Artykuł metodologiczny

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54074

⸱

14 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine and Genetics (CMMG), Wayne State University School of Medicine, 2Department of Surgery, Wayne State University School of Medicine, 3Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Streszczenie

Nowotwory złośliwe wymagają dopływu krwi, aby przetrwać i rozprzestrzeniać się. Guzy te uzyskują potrzebną krew z krwiobiegu pacjenta, przejmując proces angiogenezy, w którym z istniejących naczyń krwionośnych powstają nowe naczynia krwionośne. Receptor CXCR2 (receptor chemokiny (motyw C-X-C) 2) jest transbłonową cząsteczką połączoną z białkiem G występującą w wielu komórkach, która jest ściśle związana z angiogenezą1. Specyficzna blokada receptora CXCR2 hamuje angiogenezę, co mierzy się za pomocą kilku testów, takich jak test tworzenia rurki śródbłonkowej. Test tworzenia rurki jest przydatny do badania angiogenezy, ponieważ jest to doskonała metoda badania wpływu, jaki dany związek lub warunki środowiskowe mogą mieć na angiogenezę. Jest to prosty i szybki test in vitro, który generuje wymierne dane i wymaga stosunkowo niewielu składników. W przeciwieństwie do testów in vivo, nie wymaga udziału zwierząt i można je przeprowadzić w czasie krótszym niż dwa dni. Protokół ten opisuje odmianę macierzy zewnątrzkomórkowej wspomagającej test tworzenia rurki śródbłonka, który testuje receptor CXCR2.

Wprowadzenie

Aby uzyskać składniki odżywcze niezbędne do przeżycia, nowotwory złośliwe wymagają dostępu do krwiobiegu pacjenta. Aby uzyskać ten dostęp, komórki nowotworowe uwalniają sygnały chemiczne, które stymulują wzrost nowych naczyń krwionośnych guza, przejmując w ten sposób normalny proces fizjologiczny znany jako angiogeneza2. To również przez naczynia krwionośne utworzone w procesie angiogenezy może dojść do przerzutów (tj. rozprzestrzenienia się raka na inne narządy). Ponieważ proces angiogenezy jest tak istotny dla progresji tak szerokiej gamy nowotworów, jest on atrakcyjnym celem w badaniach nad terapią przeciwnowotworową3.

Jedną z metod używanych do ilościowego określenia angiogenezy jest zmierzenie zdolności komórki progenitorowej śródbłonka do tworzenia rurek po umieszczeniu na macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponieważ tworzenie tych rurek jest krytycznym wczesnym krokiem w angiogenezie, testowanie warunków środowiskowych (np. obecności lub braku danego związku), które mogą stymulować lub hamować tworzenie się jajowodów, zapewnia wgląd w konkretne etapy, które można ukierunkować na zahamowanie angiogenezy. Test tworzenia cewek śródbłonkowych jest jedną znajczęściej stosowanych 4 metod in vitro, która mierzy zdolność komórek do tworzenia rurek. Jest to prosty test, wymagający stosunkowo niewielu składników i krótkiego okresu hodowli5. Być może najważniejsze jest jednak to, że dane uzyskane z tego typu testów są wymierne.

Przykładem użycia testu tworzenia probówek jest porównanie rozwoju rurek z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych wyhodowanych na macierzy zewnątrzkomórkowej z macierzą zewnątrzkomórkową o obniżonym czynniku wzrostu (GFR). Macierz zewnątrzkomórkowa jest materiałem przypominającym błonę podstawną wyizolowanym z komórek mięsaka, a jej głównymi składnikami są laminina, kolagen typu IV, czynniki wzrostu i proteoglikany. Niektóre związki mają różny wpływ na zdolność komórki do tworzenia rurek w środowisku o obniżonych czynnikach wzrostu i obniżonej zawartości proteoglikanów siarczanu heparanu (HSPG). HSPG są składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest znacznie zmniejszona w macierzy zewnątrzkomórkowej GFR. Na przykład, jeśli hipoteza jest taka, że inhibitory angiogenezy, takie jak SB225002, która blokuje receptor CXCR2, mają znacznie słabszą zdolność do przerywania tworzenia rurek, gdy HSPG są obfite, to porównanie aktywności tworzenia rurki w macierzy zewnątrzkomórkowej i macierzy zewnątrzkomórkowej GFR jest ważne dla zbadania możliwości hamowania angiogenezy poprzez kontrolę HSPG.

