Method Article

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania genetyczne oparte na populacji i rodzinie zazwyczaj prowadzą do identyfikacji wariantów genetycznych, które są statystycznie związane z kliniczną chorobą lub fenotypem. W przypadku wielu chorób i cech większość wariantów jest niekodująca, a zatem mogą działać poprzez wpływ na subtelne, stosunkowo trudne do przewidzenia mechanizmy kontrolujące ekspresję genów. W tym miejscu opisujemy ogólne podejście strategiczne do priorytetyzacji wariantów niekodujących i sprawdzania ich pod kątem ich funkcji. Podejście to obejmuje priorytetyzację obliczeniową przy użyciu funkcjonalnych genomicznych baz danych, a następnie eksperymentalną analizę różnicowego wiązania czynników transkrypcyjnych (TF) z allelami ryzyka i nieryzykownymi. Zarówno w przypadku testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), jak i testu powinowactwa DNA (DAPA) wariantów genetycznych, syntetyczny oligonukleotyd DNA (oligo) stosuje się do identyfikacji czynników w lizacie jądrowym komórek istotnych dla choroby lub fenotypu. W przypadku EMSA oligonukleotydy z lub bez związanych czynników jądrowych (często TF) są analizowane przez elektroforezę bez denaturacji na żelu poliakrylamidowym tris-boran-EDTA (TBE). W przypadku DAPA oligonukleotydy są wiązane z kolumną magnetyczną, a czynniki jądrowe, które specyficznie wiążą sekwencję DNA, są eluowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas lub elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a następnie analizy Western blot. To ogólne podejście może być szeroko stosowane do badania funkcji niekodujących wariantów genetycznych związanych z dowolną chorobą, cechą lub fenotypem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania oparte na sekwencjonowaniu i genotypowaniu, w tym badania asocjacyjne całego genomu (GWAS), badania locus kandydatów i badania głębokiego sekwencjonowania, zidentyfikowały wiele wariantów genetycznych, które są statystycznie związane z chorobą, cechą lub fenotypem. Wbrew wcześniejszym przewidywaniom, większość z tych wariantów (85-93%) znajduje się w regionach niekodujących i nie zmienia sekwencji aminokwasówbiałek 1,2. Interpretacja funkcji tych niekodujących wariantów i określenie mechanizmów biologicznych łączących je z powiązaną chorobą, cechą lub fenotypem okazałosię wyzwaniem. Opracowaliśmy ogólną strategię identyfikacji mechanizmów molekularnych, które łączą warianty z ważnym fenotypem pośrednim – ekspresją genów. Ten potok jest specjalnie zaprojektowany do identyfikacji modulacji wiązania TF przez warianty genetyczne. Strategia ta łączy podejścia obliczeniowe i techniki biologii molekularnej mające na celu przewidywanie skutków biologicznych wariantów kandydujących in silico i empiryczną weryfikację tych przewidywań (ryc. 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Strategiczne podejście do analizy niekodujących wariantów genetycznych. Kroki, które nie zostały uwzględnione w szczegółowym protokole powiązanym z tym rękopisem, są zacieniowane na szaro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W wielu przypadkach ważne jest, aby zacząć od rozszerzenia listy wariantów o wszystkie te o wysokim stopniu nierównowagi sprzężenia (LD) z każdym statystycznie powiązanym wariantem. LD jest miarą nielosowego powiązania alleli w dwóch różnych pozycjach chromosomowych, które można zmierzyć za pomocą statystyki r2 7. R2 jest miarą nierównowagi sprzężeń między dwoma wariantami, przy czym r2 = 1 oznacza idealne powiązanie między dwoma wariantami. Stwierdzono, że allele w wysokim LD kosegregują się na chromosomie w populacjach przodków. Obecne tablice genotypowania nie obejmują wszystkich znanych wariantów ludzkiego genomu. Zamiast tego wykorzystują LD w ludzkim genomie i obejmują podzbiór znanych wariantów, które działają jako proxy dla innych wariantów w określonym regionie LD8. Tak więc wariant bez żadnych konsekwencji biologicznych może być związany z konkretną chorobą, ponieważ jest w LD z wariantem przyczynowym – wariantem o znaczącym skutku biologicznym. Proceduralnie zaleca się konwersję najnowszej wersji 1,000 genomes project9 variant call files (vcf) na pliki binarne kompatybilne z PLINK10,11, narzędziem typu open source do analizy asocjacji całego genomu. Następnie wszystkie inne warianty genetyczne z LD r2 >0,8 z każdym wejściowym wariantem genetycznym mogą być identyfikowane jako kandydaci. Ważne jest, aby na tym etapie użyć odpowiedniej populacji referencyjnej – np. jeśli wariant został zidentyfikowany u osób o pochodzeniu europejskim, do ekspansji LD należy wykorzystać dane od osób o podobnym pochodzeniu.

Ekspansja LD często skutkuje dziesiątkami wariantów kandydujących, a prawdopodobnie tylko niewielka część z nich przyczynia się do mechanizmu choroby. Często niemożliwe jest eksperymentalne zbadanie każdego z tych wariantów z osobna. W związku z tym przydatne jest wykorzystanie tysięcy publicznie dostępnych funkcjonalnych zestawów danych genomicznych jako filtra do ustalania priorytetów wariantów. Na przykład konsorcjum ENCODE12 przeprowadziło tysiące eksperymentów ChIP-seq opisujących wiązanie TF i kofaktorów oraz znaczników histonów w szerokim zakresie kontekstów, wraz z danymi dotyczącymi dostępności chromatyny z technologii takich jak DNase-seq13, ATAC-seq14 i FAIRE-seq15. Bazy danych i serwery internetowe, takie jak UCSC Genome Browser16, Roadmap Epigenomics17, Blueprint Epigenome18, Cistrome19 i ReMap20, zapewniają bezpłatny dostęp do danych uzyskanych za pomocą tych i innych technik eksperymentalnych w szerokim zakresie typów komórek i stanów. Gdy istnieje zbyt wiele wariantów do zbadania eksperymentalnie, dane te można wykorzystać do nadania priorytetu tym, które znajdują się w prawdopodobnych regionach regulatorowych w odpowiednich typach komórek i tkanek. Ponadto, w przypadkach, gdy wariant znajduje się w piku ChIP-seq dla określonego białka, dane te mogą dostarczyć potencjalnych wskazówek co do konkretnych TF (s) lub kofaktorów, na których wiązanie może mieć wpływ.

Następnie, uzyskane warianty o priorytetach są badane eksperymentalnie w celu walidacji przewidywanego wiązania białek zależnego od genotypu za pomocą EMSA21,22. EMSA mierzy zmianę migracji oligo na nieredukującym żelu TBE. Znakowany fluorescencyjnie oligo jest inkubowany z lizatem jądrowym, a wiązanie czynników jądrowych opóźnia ruch oligo na żelu. W ten sposób oligo, który związał więcej czynników jądrowych, po zeskanowaniu przedstawi się jako silniejszy sygnał fluorescencyjny. Warto zauważyć, że EMSA nie wymaga przewidywań dotyczących konkretnych białek, których wiązanie zostanie naruszone.

Po zidentyfikowaniu wariantów, które znajdują się w przewidywanych regionach regulacyjnych i są zdolne do różnicowego wiązania czynników jądrowych, stosuje się metody obliczeniowe do przewidywania konkretnych TF(ów), na których wiązanie mogą wpływać. Preferujemy korzystanie z CIS-BP23,24, RegulomeDB25, UniProbe26 i JASPAR27. Po zidentyfikowaniu potencjalnych TF, przewidywania te mogą być specjalnie przetestowane przy użyciu przeciwciał przeciwko tym TF (EMSA-supershifts i DAPA-Westerns). Supershift EMSA polega na dodaniu przeciwciała specyficznego dla TF do lizatu jądrowego i oligo. Dodatni wynik superprzesunięcia EMSA jest reprezentowany jako dalsze przesunięcie w paśmie EMSA lub utrata pasma (omówione w odnośniku28). W komplementarnym DAPA 5'-biotynylowany oligoduplex zawierający wariant i 20 nukleotydów flankujących parę zasad inkubuje się z lizatem jądrowym z odpowiedniego typu komórki (komórek) w celu wychwycenia wszelkich czynników jądrowych specyficznie wiążących oligonukleotydowane. Kompleks oligo duplex-czynnik jądrowy jest unieruchamiany przez mikrogranulki streptawidyny w kolumnie magnetycznej. Związane czynniki jądrowe są zbierane bezpośrednio przez elucję29,48. Przewidywania dotyczące wiązania można następnie ocenić za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka. W przypadkach, gdy nie ma oczywistych przewidywań lub jest ich zbyt wiele, elucje z wariantów pull-down eksperymentów DAPA mogą być wysyłane do rdzenia proteomicznego w celu zidentyfikowania potencjalnych TF za pomocą spektrometrii mas, które można następnie zwalidować przy użyciu tych wcześniej opisanych metod.

W dalszej części artykułu znajduje się szczegółowy protokół analizy wariantów genetycznych EMSA i DAPA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów i odczynników

  1. Zamów niestandardowe sondy oligonukleotydowe DNA do użytku w EMSA i DAPA.
    1. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie białek, zaprojektuj krótkie oligonukleotydy (o długości od 35 do 45 par zasad (bp))30 i umieść interesujący wariant bezpośrednio w centrum, otoczony przez jego endogenną sekwencję genomową o długości 17 pz. W przypadku oligonukleotydów EMSA dodaj fluorofor 5'. W przypadku oligonukleotydów DAPA dodaj znacznik biotyny 5'.
    2. Uporządkuj zarówno pasmo zmysłu, jak i jego odwrotne pasmo dopełniacza. Alternatywnie, zamów oligonukleotydów duplex (wstępnie wyżarzanych). Nazywając oligonukleotydów, należy oprzeć nomenklaturę na ustalonym genomie referencyjnym.
      Uwaga: Oznaczenia "ryzyka" i "brak ryzyka" mogą być specyficzne dla choroby i projektu, podczas gdy "odniesienie" i "brak odniesienia" mają bardziej uniwersalne znaczenie.
    3. Po przybyciu oligonukleotydów należy na krótko odwirować zawartość i ponownie zawiesić w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 100 μM. Zawieszony wywar należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Oligonukleotydów oznakowanych fluoroforem należy chronić przed światłem, owijając je folią aluminiową.
nazwakolejność
rs76562819_REF_FORGTAATGCCTTAATGAGAGAGAGTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REVGAAGTGAGAAGATGACTAACTCTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FORGTAATGCCTTAATGAGAGAGGGTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REVGAAGTGAGAAGATGACTAACCCTCTCTCATTAAGGCATTAC

Tabela 1: Przykładowy projekt oligonukleotydu EMSA/DAPA do testowania SNP pod kątem wiązania różnicowego. "REF" oznacza allel referencyjny, podczas gdy "NONREF" oznacza allel niereferencyjny. "FOR" oznacza pasmo przednie, a "REV" oznacza jego uzupełnienie. SNP jest widoczny na czerwono.

  1. Przygotować bufor do ekstrakcji cytoplazmatycznej (CE) o końcowym stężeniu 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl i 0,1 mM EDTA w wodzie dejonizowanej.
  2. Przygotować bufor do ekstrakcji jądrowej (NE) o końcowym stężeniu 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl i 1 mM EDTA w wodzie dejonizowanej.
  3. Przygotować bufor do wyżarzania o końcowym stężeniu 10 mM Tris (pH 7,5-8,0), 50 mM NaCl i 1 mM EDTA w wodzie dejonizowanej.

2. Przygotowanie lizatu jądrowego z hodowanych komórek

Uwaga: Ten eksperymentalny protokół został zoptymalizowany przy użyciu linii komórkowych limfoblastoidów B, ale został przetestowany na kilku innych niepowiązanych liniach komórkowych adherentnych/zawiesinowych i działa uniwersalnie.

  1. Hodowla komórek limfoblastoidalnych B w Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 2 mM L-glutaminą, 10% płodową surowicą bydlęcą i 1x antybiotyko-przeciwgrzybiczym zawierającym 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B.
    1. Wysiewać w zakresie 200 000-500 000 żywotnych komórek/ml i inkubować kolby w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla w pozycji pionowej z wentylowanymi lub luźnymi nakrętkami.
      Uwaga: Wzrost komórek limfoblastoidalnych B spowalnia, gdy osiągną one ponad 1 000 000 komórek/ml. Rozbij blasty komórkowe, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie przywróć komórki do 200 000-500 000 komórek/ml, aby utrzymać szybkie tempo wzrostu.
  2. Przemyć wyhodowane komórki dwukrotnie 10 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odwirować w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 5 minut i usunąć PBS przez aspirację.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawieś osad jako 1 ml lodowatego PBS na 107 komórek.
    Uwaga: Na przykład, jeśli lizuje 2 x 107 komórek, ponownie zawieś w 2 ml PBS.
  4. Podwielokrotność 1 ml do 1,5 ml probówek wirówkowych tak, aby każda probówka zawierała 107 komórek w PBS. Odwirować przy 3 300 x g przez 2 minuty 4 °C i odessać z PBS.
  5. Przed użyciem dodać 1 mM ditiotreitol (DTT), 1x inhibitor fosfatazy i 1x inhibitor proteazy do roboczego zapasu buforu CE. Zawiesić osad komórkowy z 400 μl buforu CE i inkubować na lodzie przez 15 minut.
  6. Dodać 25 μl 10% Nonidetu P-40 i wymieszać pipetując. Wirować w temperaturze 4 °C, maksymalna prędkość przez 3 min. Zdekantować i odrzucić supernatant.
  7. Przed użyciem dodać 1 mM DTT, 1x inhibitor fosfatazy i 1x inhibitor proteazy do roboczego zapasu buforu NE. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 30 μl buforu NE i wymieszać przez wirowanie.
  8. Inkubować w temperaturze 4 °C w rotatorze probówkowym lub na lodzie przez 10 minut. Odwirowywać 3 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  9. Zebrać klarowny supernatant (lizat jądrowy) i podwielokrotność przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą spowodować degradację białka. Pozostawić 10 μl podwielokrotności do pomiaru stężenia białka za pomocą testu kwasu bichoninowego (BCA)31.

3. Test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA)

  1. Przygotuj oligo materiał roboczy i żel EMSA.
    1. Jeśli oligonukleotydów zostały uporządkowane w trybie dupleksowym, należy rozmrozić materiał o wielkości 100 μM i rozcieńczyć w stosunku 1:2 000 w buforze do wyżarzania, aby uzyskać materiał roboczy o wartości 50 nM.
    2. Jeśli oligonukleotydy zostały uporządkowane jako jednoniciowe, należy rozmrozić zapasy 100 μM i rozcieńczyć w stosunku 1:10 w buforze do wyżarzania, aby uzyskać zapasy robocze 100 nM. Połączyć ze sobą 100 μl roztworu nici dopełniacza o długości 100 nM w probówce do mikrowirówki.
      1. Umieścić w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut. Wyłączyć blok grzewczy i pozwolić oligonukleukleetycznym powoli ostygnąć do temperatury pokojowej przez co najmniej godzinę przed użyciem.
    3. Uruchom żel EMSA.
      1. Wyjmij szkiełko z prefabrykowanego 6% żelu TBE i kilkakrotnie spłucz pod wodą dejonizowaną, aby usunąć bufor ze studzienek. Przygotuj 1 l buforu 0,5x TBE, dodając 50 ml 10x TBE do 950 ml wody dejonizowanej.
      2. Zmontuj aparat do elektroforezy żelowej i sprawdź, czy nie ma wycieków, wypełniając komorę wewnętrzną buforem 0,5x TBE. Jeśli żaden bufor nie przecieka do komory zewnętrznej, napełnij komorę zewnętrzną mniej więcej do dwóch trzecich długości.
      3. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60 minut.
      4. Przepłukać każdą studzienkę 200 μl 0,5-krotnego buforu TBE.
  2. Przygotować główną mieszankę buforu wiążącego.
    1. Przygotować 10x bufor wiążący o końcowym stężeniu 100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH 7,5 w wodzie dejonizowanej.
    2. W probówce do mikrowirówki utwórz mieszaninę wzorcową składającą się z odczynników wspólnych dla wszystkich reakcji (10 μl 10x buforu wiążącego, 10 μl DTT/polisorbatu, 5 μl Poly d(I-C) i 2,5 μl DNA plemników łososia; Tabela 2). Przygotuj dodatkowe 10%, aby uwzględnić utratę objętości spowodowaną pipetowaniem.
OdczynnikKońcowa konc.Zxn #1Rxn #2Rxn #3Wxn #4
Woda ultraczystado 20 μl obj.13,5 μl11,98 μl13,5 μl11,98 μl
10x bufor wiązania1x2 μl2 μl2 μl2 μl
Naziemna telewizja cyfrowa/TW-201x2 μl2 μl2 μl2 μl
DNA plemników łososia500 ng/μl0,5 μl0,5 μl0,5 μl0,5 μl
1μg/μl Poly d(I-C)1 μg1 μl1 μl1 μl1 μl
Ekstrakt jądrowy (5,26 ug/μl)8 μg-1,52 μl-1,52 μl
Bufor NE1,52 μl-1,52 μl-
Allel referencyjny oligo50 fmol1 μl1 μl--
Niereferencyjny allel oligo50 fmol--1 μl1 μl

Tabela 2: Przykładowa konfiguracja reakcji EMSA. Tabela ilustruje przykładowy EMSA w celu przetestowania hipotezy, że istnieje zależne od genotypu wiązanie TF z określonym SNP.

  1. Dodać wodę wolną od nukleaz do każdej probówki wirówkowej tak, aby końcowa objętość po dodaniu wszystkich odczynników wynosiła 20 μl.
  2. Dodać odpowiednią ilość (5,5 μl) mieszanki wzorcowej do każdej probówki do mikrowirówki.
  3. Dodać 8 μg lizatu jądrowego do odpowiednich probówek do mikrowirówek. Włączyć probówki zawierające oligo bez ekstraktu jądrowego jako kontrole ujemne (np. Tabela 2, Rxn #1 i Rxn #3).
    Uwaga: Optymalna ilość lizatu na reakcję musi być określona doświadczalnie przez miareczkowanie. Ogólnie rzecz biorąc, miareczkowanie w zakresie 2-10 μg lizatu jest wystarczające.
  4. Dodać 50 fmol oligo do odpowiednich probówek do mikrowirówek. Przesuń, aby wymieszać i krótko obróć zawartość na dno tuby. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: W przypadku próby superprzesunięcia, inkubować mieszaninę lizatu z przeciwciałem przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem oligonukleotydów. W celu uzyskania najlepszych wyników zaleca się użycie 1 μg przeciwciała klasy ChIP.
  5. Dodaj 2 μl 10x Orange Loading Dye do każdej probówki mikrowirówki. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
  6. Załaduj próbki do 6% żelu do KZM, pipetując w górę i w dół w celu wymieszania, a następnie wyrzucając każdą próbkę do osobnego dołka. Uruchom żel pod napięciem 80 V, aż pomarańczowy barwnik przeniesie się w 2/3 do 3/4 w dół żelu. Powinno to zająć około 60-75 minut.
  7. Wyjmij żel z plastikowej kasety, podważając ją nożem do żelu i umieść żel w pojemniku z 0,5% buforem TBE, aby nie wyschł
    8. .
  8. Umieść żel na powierzchni systemu obrazowania w podczerwieni i chemiluminescencji, upewniając się, że wyeliminowałeś wszelkie pęcherzyki lub zanieczyszczenia, które zakłócą obraz.
  9. Korzystając z oprogramowania systemu skanowania, kliknij zakładkę "Pobierz", a następnie wybierz "Narysuj nowy", aby narysować ramkę wokół obszaru odpowiadającego miejscu, w którym znajduje się żel na powierzchni skanera.
  10. W sekcji "Kanały" w zakładce "Pozyskiwanie" wybierz kanał odpowiadający długości fali znacznika fluoroforowego na oligo. W sekcji "Skaner" kliknij "podgląd", aby uzyskać podgląd skanu o niskiej jakości. Dostosuj obszar skanowania, przeciągając niebieskie pole otaczające uzyskany obraz podglądu w dół do części żelu, która ma zostać zobrazowana.
    Uwaga: Na przykład, jeśli używasz oligonukleotydów oznaczonych fluoroforem 700 nm, upewnij się, że kanał "700 nm" jest wybrany przed skanowaniem.
  11. W sekcji "Scan Controls" (Sterowanie skanowaniem) wybierz opcję rozdzielczości "84 μM" i opcję jakości "Średnia". Ustaw ostrość tak, aby przesunęła się do połowy grubości żelu. Uwaga: Na przykład żel o średnicy 1 mm będzie miał przesunięcie ostrości o 0,5 mm.
  12. W sekcji "Skaner" kliknij "Start", aby rozpocząć skanowanie.
    Uwaga: Podczas skanowania jasność, kontrast i schemat kolorów można często regulować ręcznie, w zależności od producenta systemu skanowania.
  13. Po zakończeniu skanowania wybierz zakładkę "Obraz" i kliknij "Obróć lub odwróć" w sekcji "Utwórz", aby poprawić orientację. Zapisz plik obrazu, klikając "Eksportuj" w menu głównym, a następnie wybierz "Widok pojedynczego obrazu".

