierającą 10 μg/ml bromku heksadimetryny i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
    4. Po zmianie pożywki dodać do komórek 30 μl lentiwirusa i delikatnie wymieszać. W celu poprawy infekcji należy odwirować płytkę w temperaturze 680 x g, 35 °C przez 30 minut.
    5. Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  2. Konserwacja do momentu widocznego przeprogramowania
    1. Przez 3 dni codziennie zastępuj pożywkę pożywką FLS zawierającą 0,1 mM maślanu sodu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
    2. Następnego dnia zastąp pożywkę mieszaniną pożywki FLS i pożywki iPSC (stosunek 1:1) zawierającej 0,1 mM maślanu sodu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
      Uwaga: Składniki nośników iPSC są podane w wykazie materiałów/sprzętu.
  3. Dzielenie komórek w celu tworzenia kolonii
    1. Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą witronektyną.
      1. Dodać 60 μl witronektyny do 6 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+. Umieścić 2 ml mieszaniny w każdym dołku i inkubować w suchej temperaturze przez co najmniej 1 godzinę. Uwaga: Stężenie robocze witronektyny wynosi 5 μg/ml.
    2. Na D5 umyj komórki PBS.
    3. Dodać 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek i inkubacji w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 minuty.
    4. Zebrać komórki i odwirować przy 250 x g, RT przez 2 min.
    5. Podziel komórki w 3 różnych proporcjach (1:3, 1:6 i 1:9), aby uzyskać różne zbiegi. Dodać 900 μl pożywki do osadu komórkowego i ponownie zawiesić. Dodać 300, 150 i 100 μl mieszaniny komórek na dołek płytki 6-dołkowej, aby uzyskać stosunek odpowiednio 1:3, 1:6 i 1:9.
    6. Codziennie wymieniaj pożywkę na pożywkę iPSC, aż pojawią się kolonie. Kolonie pojawią się po około D18. Uwaga: Na tym etapie kolonie iPSC współistnieją z nieprzeprogramowanymi FLS.
  4. Zbieranie kolonii
    1. Przygotować 48-dołkową płytkę pokrytą witronektyną, dodając do studzienek 500 μl witronektyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Umieść mikroskop na czystej ławie i wyjmij 6-dołkową płytkę z inkubatora.
    3. Usunąć roztwór witronektyny z płytki 48-dołkowej i dodać 500 μl pożywki iPSC uzupełnionej 10mM związanym z Rho, inhibitorem kinazy białkowej (ROCK) związanym z Rho.
    4. Za pomocą końcówki do pipety 10 pensów przeciąć wokół kolonii. Przenieś pobraną kolonię do jednego dołka na 48-dołkowej płytce.
    5. Po wybraniu kilku kolonii inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Utrzymuj komórki, aż kolonie będą wystarczająco duże do przeniesienia. Uwaga: Zwykle rozlewamy komórki, gdy kolonia znajdzie się poza widzialnym polem mikroskopu, gdy ogląda się ją w 100-krotnym powiększeniu.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Przygotowanie komórek
    1. Umieścić sterylne szkło nakrywkowe o średnicy 18 mm w płytce 12-dołkowej.
    2. Dodać 1 ml PBS do ostygnięcia i wypłukać szkło nakrywkowe.
    3. Zastąp 1 ml roztworu witronektyny o stężeniu 10 μg/ml.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
    5. Roztwór witronektyny i płytki iPSC należy wyrzucić na 12-dołkową płytkę pokrytą witronektyną i hodować przez 7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę codziennie.
  2. Barwienie komórek
    1. Wyrzucić pożywkę hodowlaną i raz przemyć komórki PBS.
    2. Utrwal komórki w 0,4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć roztwór permeabilizacyjny i zablokować PBS zawierającym 2% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Rozcieńczyć przeciwciała w PBS zawierającym 2% BSA zgodnie z tabelą 1. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczone w stosunku 1:200) i inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, unikając światła.
    7. Traktuj komórki 1 μl/ml DAPI przez 10 minut.
    8. Umieścić szkło nakrywkowe na szkiełku szkiełkowym z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, unikając światła.
    9. Sprawdź ekspresję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

  1. Ekstrahować mRNA z osadu komórkowego przy użyciu metody ekstrakcji tiocyjanianianem fenolu i chloroformu guanidyny11.
  2. Amplifikuj cDNA z 2 μg całkowitego mRNA za pomocą odwrotnej transkrypcji11.
  3. Wymieszaj składniki wymagane do PCR, używając 2 μl matrycycDNA 11.
  4. Wykonaj RT-PCR i zweryfikuj wyniki za pomocą elektroforezy żelowej11.

5. Barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)

  1. Hodowla iPSC przez 5-7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed barwieniem.
  2. Odessać pożywkę i utrwalić komórki 4% PFA przez 1 minutę.
  3. Wyrzuć utrwalacz i przepłucz komórki 1X buforem do płukania.
  4. Przygotować odczynniki do barwienia AP. Wymieszać odczynniki w następującym stosunku: Szybki czerwony fiolet: roztwór fosforanu naftolu AS-BI: woda = 2:1:1.
  5. Inkubować komórki z roztworem barwiącym w temperaturze pokojowej przez 15 minut, unikając światła.
  6. Wyrzuć roztwór barwiący i przepłucz komórki buforem do płukania.
  7. Przykryj komórki PBS, aby zapobiec wysuszeniu i sprawdź ekspresję za pomocą mikroskopu jasnego pola.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu opisujemy protokół generowania iPSC z FLS z wykorzystaniem systemu lentiwirusowego. Rycina 1A przedstawia uproszczony schemat protokołu izolacji FLS. Po chirurgicznym usunięciu błony maziowej tkankę pocięto na małe fragmenty za pomocą nożyczek chirurgicznych. W celu wyizolowania komórek z grudek tkanki dodano kolagenazę. Komórki inkubowano przez 14 dni przed dalszą obróbą. Rycina1B przedstawia morfologię wyizolowanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przed odkryciem iPSC naukowcy wykorzystywali je głównie do badania biologii komórek macierzystych i innych linii komórkowych poprzez różnicowanie. Jednak ESC pochodzą z wewnętrznej masy blastocysty, która jest zarodkiem we wczesnym stadium rozwoju. Aby wyizolować ESC, zniszczenie blastocysty jest nieuniknione, co rodzi problemy etyczne, których nie można przezwyciężyć. Co więcej, chociaż EKM mają cechy macierzyste i pluripotencję, nie można ich uzyskać od osób fizycznych i czasami nie są idealnym narzędziem do spersonali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Badawczy finansowany przez Koreańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (HI13D2188).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie 100 mmTPP93100
Płytka 6-dołkowaTPP92006
50 ml Probówka rogowaSPL50050
15 ml Probówka rogowaSPL50015
10 ml Pipeta jednorazowaFalcon7551
ml Pipeta jednorazowaFalcon7543
Płytka 12-dołkowaTPP92012
FLS Materiały izolacyjne
Nożyczki
Kleszcz
DPBSLife Technologies14190-144
DMEMLife Technologies11995-073
StreptomycynaPenicilinSigma AldrichP4333
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies16000-044
KolagenazaSigma AldrichC6885-100MG
ParafilmSigma Aldrich54956
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
iPSC Generation Materials
DMEMLife Technologies11885
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Life Technologies11140-050
β-merkaptoetanolSigma AldrichM3148
PolybreneChemiconTR-1003-G
Penicilina StreptomycynaLife TechnologiesP4333
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies16000-044
DPBSLife Technologies14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057Składnik podłoża iPSC (500 ml)
Wodorowęglan soduLife Technologies25080-094Składnik podłoża iPSC (Konk.: 543 μ g/ml)
Selenin soduSigma AldrichS5261iPSC składnik podłoża  (Stężenie: 14 ng/ml)
Ludzki składnik pożywki TransfferinSigma AldrichT3705iPSC (stężenie: 10,7 μ g/ml)
Podstawowy składnik FGF2Peprotech100-18BiPSC  (Stężenie: 100 ng/ml)
Human InsulinLife Technologies12585-014Składnik pożywki iPSC (stężenie: 20 μ g/ml)
Ludzki TGFβ 1Składnik pożywki Peprotech100-21iPSC (stężenie: 2 ng/ml)
Kwas askorbinowySigma AldrichA8960składnik iPSC  (Konk.: 64 i mu; g / ml)
PolybreneChemiconTR-1003
Maślan soduSigma AldrichB5887
VitronectinLife TechnologiesA14700
ROCK InhibitorSigma AldrichY0503
Guality Control Materials
18 mm Szkło osłonoweSuperiorHSU-0111580
4% Paraformaldyhyd (PFA)Tech & InnowacjaBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Vector LabSP-5050
Przeciwciało anty-SSEA4MilliporeMAB4304
Przeciwciało anty-Oct4Santa CruzSC9081
Przeciwciało anty-TRA-1-60MilliporeMAB4360
Przeciwciało anty-Sox2Biolegend630801
Przeciwciało anty-TRA-1-81 PrzeciwciałoMilliporeMAB4381
Przeciwciało anty-Klf4Abcamab151733
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L)Sonda molekularnaA11029
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)Sonda molekularnaA11037
Sonda molekularnaDAPID1306
Prolong złoty odczynnik przeciwblaknącyInvitrogenP36934
Szkło szkiełkowe, powlekaneHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EtanolDuksan64-17-5
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNARevertAid Thermo ScientficK1622
Polimeraza DNA TaqiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
gwiazda ładowaniaDyne BioA750
AgarozaSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) marker drabinkowy DNAEnzynomicsDM003
Fosfataza alkalicznaMiliporySCR004
5 chirurgicznechirurgiczny

Bibliografia

  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  5. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  6. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  7. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  8. Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
  9. Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
  10. Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
  11. Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja lentiwirusowaczynniki Yamanakiizolacja tkanekhodowla komórkowapowlekanie witronektynąwybieranie koloniitworzenie potworniaków
Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.