Inne testy, które są powszechnie używane do określania wpływu związków na angiogenezę, to metody in vivo. Godnymi uwagi przykładami są test błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM)piskląt 6 z użyciem jaj kurzych oraz test angiogenezy in vivo czopa Matrigel7 z udziałem myszy. Chociaż metody in vivo mierzą angiogenezę w trzech wymiarach i są bardziej reprezentatywne dla organizmu ludzkiego w porównaniu z testem tworzenia probówek in vitro, mają wadę polegającą na tym, że wymagają znacznie więcej czasu i są znacznie trudniejsze do wykonania. Zarówno test CAM, jak i test czopa zewnątrzkomórkowego zajmują co najmniej tydzień8, podczas gdy dla porównania, test tworzenia probówek można wykonać w ciągu jednego dnia i nie wymaga użycia na zwierzętach.

Ważne jest, aby zauważyć, że komórki śródbłonka użyte w tym raporcie to ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Komórki te odgrywają kluczową rolę w kiełkowaniu naczyń krwionośnych i wzroście naczyń krwionośnych i są wystarczająco analogiczne do komórek śródbłonka w nowotworach, aby można je było wykorzystać do oceny aktywności antyangiogenezy zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo 9. Można również wykorzystać inne komórki, takie jak pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego.

Ważne jest również, aby zauważyć, że oprócz niższych poziomów HSPG, matryca zewnątrzkomórkowa GFR ma również obniżony poziom wielu składników w porównaniu do normalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Obejmuje to między innymi: EGF, IGF-1, PDGF i TGF-beta. Osoby wykonujące eksperymenty badające znaczenie tych związków w odniesieniu do angiogenezy mogą być zainteresowane wykorzystaniem macierzy zewnątrzkomórkowej GFR.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Wysiew 3x105 komórek HUVEC w 10 ml kompletnej pożywki10 w kolbie o średnicy 75 cm.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w konfluencji od 5% CO2 do 70-80%.

2. Test tworzenia kanalików

  1. Rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) lub normalną macierz zewnątrzkomórkową przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Dla zwięzłości termin "macierz zewnątrzkomórkowa" będzie odtąd używany w odniesieniu zarówno do GFR, jak i normalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Proces ich przygotowania jest identyczny.
  2. Trzymaj 96-dołkowe płytki hodowlane na lodzie i dodaj 50 μl schłodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej do dołka za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek. Przygotuj trzy egzemplarze 5 studzienek zawierających tylko normalną macierz zewnątrzkomórkową. Przygotuj kolejną potrójną porcję 5 studzienek zawierających tylko macierz zewnątrzkomórkową GFR.
  3. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Umyj HUVEC raz roztworem buforowanym fosforanem bez wapnia i magnezu (PBS) i dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 1-5 minut, sprawdzając komórki co minutę, aż większość komórek się zaokrągli. Usuń komórki, stukając raz w kolbę.
    1. Dodać 5 ml pożywki podstawowej (tj. pożywki do wzrostu komórek śródbłonka bez dodatku czegokolwiek (np. suplementów)) z 1% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Zebrać komórki w kolbie przez pipetowanie i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy sile 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    2. Ponownie zawiesić za pomocą 2 ml podłoża podstawowego, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i dostosować stężenie komórek do 2-3 x 105 komórek/ml.
  5. Przygotować 100 μl następujących 10-krotnych stężeń inhibitora CXCR2 SB225002 w podłożu podstawowym: 11 μM, 5,6 μM, 1,1 μM, 0,56 μM i 0 μM (kontrola).
  6. Odpipetować 300 μl zawiesiny HUVEC do każdych 5 probówek do mikrowirówki. Dodać 33 μl stężeń inhibitora (11 μM, 5,6 μM, 1,1 μM, 0,56 μM i 0 μM) do jednej probówki zawierającej HUVEC i odwirować.
  7. Pobrać pipetą 50 μl każdej z zawiesin komórek (1-1,5 x 104 komórek) do poszczególnych studzienek macierzy zewnątrzkomórkowej. Każdą zawiesinę rozłożyć na trzy płytki i inkubować przez 4-16 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  8. Po 4-16 godzinach zrób 4 zdjęcia probówek uformowanych na studzienkę za pomocą odwróconej kamery mikroskopowej11 (oryginalne powiększenie x 100).

3. Test rozerwania kanalików

  1. Przygotować macierz zewnątrzkomórkową i płytki zgodnie z tymi samymi specyfikacjami, co test tworzenia probówek (kroki 2.1 do 2.3).
  2. Przygotować zawiesinę HUVEC zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.4.2 testu tworzenia probówek i podwielokrotnić do 96-dołkowej płytki zawierającej macierz zewnątrzkomórkową w ilości 50 μl na basenik.
    Uwaga: Płytkować wystarczająco dużo dołków, aby były 3 dołki na leczenie farmakologiczne.
  3. Hoduj komórki na macierzy zewnątrzkomórkowej przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zrób zdjęcia przed rozpoczęciem leczenia odwykowego.
  4. Przygotować 2x stężenia inhibitora CXCR2 SB225002 zgodnie z opisem w kroku 2.5 testu tworzenia probówek i dodać 50 μl każdego stężenia na studzienkę z 96-dołkowej płytki zawierającej HUVEC. Każdą koncentrację należy podać w trzech egzemplarzach.
  5. Inkubować płytkę przez kolejne 2-12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wykonaj 4 zdjęcia probówek uformowanych w każdej studzience za pomocą odwróconej kamery mikroskopowej (oryginalne powiększenie × 100) 11.

4. Kwantyfikacja danych

  1. Oceń formowanie się probówek uchwycone na obrazach, mierząc całkowitą długość probówek w czterech losowych polach mikroskopowych za pomocą oprogramowania kamery mikroskopowej.
  2. Otwórz obraz w oprogramowaniu kamery mikroskopowej i kliknij "Adnotacje i pomiary". W sekcji "długość" wybierz narzędzie "prosta linia". Kliknij na obrazek, a następnie narysuj linię wzdłuż rury, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy.
    Uwaga: Oprogramowanie automatycznie obliczy długość linii w pikselach i umieści dane w pliku.
  3. Powtórz procedurę dla wszystkich linii rur na obrazie, wybierając narzędzie "prosta linia". Kliknij na obrazek, a następnie narysuj linię wzdłuż rury, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy.
    Uwaga: Oprogramowanie zarejestruje długość każdej linii i wyświetli dane na ekranie.
  4. Po zmierzeniu każdej rurki na zdjęciu kliknij "Eksportuj", a następnie wybierz "Długość do arkusza kalkulacyjnego".
    Uwaga: Dane dotyczące długości zostaną wyeksportowane do arkusza kalkulacyjnego.
  5. Dodaj wszystkie długości rur z arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać całkowitą długość rury. Oblicz i zapisz średnią długość rur.
    Uwaga: Zalecane są cztery powtórzenia z wyznaczoną średnią i odchyleniem standardowym.