4. Test oczyszczania powinowactwa DNA (DAPA)

  1. Przygotowanie 5 μM oligonukroidalnego materiału roboczego.
    1. Jeśli oligonukleotydów zostały uporządkowane w trybie dupleksowym, należy rozmrozić materiał o wielkości 100 μM i rozcieńczyć w stosunku 1:20 w buforze do wyżarzania, aby uzyskać materiał roboczy o wielkości 5 μM.
    2. Jeśli oligonukleotydy zostały uporządkowane jako jednoniciowe, należy rozmrozić zapasy 100 μM i rozcieńczyć w stosunku 1:10 w buforze do wyżarzania, aby uzyskać zapasy robocze 10 μM. Połącz ze sobą 10 μl z 10 uzupełniających się pasm. Umieścić w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut. Przed użyciem wyłącz blok grzewczy i pozwól oligonukleotykom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej.
  2. Przed rozpoczęciem należy ogrzać bufor wiążący, bufor płuczący o niskiej rygorystyczności, bufor płuczący o wysokiej rygorystyczności i bufor elucyjny do temperatury pokojowej.
    Uwaga: Końcowe stężenie 50 ng / ml Poly d (I-C) można dodać do buforu wiążącego, buforu płuczącego o niskiej rygorystyczności i buforu płuczącego o wysokiej rygorystyczności, aby zmniejszyć potencjalne niespecyficzne wiązanie białek z oligonukleukleotydami.
  3. Przygotuj mieszanki wiążące dla każdego wariantu.
    1. Zmieszać 1 objętość lizatu jądrowego z 2 objętościami buforu wiążącego.
      Uwaga: Wymagana ilość lizatu musi być określona doświadczalnie ze względu na różną obfitość TF. W większości przypadków wystarczające jest użycie od 100 do 250 μg lizatu jądrowego na kolumnę.
    2. Dodaj 1x inhibitor fosfatazy, 1x inhibitor proteazy i 1x wzmacniacz wiązania (opcjonalnie) i wymieszaj, kilkakrotnie przesuwając rurkę.
      Uwaga: 100x wzmacniacz wiązania składa się z 750 mM MgCl2 i 300 mM ZnCl2. Dodaj wzmacniacz wiązania, jeśli wiązanie TF z DNA zależy od kofaktorów lub czynników redukujących. Jeśli te informacje nie są znane, dodaj wzmacniacz wiązań.
    3. Dodać 10 μl biotynylowanego wychwytywanego DNA o stężeniu 5 μM (50 pmol) do każdej odpowiedniej mieszaniny wiążącej. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Czas inkubacji i temperatura mogą się różnić w zależności od TF. Optymalne wartości należy określić doświadczalnie.
  4. Dodać 100 μl mikrogranulek streptawidyny. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dla każdej badanej sondy oligonukleocytowej umieścić kolumnę wiążącą w separatorze magnetycznym. Umieścić probówkę do mikrowirówki bezpośrednio pod każdą kolumną wiążącą i nałożyć 100 μl buforu wiążącego w celu przepłukania kolumny.
  6. Przed kontynuowaniem należy odpipetować zawartość każdej mieszaniny wiążącej do oddzielnych kolumn i pozwolić, aby ciecz całkowicie przepłynęła przez kolumnę do probówki mikrowirówkowej. Upewnij się, że kolumny są oznaczone wariantem oligo, który został użyty w mieszaninie wiążącej. Oznaczyć przepływowe próbki i zastąpić je nowymi probówkami do mikrowirówek, aby zebrać popłuczyny o niskiej rygorystyczności.
  7. Nanieść 100 μl niskorygorystycznego buforu płuczącego na kolumnę; poczekać, aż zbiornik kolumny będzie pusty. Powtórz pranie 4x. Oznacz próbki mycia o niskiej rygorystyczności i zastąp je nowymi probówkami do mikrowirówek, aby zebrać popłuczyny o wysokiej rygorystyczności.
  8. Nanieść 100 μl wysokorygorystycznego buforu płuczącego na kolumnę; poczekać, aż zbiornik kolumny będzie pusty. Powtórz pranie 4x. Oznaczyć próbki płuczące o wysokiej rygorystyczności i zastąpić je nowymi probówkami do mikrowirówek, aby zebrać wstępną elucję.
  9. Dodać 30 μl natywnego buforu elucyjnego do kolumny i odstawić na 5 minut. Oznaczyć próbki przed elucją, a następnie zastąpić je nowymi probówkami do mikrowirówek w celu zebrania elucji.
    Uwaga: To nie powoduje elucji związanego białka; Wypłukuje pozostały bufor o wysokim poziomie rygorystyczności z kolumny i zastępuje go buforem elucyjnym, aby zmaksymalizować wydajność elucji.
  10. Dodaj dodatkowe 50 μl natywnego buforu elucyjnego, aby wymyć związane TF. Aby uzyskać wyższą wydajność, ale mniej skoncentrowany eluat, dodaj dodatkowe 50 μl natywnego buforu elucyjnego i zbierz przepływ.
    Uwaga: Analizować próbki elucji za pomocą spektrometrii mas w celu określenia tożsamości związanych TF32. Następnie zweryfikuj wyniki proteomiczne za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarcznianu sodu (SDS-PAGE), a następnie Western blot33. Jeśli spektrometria mas nie jest dostępna, należy przeprowadzić barwienie srebra przy użyciu standardowej techniki zamiast Western blot w celu określenia wielkości białka (białek) wykazujących wiązanie zależne od genotypu. Skorzystaj z tych informacji, aby zawęzić listę przewidywanych TF na podstawie podejść obliczeniowych opisanych we wprowadzeniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki tego, czego można się spodziewać podczas wykonywania EMSA lub DAPA, oraz scharakteryzowano zmienność w odniesieniu do jakości lizatu. Na przykład zasugerowano, że wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbek białek może prowadzić do denaturacji. W celu zbadania odtwarzalności analizy EMSA w kontekście tych cykli "zamrażania i rozmrażania", dwa oligonukleotydy o masie 35 pz różniące się jednym wariantem genetycznym inkubowano z pojedynczą pa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż postępy w technologiach sekwencjonowania i genotypowania znacznie zwiększyły naszą zdolność do identyfikacji wariantów genetycznych związanych z chorobą, nasza zdolność do zrozumienia mechanizmów funkcjonalnych, na które wpływają te warianty, pozostaje w tyle. Głównym źródłem problemu jest to, że wiele wariantów związanych z chorobą znajduje się w n kodujących regionach genomu, co prawdopodobnie wpływa na trudniejsze do przewidzenia mechanizmy kontrolujące ekspresję genów. W tym miejscu przedstawiamy protokół opa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Erin Zoller, Jessice Bene i Lindsey Hays za wkład i wskazówki w rozwoju protokołu. MTW było częściowo wspierane przez NIH R21 HG008186 oraz grant Trustee Award z Cincinnati Children's Hospital Research Foundation. ZHP był częściowo wspierany przez T32 GM063483-13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Niestandardowe oligonukleotydy DNAZintegrowane technologiehttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
chlorku potasuFisher ScientificBP366-500KCl, do buforu CE
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Do buforu CE i NE
EDTA (0,5 m), pH 8,0Life TechnologiesR1021Do CE, NE i buforu do wyżarzania
Chlorek soduFisher ScientificBP358-1NaCl, do buforu NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Do wyżarzania buforu
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, do mycia komórek,
roztwór DL-ditiotreitolu (1 M)Sigma646563Środek redukujący
Inhibitor proteazy CocktailThermo Scientific87786Zapobiega katabolizmowi TF
Inhibitor fosfatazy Koktajl Thermo Scientific78420Zapobiega defosforylacji TF
Nonidet P-40 SubstytutIBI ScientificIB01140NP-40, do ekstrakcji jądrowej
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific23225Do pomiaru stężenia białka
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910Zawiera wszystkie niezbędne EMSA
Żele TBE, 6%, 12 dołkówInvitrogenEC6265BOXDo
bufora EMSA TBE (10x)Thermo ScientificB52Do zestawu startowego EMSA
FactorFinderMiltenyi Biotec130-092-318Zawiera wszystkie niezbędne DAPA
Licor Odyssey CLxLicorZalecany skaner do DAPA/EMSA
Antybiotyk-AntybiotykGibco15240-062Zawiera 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny oraz 25 &mikro; g/ml preparatu Fungizone® Przeciwgrzybicza
płodowa surowica bydlęcaGibco26140-079FBS, do pożywek hodowlanych
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Zawiera L-glutaminę i 25 mM HEPES
DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  3. Ward, L. D., Kellis, M. Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease. Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).
  4. Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges. Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).
  5. Zhang, F., Lupski, J. R. Non-coding genetic variants in human disease. Hum Mol Genet. , (2015).
  6. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  7. Slatkin, M. Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future. Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).
