Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z synowicytów podobnych do fibroblastów pochodzących od pacjenta, przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek zasilających.

Streszczenie

Dojrzałe komórki somatyczne mogą zostać odwrócone do stanu podobnego do pluripotencjalnej komórki macierzystej za pomocą zdefiniowanego zestawu czynników przeprogramowujących. Liczne badania wygenerowały indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z różnych typów komórek somatycznych poprzez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Badania nad iPSC pozostają w czołówce badań biologicznych i klinicznych. W szczególności specyficzne dla pacjenta iPSC mogą być wykorzystywane jako pionierskie narzędzie do badania patobiologii choroby, ponieważ iPSC mogą być indukowane z tkanki dowolnej osoby. Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą chorobą zapalną, klasyfikowaną przez zniszczenie struktury chrząstki i kości w stawie. Przerost błony maziowej jest jedną z głównych przyczyn lub objawów, które prowadzą do tych wyników w RZS. Synocyty podobne do fibroblastów (FLS) są głównymi komórkami składowymi błony maziowej hiperplastycznej. FLS w stawie rozmnażają się nieograniczenie, ostatecznie atakując sąsiednią chrząstkę i kość. Obecnie błonę maziową przerost można usunąć tylko za pomocą zabiegu chirurgicznego. Usunięta błona maziowa jest wykorzystywana do badań nad RZS jako materiał odzwierciedlający stan zapalny stawu. Jako główny gracz w patogenezie RZS, FLS mogą być wykorzystywane jako materiał do generowania i badania iPSC pacjentów z RZS. W tym badaniu wykorzystaliśmy FLS pacjenta z RZS do wygenerowania iPSC. Korzystając z systemu lentiwirusowego, odkryliśmy, że FLS mogą generować iPSC specyficzne dla pacjenta w kierunku RZS. Komórki iPS wygenerowane z FLS mogą być w przyszłości wykorzystywane jako narzędzie do badania patofizjologii RZS.

Wprowadzenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste to platforma nowej generacji w różnych dziedzinach klinicznych i biologicznych. Są obiecującym narzędziem, które można wykorzystać w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) wykorzystano głównie do badania i zrozumienia komórek pluripotencjalnych. Jednak wyizolowane przez zniszczenie ludzkiej blastocysty hESC wiążą się z kilkoma problemami etycznymi. W 2007 roku dr Shinya Yamanaka i jego zespół odwrócili proces programowania komórek i opracowali komórki macierzyste z ludzkich dorosłych komórek somatycznych^1,2. W związku z tym, w przeciwieństwie do hESC, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być generowane z dojrzałych komórek somatycznych, unikając przeszkód etycznych.

Zazwyczaj, iPSC są generowane przez dostarczenie czterech egzogennych genów: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Te czynniki Yamanaka są pierwotnie dostarczane za pomocą systemów lentiwirusowych i retrowirusowych. Pierwsze iPSC pochodziły z mysich komórek somatycznych³. Następnie technikę tę zastosowano do ludzkich fibroblastów skóry^1,2. Kolejne badania z powodzeniem wygenerowały iPSC z różnych źródeł, takich jak mocz⁴,^{krew 5,6}, keratynocyty⁷ i kilka innych typów komórek. Istnieją jednak pewne komórki somatyczne, które nie zostały wykorzystane w przeprogramowaniu, a badania przesiewowe zdolności przeprogramowywania różnych typów komórek z określonych tkanek w stanie chorobowym są nadal wymagane.

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą, która może zaatakować wszystkie stawy i prowadzić do chorób autoimmunologicznych w innych narządach. RZS dotyka około 1% dorosłych w krajach rozwiniętych. Jest to dość powszechna choroba, a jej częstość występowania wzrasta z każdym rokiem⁸. Jednak RZS jest trudny do zidentyfikowania we wczesnych stadiach, a gdy dojdzie do zniszczenia kości, nie ma leczenia, które mogłoby naprawić uszkodzenie. Co więcej, skuteczność leku różni się w zależności od pacjenta i trudno jest przewidzieć, jaki lek jest wymagany. W związku z tym konieczne jest opracowanie metody badań przesiewowych leków i wymagany jest materiał komórkowy, który może odzwierciedlać warunki RZS.

Synocyty podobne do fibroblastów (FLS) są aktywnym uczestnikiem komórkowym w patogenezie RA^9,10. FLS występują w błonie maziowej błony wewnętrznej między torebką stawową a jamą, która jest również określana jako błona maziowa. Wspierając strukturę stawu i dostarczając składniki odżywcze do otaczającej chrząstki, FLS zwykle odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu i utrzymaniu stawów. Jednak FLS w RZS mają fenotyp inwazyjny. RZS FLS mają fenotyp podobny do raka, ostatecznie niszcząc otaczającą kość przez nieskończoną proliferację¹⁰. Dzięki tej unikalnej charakterystyce, FLS mogą być stosowane jako obiecujący materiał, który może odzwierciedlać patobiologię RZS. Jednak komórki te są rzadko produkowane, a fenotypy komórek zmieniają się, gdy komórki przechodzą przez kilka przejść w warunkach in vitro. W związku z tym użycie RA FLS jako narzędzia, które może reprezentować stan pacjenta, może być skomplikowane.

Teoretycznie, iPSC pochodzące od pacjentów z RZS (RA-iPSC) mogą stać się idealnym narzędziem do badań przesiewowych leków i dalszych badań. Wygenerowane komórki iPS mają zdolność do samoodnawiania się i mogą być utrzymywane i namnażane in vitro. Dzięki pluripotencji komórki te mogą być różnicowane w dojrzałe linie chondrocytów i osteocytów, które mogą stanowić materiał komórkowy do konkretnych badań nad RZS i innymi chorobami związanymi z kośćmi¹¹.

W tym badaniu pokazujemy, jak izolować i rozszerzać FLS z chirurgicznie usuniętej błony maziowej oraz jak generować RA-iPSC z FLS za pomocą lentiwirusów zawierających czynniki Yamanaka.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861).

1. Izolacja i ekspansja synocytów

1. Izolacja synocytów
   1. Wysterylizuj dwie pary nożyczek chirurgicznych i jedną parę kleszczy.
   2. Przenieść tkankę maziową do naczynia o średnicy 100 mm i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% penicyliny/streptomycyny.
   3. Odetnij żółtawą tkankę tłuszczową i resztki kości. Przenieść przyciętą tkankę do dołka na płytce 6-dołkowej i dodać 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
   4. Posiekaj chusteczki nożyczkami, aż kawałki będą wystarczająco małe, aby przebić jednorazową pipetę.
   5. Przenieść pożywkę zawierającą tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zebrać pozostały materiał, dodając 5 ml DMEM z 20% FBS do płytki 6-dołkowej, a następnie przenieść do probówki.
   6. Rozmrozić kolagenazę na lodzie. Dodaj kolagenazę do końcowego stężenia 0,01% i uszczelnij probówkę parafilmem. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 4 godziny.
   7. Po inkubacji napełnić probówkę DMEM 20% FBS, aż całkowita objętość wyniesie 50 ml i odwirować przy 300 x g, RT przez 10 min.
   8. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i dodać 40 ml pożywki w celu ponownego zawieszenia osadu.
   9. Powtórz kroki 1.1.10-1.1.11.
   10. Ponownie zawiesić osad w 25 ml DMEM z 20% FBS i poczekać, aż duże grudki tkanki opadną na dno.
   11. Przenieść supernatant na szalkę o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 14 dni.
2. Utrzymanie i ekspansja synocytów
   1. Wyrzucić zużyte podłoże z płytki i przemyć komórki 5 ml PBS.
   2. Dodać 1 ml PBS/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 2 minuty.
   3. Delikatnie postukaj w naczynie i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g, RT przez 2 min.
   4. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 30 ml DMEM z 20% FBS.
   5. Przenieś komórki do szalek 3 x 100 mm, nie pozostawiając widocznych resztek materiału.
   6. Wymieniaj pożywkę na świeżą pożywkę co 3 dni. Podziel komórki przy 80% zbieżności, używając 1 ml PBS/1 mM EDTA. Utrzymać do przejścia 3 przed użyciem. Podziel każde naczynie z komórkami na 3 szalki w każdym podziale.
      UWAGA: Po osiągnięciu przejścia 3 komórki, które nie zostaną natychmiast użyte, mogą zostać zamrożone.

2. Przeprogramowanie FLS-ów za pomocą czynników Yamanaka kodujących Lentiwirusy

1. Transdukcja (D0)
   1. Nasiona 3 × 10⁴ komórki na basenie 6-dołkowej płytki w pożywce wzrostowej (500 ml DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny). Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
   2. Następnego dnia wyjąć z zamrażarki jedną fiolkę lentiwirusa zawierającą 4 czynniki Yamanaka: Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc i rozmrozić w temperaturze 4 °C. Uwaga: Lentiwirus został wyprodukowany w procedurze opisanej w naszym poprzednim badaniu¹¹.
   3. Podczas rozmrażania wirusa należy zmienić pożywkę na pożywkę wzrostową FLS (20% FBS plus antybiotyki w DMEM) zawierającą 10 μg/ml bromku heksadimetryny i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
   4. Po zmianie pożywki dodać do komórek 30 μl lentiwirusa i delikatnie wymieszać. W celu poprawy infekcji należy odwirować płytkę w temperaturze 680 x g, 35 °C przez 30 minut.
   5. Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Konserwacja do momentu widocznego przeprogramowania
   1. Przez 3 dni codziennie zastępuj pożywkę pożywką FLS zawierającą 0,1 mM maślanu sodu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
   2. Następnego dnia zastąp pożywkę mieszaniną pożywki FLS i pożywki iPSC (stosunek 1:1) zawierającej 0,1 mM maślanu sodu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.
      Uwaga: Składniki nośników iPSC są podane w wykazie materiałów/sprzętu.
3. Dzielenie komórek w celu tworzenia kolonii
   1. Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą witronektyną.
      1. Dodać 60 μl witronektyny do 6 ml PBS bez Ca²⁺ i Mg²⁺. Umieścić 2 ml mieszaniny w każdym dołku i inkubować w suchej temperaturze przez co najmniej 1 godzinę. Uwaga: Stężenie robocze witronektyny wynosi 5 μg/ml.
   2. Na D5 umyj komórki PBS.
   3. Dodać 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek i inkubacji w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 2 minuty.
   4. Zebrać komórki i odwirować przy 250 x g, RT przez 2 min.
   5. Podziel komórki w 3 różnych proporcjach (1:3, 1:6 i 1:9), aby uzyskać różne zbiegi. Dodać 900 μl pożywki do osadu komórkowego i ponownie zawiesić. Dodać 300, 150 i 100 μl mieszaniny komórek na dołek płytki 6-dołkowej, aby uzyskać stosunek odpowiednio 1:3, 1:6 i 1:9.
   6. Codziennie wymieniaj pożywkę na pożywkę iPSC, aż pojawią się kolonie. Kolonie pojawią się po około D18. Uwaga: Na tym etapie kolonie iPSC współistnieją z nieprzeprogramowanymi FLS.
4. Zbieranie kolonii
   1. Przygotować 48-dołkową płytkę pokrytą witronektyną, dodając do studzienek 500 μl witronektyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
   2. Umieść mikroskop na czystej ławie i wyjmij 6-dołkową płytkę z inkubatora.
   3. Usunąć roztwór witronektyny z płytki 48-dołkowej i dodać 500 μl pożywki iPSC uzupełnionej 10mM związanym z Rho, inhibitorem kinazy białkowej (ROCK) związanym z Rho.
   4. Za pomocą końcówki do pipety 10 pensów przeciąć wokół kolonii. Przenieś pobraną kolonię do jednego dołka na 48-dołkowej płytce.
   5. Po wybraniu kilku kolonii inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   6. Utrzymuj komórki, aż kolonie będą wystarczająco duże do przeniesienia. Uwaga: Zwykle rozlewamy komórki, gdy kolonia znajdzie się poza widzialnym polem mikroskopu, gdy ogląda się ją w 100-krotnym powiększeniu.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Przygotowanie komórek
   1. Umieścić sterylne szkło nakrywkowe o średnicy 18 mm w płytce 12-dołkowej.
   2. Dodać 1 ml PBS do ostygnięcia i wypłukać szkło nakrywkowe.
   3. Zastąp 1 ml roztworu witronektyny o stężeniu 10 μg/ml.
   4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
   5. Roztwór witronektyny i płytki iPSC należy wyrzucić na 12-dołkową płytkę pokrytą witronektyną i hodować przez 7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} zmieniając pożywkę codziennie.
2. Barwienie komórek
   1. Wyrzucić pożywkę hodowlaną i raz przemyć komórki PBS.
   2. Utrwal komórki w 0,4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Usunąć roztwór permeabilizacyjny i zablokować PBS zawierającym 2% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Rozcieńczyć przeciwciała w PBS zawierającym 2% BSA zgodnie z tabelą 1. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   6. Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczone w stosunku 1:200) i inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, unikając światła.
   7. Traktuj komórki 1 μl/ml DAPI przez 10 minut.
   8. Umieścić szkło nakrywkowe na szkiełku szkiełkowym z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, unikając światła.
   9. Sprawdź ekspresję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR)

1. Ekstrahować mRNA z osadu komórkowego przy użyciu metody ekstrakcji tiocyjanianianem fenolu i chloroformu guanidyny¹¹.
2. Amplifikuj cDNA z 2 μg całkowitego mRNA za pomocą odwrotnej transkrypcji¹¹.
3. Wymieszaj składniki wymagane do PCR, używając 2 μl matrycy^{cDNA 11}.
4. Wykonaj RT-PCR i zweryfikuj wyniki za pomocą elektroforezy żelowej¹¹.

5. Barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)

1. Hodowla iPSC przez 5-7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przed barwieniem.
2. Odessać pożywkę i utrwalić komórki 4% PFA przez 1 minutę.
3. Wyrzuć utrwalacz i przepłucz komórki 1X buforem do płukania.
4. Przygotować odczynniki do barwienia AP. Wymieszać odczynniki w następującym stosunku: Szybki czerwony fiolet: roztwór fosforanu naftolu AS-BI: woda = 2:1:1.
5. Inkubować komórki z roztworem barwiącym w temperaturze pokojowej przez 15 minut, unikając światła.
6. Wyrzuć roztwór barwiący i przepłucz komórki buforem do płukania.
7. Przykryj komórki PBS, aby zapobiec wysuszeniu i sprawdź ekspresję za pomocą mikroskopu jasnego pola.

Wyniki

W tym badaniu opisujemy protokół generowania iPSC z FLS za pomocą systemu lentiwirusowego. Rysunek 1A przedstawia prosty schemat protokołu izolacji FLS. Po chirurgicznym usunięciu błony maziowej tkanka została pocięta na małe kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych. Kolagenaza została dodana w celu wyizolowania komórek z grudek tkanki. Komórki inkubowano przez 14 dni przed dalszym przetwarzaniem. Rycina1B przedstawia morfologię izolowan...

Dyskusja

Przed odkryciem iPSC naukowcy wykorzystywali je głównie do badania biologii komórek macierzystych i innych linii komórkowych poprzez różnicowanie. Jednak ESC pochodzą z wewnętrznej masy blastocysty, która jest zarodkiem we wczesnym stadium rozwoju. Aby wyizolować ESC, zniszczenie blastocysty jest nieuniknione, co rodzi problemy etyczne, których nie można przezwyciężyć. Co więcej, chociaż EKM mają cechy macierzyste i pluripotencję, nie można ich uzyskać od osób fizycznych i czasami nie są idealnym narzędziem do spersonali...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie 100 mm	TPP	93100
Płytka 6-dołkowa	TPP	92006
50 ml Probówka rogowa	SPL	50050
15 ml Probówka rogowa	SPL	50015
10 ml Pipeta jednorazowa	Falcon	7551
ml Pipeta jednorazowa	Falcon	7543
Płytka 12-dołkowa	TPP	92012
FLS Materiały izolacyjne
Nożyczki
Kleszcz
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Streptomycyna	PenicilinSigma Aldrich	P4333
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	16000-044
Kolagenaza	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)	Life Technologies	11140-050
β-merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilina Streptomycyna	Life Technologies	P4333
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	Składnik podłoża iPSC (500 ml)
Wodorowęglan sodu	Life Technologies	25080-094	Składnik podłoża iPSC (Konk.: 543 μ g/ml)
Selenin sodu	Sigma Aldrich	S5261	iPSC składnik podłoża  (Stężenie: 14 ng/ml)
Ludzki składnik pożywki Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC (stężenie: 10,7 μ g/ml)
Podstawowy składnik FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC  (Stężenie: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	Składnik pożywki iPSC (stężenie: 20 μ g/ml)
Ludzki TGFβ 1	Składnik pożywki Peprotech	100-21	iPSC (stężenie: 2 ng/ml)
Kwas askorbinowy	Sigma Aldrich	A8960	składnik iPSC  (Konk.: 64 i mu; g / ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Maślan sodu	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Szkło osłonowe	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyd (PFA)	Tech & Innowacja	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Przeciwciało anty-SSEA4	Millipore	MAB4304
Przeciwciało anty-Oct4	Santa Cruz	SC9081
Przeciwciało anty-TRA-1-60	Millipore	MAB4360
Przeciwciało anty-Sox2	Biolegend	630801
Przeciwciało anty-TRA-1-81 Przeciwciało	Millipore	MAB4381
Przeciwciało anty-Klf4	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L)	Sonda molekularna	A11029
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)	Sonda molekularna	A11037
Sonda molekularna	DAPI	D1306
Prolong złoty odczynnik przeciwblaknący	Invitrogen	P36934
Szkło szkiełkowe, powlekane	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Etanol	Duksan	64-17-5
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA	RevertAid Thermo Scientfic	K1622
Polimeraza DNA Taq	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
gwiazda ładowania	Dyne Bio	A750
Agaroza	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) marker drabinkowy DNA	Enzynomics	DM003
Fosfataza alkaliczna	Milipory	SCR004