5. Odzyskiwanie komórek z hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Hodowla i przeprowadzenie testu tworzenia probówek (patrz sekcja 2) na większą skalę, ponieważ płytka 96-dołkowa nie zapewni wystarczającej liczby komórek. W przypadku płytek 12-dołkowych należy użyć 500 μl macierzy zewnątrzkomórkowej i 500 μl zawiesiny komórkowej HUVEC (1,5x105 komórek).
  2. Inkubuj komórki przez 4-16 godzin, aby uformować probówki. Następnie odessać pożywkę do hodowli komórkowej. Wypłucz komórki 1 ml zimnego 1x PBS bez wapnia i magnezu.
  3. Dodać 1 ml lodowatego buforu PBS-2,5 mM EDTA do kultury i trzymać na lodzie przez 10 minut.
  4. Usunąć komórki i mieszaninę macierzy zewnątrzkomórkowej z naczynia za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl z odciętą końcówką, a następnie przenieść do zimnej probówki o pojemności 15 ml, przemyć studzienkę 4 ml lodowatego PBS-2,5 mM EDTA i włożyć do probówki.
  5. Umieść probówki na lodzie na 1-4 godziny i odwróć probówkę kilka razy, aż cała macierz zewnątrzkomórkowa się rozpuści.
  6. Wirować przez 10 minut przy 1 620 x g w temperaturze 0 °C
  7. Ponownie zawiesić granulki komórek z 1 ml zimnego PBS w 1.ml probówce na lodzie.
  8. Ponownie odwirować przez 5 minut przy 3 000 x g w temperaturze 0 °C, a następnie usunąć supernatant.
  9. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Na obrazach mikroskopowych można łatwo odróżnić znaczące, prawidłowe tworzenie sieci cewek śródbłonkowych od tworzenia zahamowanego. Prawidłowe tworzenie cewek objawia się jako zorganizowana sieć struktur przypominających kapilary (Rysunek 1). W przeciwieństwie do tego, zahamowane tworzenie cewek przejawia się pod postacią rozproszonych komórek (Rysunek 2). Dane z testu tworzenia cewek są kwantyfikowane poprzez pomiar całkowitej długości cewek kapilarnych (Tabela 1). Oprócz całkowitej długości cewek można zmierzyć średnią długość cewki, całkowitą liczbę cewek lub całkowitą liczbę punktów rozgałęzień. Ustrukturyzowane tworzenie cewek daje większą całkowitą długość sieci niż rozproszony, zahamowany wzrost cewek. Na Rysunku 3 krzywa zależności dawka-odpowiedź umożliwia obliczenie IC50 w warunkach eksperymentalnych z wykorzystaniem HUVECs na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR i inhibitora CXCR2 SB225002.

figure-results-1
Rycina 1. Tworzenie cewek śródbłonkowych na macierzy zewnątrzkomórkowej oraz na macierzy zewnątrzkomórkowej z ograniczoną zawartością czynników wzrostu (GFR). Dwa obrazy przedstawiają prawidłowe tworzenie cewek na macierzy zewnątrzkomórkowej (A) oraz na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR (B). Połączona sieć cewek wyraźnie wskazuje, że wzrost cewek w tych komórkach HUVEC przebiega prawidłowo. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2. Hamowanie tworzenia naczyń na macierzy zewnątrzkomórkowej oraz macierzy zredukowanej pod względem czynników wzrostu (GFR) przez inhibitor CXCR2 SB225002 (5,6 µM). Dwa obrazy przedstawiają tworzenie naczyń, które zostało zahamowane przez inhibitor CXCR2 SB225002 (5,6 µM) na macierzy zewnątrzkomórkowej (A) oraz macierzy zewnątrzkomórkowej GFR (B). Widoczne na obrazach izolowane skupiska komórek HUVEC wskazują, że komórki nie były w stanie utworzyć rurek niezbędnych do połączenia ze sobą. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Krzywa zależności dawka-odpowiedź na macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (GFR). Oś X przedstawia długość rurek, a oś Y stężenie inhibitora CXCR2. Krzywa zależności odpowiedzi od dawki wykazuje, że odpowiedź komórek HUVEC na inhibitor CXCR2 na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR jest zależna od dawki. IC50 (półmaksymalna stężenie hamujące) obliczono przy użyciu oprogramowania13 i można je porównać na przykład z krzywą zależności odpowiedzi od dawki dla macierzy pozakomórkowej. IC50 jest to stężenie inhibitora, które zmniejsza odpowiedź do 50%. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

macierz zewnątrzkomórkowa o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (GFR)  i inhibitor (po 4 powtórzeniach dla każdej próbki)Średnia całkowita długość rurki (piksele) (1 piksel=0.34 µm)Odchylenie standardowe P Wartość
Kontrola macierzy zewnątrzkomórkowej GFR2447168.174
macierz zewnątrzkomórkowa GFR + 0.56 µM SB2250021422.5185.42180.000395
macierz zewnątrzkomórkowa GFR + 1.1 µM SB2250021004126.17842,14 x 10-5
macierz zewnątrzkomórkowa GFR + 5.6 µM SB225002519.25129.63684,19 x 10-6
macierz pozakomórkowa GFR + 11 µM SB225002393.75212.68571,21 x 10-5

Tabela 1. Ilościowe oznaczenie całkowitej długości cewek na macierzy zewnątrzkomórkowej z obniżoną zawartością czynników wzrostu (GFR) w różnych warunkach.Fragment tabeli zawierającej całkowite długości cewek zarejestrowane w próbkach hodowanych na macierzy zewnątrzkomórkowej GFR z zastosowaniem różnych stężeń inhibitora CXCR2. Dane wskazują, że inhibitor CXCR2 hamuje tworzenie cewek. Uwzględniono wartości powiązane, takie jak średnia z czterech powtórzeń, odchylenie standardowe oraz wartość P . Pomiary wykonano w pikselach, aby przedstawić dane eksportowane. Wartość IC50 można obliczyć za pomocą oprogramowania statystycznego13. (1 pixel = 0,34 µm)

Dyskusja

Podczas przeprowadzania tego testu ważne jest, aby macierz zewnątrzkomórkowa była zawsze utrzymywana na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że określono inaczej. Jeśli macierz zewnątrzkomórkowa ogrzeje się powyżej 4 °C, ulegnie polimeryzacji, a test zostanie zrujnowany. Ważne jest również, aby upewnić się, że wszystko, co ma kontakt (np. końcówki pipet, płytka) z macierzą zewnątrzkomórkową, jest wstępnie schłodzone z wyżej wymienionego powodu. Liczba komórek wysianych w każdym dołku jest krytyczna, zbyt mała liczba komórek nie da oczekiwanej wstęgi w próbce kontrolnej, zbyt wiele komórek utworzy duże skupiska komórek lub monowarstwę, a test nie będzie ważny. Innym ważnym czynnikiem decydującym o powodzeniu tego testu jest liczba pasaży komórkowych HUVEC. Liczba przejścia powinna być zawsze mniejsza niż dziesięć, w przeciwnym razie może nie dojść do solidnego tworzenia się rurki. Ponadto należy upewnić się, że używana pożywka do hodowli komórkowych nie straciła ważności, w przeciwnym razie komórki nie będą zdolne do życia. Alternatywnie można podzielić pożywkę i jej składniki na porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C w celu zachowania przez pewien czas po upływie daty ważności. Oczywiście nadal lepiej jest użyć nośnika przed upływem daty ważności

Podobnie jak w przypadku wszystkich procedur, istnieją pewne wady przeprowadzania testu tworzenia komórek śródbłonka. Jednym z głównych problemów jest to, że ponieważ istnieją różne typy komórek śródbłonka i matryc podporowych, wyniki testu mogą się znacznie różnić w zależności od tego, jaki typ komórki i macierzy jest używany. Stosowane komórki śródbłonka (HUVEC, HAEC lub HMVEC) są komórkami pierwotnymi, są kosztowne w uzyskaniu i mają zmienność w porównaniu z komórkami unieśmiertelnionymi. Komórki pierwotne mają ograniczone pasaże do wykorzystania i dlatego nie nadają się do długoterminowych eksperymentów angiogenezy14. Aby uzyskać wiarygodne dane, należy zawsze używać tych samych typów do testu. Podobnie jak w przypadku innych testów in vitro , wyniki testu tworzenia probówki powinny być potwierdzone in vivo, ponieważ wyniki z kontrolowanych i sztucznych warunków dwuwymiarowej hodowli tkankowej nie zawsze muszą być odzwierciedlone w złożonym biosystemie żywego organizmu. Ważne jest również, aby pamiętać, że ten rodzaj testu może być używany tylko do wykazania tworzenia rurki komórek śródbłonka i nie powinien być używany do testowania innych, nieśródbłonkowych komórek tworzących rurki.

Test ten jest dość prostą i szybką metodą ilościowego określenia potencjału angiogennego związku. Stanowi również platformę do dalszych eksperymentów, ponieważ sama w sobie nie dostarcza informacji na temat konkretnego mechanizmu, za pomocą którego związek faktycznie wpływa na proces tworzenia się naczyń. Jednak wykorzystanie różnych macierzy zewnątrzkomórkowych jest przykładem tego, jak dalej tworzyć ramy dla pytań badawczych, które nie są powszechnie stosowane. Istnieją podejścia do badania specyficznych mechanizmów biochemicznych związku, w tym specyficznych inhibitorów, które celują w składniki szlaku angiogenezy. Innym podejściem może być ekstrakcja RNA z komórek śródbłonka i użycie RT-PCR (Real Time PCR)12 do analizy zmian w ekspresji genów, które mogą powodować zachowanie wzrostu obserwowane w teście. Przyszłe zastosowania tej metody obejmują transfekowane HUVEC w celu stworzenia testów knock-down dla określonych etapów szlaku angiogenezy. Istnieje potencjał zastosowania tego podejścia do badania szlaku limfangiogenezy. Zmieniając składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, można dokładniej wyjaśnić interakcję macierzy i procesu komórkowego wspierającego angiogenezę w raku. Ekstrakcja RNA i białek z komórek śródbłonka w tych specyficznych warunkach dostarcza dodatkowych danych wymiernych odpowiadających danym obrazowym.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Praca została sfinansowana przez Fundusz Badań Medycznych i Edukacji, Wayne State University, Detroit, MI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompletna pożywka wzrostowa EGM-2 (zestaw pocisków EGM-2 CC-3162 )FisherNC9525043HUVEC kompletna pożywka wzrostowa: pożywka bazowa EGM-2 zmieszana z BBE (ekstraktem z mózgu bydlęcego), hEGF (ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu), hydrokortyzonem, GA-1000 (gentamycyna, amfoterycyna-B), 2% FBS (płodowa surowica bydlęca), VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego), hFGF-β (ludzki czynnik wzrostu fibroblastów beta), R3-IGF-1 (długi insulinopodobny czynnik wzrostu R jeden), kwas askorbinowy i heparyna. Podwielokrotnić pożywkę i jej składniki i przechowywać je w temperaturze -20  ° C, ciepły w 37  ° C przed użyciem.
MATRIGEL MATRIX 10ML Obniżony współczynnik wzrostu (GFR); 10  Ml; Wolna od LDEVmacierzFisher CB-40230o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR), przechowywać w -20  ° C, ciepły w 4  ° C przed użyciem.
MATRIGEL MATRIX 10ML; 10  Ml; MacierzFisherCB-40234, przechowywać w -20  ° C, ciepły w 4  ° C przed użyciem.
SB225002Fisher559405inhibitora CXCR2, przechowywać w temperaturze -20  ° C, podgrzać w temperaturze pokojowej przed użyciem.
Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) Laboratoria Badawcze ScienCell 8000kultura to zgodnie z odniesieniem  10.
Trypsyna 0,05%-EDTA fenol czerwonyInvitrogen25300-054przechowywać w 4  ° C, ciepły w 37  ° C przed użyciem.
Nikon ECLIPSE TiOdwrócony mikroskop badawczyfirmy Nikon
NIS-Elements AR 4.20.02 64-bitowyNikonOprogramowanie do odwróconego mikroskopu badawczego
Graph-pad Prism 5GraphPad Software, Inc.naukowe oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk 2D, do obliczania IC50.
zewnątrzkomórkowa zewnątrzkomórkowa bez LDEV.  mikroskop badawczy

Bibliografia

  1. Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
  2. Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
  3. Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
  4. Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830(2014).
  5. Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
  6. Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10(2015).
  7. Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
  8. Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
  9. Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
  10. Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
  11. The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
  12. de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
  13. 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
  14. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie rurek r db onkainhibitor CXCR2kom rki HUVECtest angiogenezymacierz GFRpomiar d ugo ci rurekmikroskopia odwr conaprotok hodowli kom rkowychsygnalizacja CXCR2
Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.