  8. Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822(2012).
  9. 1000 Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).
  10. Chang, C. C., et al. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4, 7(2015).
  11. Purcell, S., et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).
  12. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  13. Crawford, G. E., et al. Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS). Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).
  14. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  15. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  16. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
  17. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  18. Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes. Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).
  19. Liu, T., et al. Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies. Genome Biol. 12 (8), R83(2011).
  20. Griffon, A., et al. Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape. Nucleic Acids Res. 43 (4), e27(2015).
  21. Staudt, L. M., et al. A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes. Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).
  22. Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes. Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).
  23. Weirauch, M. T., et al. Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).
  24. Ward, L. D., Kellis, M. HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).
  25. Boyle, A. P., et al. Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB. Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).
  26. Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).
  27. Mathelier, A., et al. JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).
  28. Smith, M. F. Jr, Delbary-Gossart, S. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).
  29. Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay. Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).
  30. LI-COR. Odyssey Infrared EMSA Kit: Instruction Manual. , Available from: http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910 (2014).
  31. Thermo Fisher Scientific, Inc. BCA Protein Assay Kit: User Guide. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2014).
  32. Wijeratne, A. B., et al. Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. J. Vis. Exp. (84), (2014).
  34. Lu, X., et al. Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression. Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).
  35. Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. Complex roles of Stat1 in regulating gene expression. Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).
  36. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230(2014).
  37. Heng, T. S., Painter, M. W. Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells. Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).
  38. Wu, C., et al. BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources. Genome Biol. 10 (11), R130(2009).
  39. Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).
  40. Wang, J., et al. Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).
  41. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
  42. Miltenyi Biotec, Inc. µMACS FactorFinder Kit: Data sheet. , Available from: http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx (2014).
  43. Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis. Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).
  44. Yang, T. -P., et al. Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies. Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).
  45. Fort, A., et al. A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster. Blood. 117 (1), 276-282 (2011).
  46. Solberg, N., Krauss, S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).
  47. Rahman, M., et al. A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A. Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).
  48. Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles