Method Article

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania genetyczne oparte na populacji i rodzinie zazwyczaj prowadzą do identyfikacji wariantów genetycznych, które są statystycznie związane z kliniczną chorobą lub fenotypem. W przypadku wielu chorób i cech większość wariantów jest niekodująca, a zatem mogą działać poprzez wpływ na subtelne, stosunkowo trudne do przewidzenia mechanizmy kontrolujące ekspresję genów. W tym miejscu opisujemy ogólne podejście strategiczne do priorytetyzacji wariantów niekodujących i sprawdzania ich pod kątem ich funkcji. Podejście to obejmuje priorytetyzację obliczeniową przy użyciu funkcjonalnych genomicznych baz danych, a następnie eksperymentalną analizę różnicowego wiązania czynników transkrypcyjnych (TF) z allelami ryzyka i nieryzykownymi. Zarówno w przypadku testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), jak i testu powinowactwa DNA (DAPA) wariantów genetycznych, syntetyczny oligonukleotyd DNA (oligo) stosuje się do identyfikacji czynników w lizacie jądrowym komórek istotnych dla choroby lub fenotypu. W przypadku EMSA oligonukleotydy z lub bez związanych czynników jądrowych (często TF) są analizowane przez elektroforezę bez denaturacji na żelu poliakrylamidowym tris-boran-EDTA (TBE). W przypadku DAPA oligonukleotydy są wiązane z kolumną magnetyczną, a czynniki jądrowe, które specyficznie wiążą sekwencję DNA, są eluowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas lub elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a następnie analizy Western blot. To ogólne podejście może być szeroko stosowane do badania funkcji niekodujących wariantów genetycznych związanych z dowolną chorobą, cechą lub fenotypem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania oparte na sekwencjonowaniu i genotypowaniu, w tym badania asocjacyjne całego genomu (GWAS), badania locus kandydatów i badania głębokiego sekwencjonowania, zidentyfikowały wiele wariantów genetycznych, które są statystycznie związane z chorobą, cechą lub fenotypem. Wbrew wcześniejszym przewidywaniom, większość z tych wariantów (85-93%) znajduje się w regionach niekodujących i nie zmienia sekwencji aminokwasówbiałek 1,2. Interpretacja funkcji tych niekodujących wariantów i określenie mechanizmów biologicznych łączących je z powiązaną chorobą, cechą lub fenotypem okazałosię wyzwaniem. Opracowaliśmy ogólną strategię identyfikacji mechanizmów....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów i odczynników

  1. Zamów niestandardowe sondy oligonukleotydowe DNA do użytku w EMSA i DAPA.
    1. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie białek, zaprojektuj krótkie oligonukleotydy (o długości od 35 do 45 par zasad (bp))30 i umieść interesujący wariant bezpośrednio w centrum, otoczony przez jego endogenną sekwencję genomową o długości 17 pz. W przypadku oligonukleotydów EMSA dodaj fluorofor 5'. W przypadku oligonukleotydów DAPA dodaj znacznik biotyny 5'.
    2. Uporządkuj zarówno pasmo zmysłu, jak i jego odwrotne pasmo dopełniacza. Alternatywnie, zamów oligonukleotydów duplex (wstępnie wyżarzanych). Nazywając oli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki tego, czego można się spodziewać podczas wykonywania EMSA lub DAPA, oraz scharakteryzowano zmienność w odniesieniu do jakości lizatu. Na przykład zasugerowano, że wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbek białek może prowadzić do denaturacji. W celu zbadania odtwarzalności analizy EMSA w kontekście tych cykli "zamrażania i rozmrażania", dwa oligonukleotydy o masie 35 pz różniące się jednym wariantem genetycznym inkubowano z pojedynczą pa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż postępy w technologiach sekwencjonowania i genotypowania znacznie zwiększyły naszą zdolność do identyfikacji wariantów genetycznych związanych z chorobą, nasza zdolność do zrozumienia mechanizmów funkcjonalnych, na które wpływają te warianty, pozostaje w tyle. Głównym źródłem problemu jest to, że wiele wariantów związanych z chorobą znajduje się w n kodujących regionach genomu, co prawdopodobnie wpływa na trudniejsze do przewidzenia mechanizmy kontrolujące ekspresję genów. W tym miejscu przedstawiamy protokół opa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Erin Zoller, Jessice Bene i Lindsey Hays za wkład i wskazówki w rozwoju protokołu. MTW było częściowo wspierane przez NIH R21 HG008186 oraz grant Trustee Award z Cincinnati Children's Hospital Research Foundation. ZHP był częściowo wspierany przez T32 GM063483-13.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Niestandardowe oligonukleotydy DNAZintegrowane technologiehttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
chlorku potasuFisher ScientificBP366-500KCl, do buforu CE
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Do buforu CE i NE
EDTA (0,5 m), pH 8,0Life TechnologiesR1021Do CE, NE i buforu do wyżarzania
Chlorek soduFisher ScientificBP358-1NaCl, do buforu NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Do wyżarzania buforu
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, do mycia komórek,
roztwór DL-ditiotreitolu (1 M)Sigma646563Środek redukujący
Inhibitor proteazy CocktailThermo Scientific87786Zapobiega katabolizmowi TF
Inhibitor fosfatazy Koktajl Thermo Scientific78420Zapobiega defosforylacji TF
Nonidet P-40 SubstytutIBI ScientificIB01140NP-40, do ekstrakcji jądrowej
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific23225Do pomiaru stężenia białka
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910Zawiera wszystkie niezbędne EMSA
Żele TBE, 6%, 12 dołkówInvitrogenEC6265BOXDo
bufora EMSA TBE (10x)Thermo ScientificB52Do zestawu startowego EMSA
FactorFinderMiltenyi Biotec130-092-318Zawiera wszystkie niezbędne DAPA
Licor Odyssey CLxLicorZalecany skaner do DAPA/EMSA
Antybiotyk-AntybiotykGibco15240-062Zawiera 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny oraz 25 &mikro; g/ml preparatu Fungizone® Przeciwgrzybicza
płodowa surowica bydlęcaGibco26140-079FBS, do pożywek hodowlanych
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Zawiera L-glutaminę i 25 mM HEPES
DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles