Artykuł metodologiczny

Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

19 czerwca 2016

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

W tym artykule

Podsumowanie

Cząsteczki naprowadzające aksonów regulują migrację neuronów i ukierunkowaną nawigację stożka wzrostu. Przedstawiamy potężną metodę, test paskowy, do oceny zdolności cząsteczek przewodnich do przyciągania lub odpychania neuronów. W tym protokole demonstrujemy test prążkowany, pokazując zdolność FLRT2 do odpychania hodowanych neuronów hipokampa.

Streszczenie

Rosnące aksony rozwijają na swoim końcu bardzo ruchliwą strukturę, zwaną stożkiem wzrostu. Stożek wzrostu kontaktuje się z zewnątrzkomórkowymi sygnałami środowiskowymi, aby nawigować po wzroście aksonów. Netrin, szczelina, semaforyna i efryny są znanymi cząsteczkami prowadzącymi, które mogą przyciągać lub odpychać aksony po związaniu się z receptorami i koreceptorami na aksonie. Aktywowane receptory inicjują różne cząsteczki sygnałowe w stożku wzrostu, które zmieniają strukturę i ruch neuronu. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół testu paskowego w celu oceny zdolności cząsteczki prowadzącej do przyciągania lub odpychania neuronów. W tej metodzie zdysocjowane neurony hipokampa myszy E15.5 są hodowane na naczyniach pokrytych lamininą przetworzonych z naprzemiennymi paskami ektodomeny fibronektyny i bogatego w leucynę białka transbłonowego-2 (FLRT2) i białka kontrolnego regionu krystalizacyjnego (Fc) immunoglobuliny G (IgG). Zarówno aksony, jak i ciała komórkowe zostały silnie odpychane od regionów paskowych pokrytych FLRT2 po 24 godzinach hodowli. Barwienie immunologiczne za pomocą tau1 wykazało, że ~90% neuronów było rozmieszczonych na paskach pokrytych Fc w porównaniu z paskami pokrytymi FLRT2-Fc (~10%). Wynik ten wskazuje, że FLRT2 ma silnie odpychający wpływ na te neurony. Ta potężna metoda ma zastosowanie nie tylko do pierwotnych neuronów hodowlanych, ale także do wielu innych komórek, takich jak neuroblasty.

Wprowadzenie

Prowadzenie aksonu to proces, w którym nowo powstałe neurony wysyłają aksony do swojego celu podczas rozwoju układu nerwowego1,2. Rozwijające się aksony mają na swoim końcu bardzo ruchliwą strukturę zwaną stożkiem wzrostu. Stożek wzrostu wyczuwa sygnały zewnątrzkomórkowe, aby poruszać się po ścieżce aksonu. Cząsteczki prowadzące, takie jak szczelina, semaforyna i efryny, mogą przyciągać lub odpychać aksony w zależności od ich interakcji z odpowiednimi receptorami i koreceptorami na aksonie1,3,4. Aktywowane receptory przekazują sygnały do stożka wzrostu, które wpływają na jego organizację cytoszkieletu dla ruchów aksonów i stożków wzrostu.

Opracowano różne metody oceny działania cząsteczek wabiących i odstraszających. Chemoatraktanty i repelenty mogą być podawane do pożywki wzrostowej/hodowlanej o stężeniu gradientowym (np. komora Dunna lub szkiełka μ)5,6, w miejscu o wysokim stężeniu za pomocą mikropipety (np. test obracania)7 lub w jednorodnym stężeniu przez kąpiel (np. test zapadania się stożka wzrostu)8,9.

Inne metody obejmują test paskowy lub druk mikrokontaktowy (μCP), w którym chemo-atraktant lub repelent jest powlekany na powierzchni płytki jako podłoże10-12. Test paskowy został pierwotnie opracowany przez Bonhoeffera i współpracowników w 1987 roku w celu analizy mapowania topograficznego w systemie siatkówkowo-tektalnym piskląt13. Pierwotna metoda wymagała systemu próżniowego do powlekania białek na poliwęglanowych błonach nukleoporowych za pomocą matryc w paski i siatki. W późniejszych wersjach rekombinowane białka wydrukowano bezpośrednio na powierzchni płytki hodowlanej w paski przy użyciu wąskich szczelinowych matryc krzemowych14,15. Ostatnio różne grupy badawcze z powodzeniem zastosowały ten test paskowy do analizy aktywności cząsteczek kierujących aksonami16-21.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół testu paskowego, który mierzy przyciąganie lub odpychanie cząsteczek kierujących aksonami dla zdysocjowanych neuronów hipokampa. Warto zauważyć, że metoda ta może być stosowana w minimalnie wyposażonych warunkach laboratoryjnych. W tym teście naprzemienne paski znakowanego fluorescencyjnie substratu i białka kontrolnego są generowane na plastikowym naczyniu przy użyciu matrycy krzemowej ze szczelinami 90 μm i pokryte lamininą. W naszej demonstracji zdysocjowane neurony hipokampa myszy E15.5 hodowano na naprzemiennych paskach rekombinowanej ektodomeny fibronektyny i bogatego w leucynę białka transbłonowego-2 (FLRT2) i kontrolnego białka Fc21. Po 24 godzinach hodowli zarówno aksony, jak i ciała komórkowe neuronów zostały silnie odpychane od pasków FLRT2. Barwienie przeciwciałem anty-Tau1 ujawniło, że ~90% neuronów było rozmieszczonych w regionach pokrytych Fc, w porównaniu do ~10% na FLRT2-Fc, co wskazuje, że FLRT2 ma silną funkcję odpychania neuronów hipokampa21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Szkole Medycznej Uniwersytetu Hamamatsu.

1. Przygotowanie matryc

  1. Gotuj 4-8 matryc silikonowych w kuchence mikrofalowej lub na płycie grzejnej przez 5 minut i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na 1 godzinę pod przepływem laminarnym (paskami do góry).
    Uwaga: Poniższe procedury należy wykonywać przy przepływie laminarnym.
  2. Przedmuchaj sprężonym powietrzem lub użyj przezroczystej taśmy klejącej, aby usunąć kurz z pasiastej strony matryc. Utrzymuj stronę w paski w czystości, aby mogła mocno przylegać do powierzchni płyty.
  3. Ostrożnie umieść matryce na plastikowych naczyniach o średnicy 6 cm, naciskając palcem (po jednej matrycy na naczynie; paskiem do dołu). Unikaj dostania się pęcherzyków powietrza między matrycę a naczynie. Zaznacz położenie pasków na dolnej stronie naczynia hodowlanego.
  4. Jeśli nie uda się przyczepić matrycy, powtórz czynności od kroku 1.2.

2. Wytwarzanie pasków i powlekanie laminy w hodowli neuronów

  1. Przygotować znakowane fluorescencyjnie rekombinowane białko (po 25 μl do wstrzykiwań [krok 2.2] lub po 100 μl do metody umieszczania [krok 2.2.1]) przez zmieszanie białka znakowanego Fc (10-50 μg/ml) i fluorescencyjnego przeciwciała anty-ludzkiego Fc sprzężonego z barwnikiem (stosunek 1 do 3: 30-150 μg / ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Następnie inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Za pomocą strzykawki 22 G wstrzyknąć 25 μl rekombinowanego białka przygotowanego w poprzednim kroku (2.1) przez mały otwór z boku matrycy (strzałki na rysunku 1A, 1C i 1E).
    1. Alternatywnie, umieścić 100 μl rekombinowanego białka w górnej szczelinie matrycy i odessać około połowy roztworu z małego otworu (strzałki na rysunku 1A, 1C i 1E), tak aby rekombinowane białko pozostało w pasiastych obszarach.
  3. Inkubować szalkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  4. Umieścić 300 μl PBS w górnej szczelinie (ryc. 1B) i odessać z małego otworu znajdującego się z boku matrycy (strzałki na rysunku 1A, C i E) w celu usunięcia nieprzyłączonych rekombinowanych białek. Nie zasysaj całkowicie PBS, ponieważ białka wyschną. Powtórz ten krok dwukrotnie. (Razem 3 razy)
  5. Ostrożnie usunąć matrycę i natychmiast umieścić ~100 μl białka kontrolnego (10-50 μg/ml; Fc), aby pokryć cały obszar w paski, tworząc alternatywną powłokę. Następnie inkubować naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  6. Po trzykrotnym umyciu powierzchni naczynia PBS, pokryj ją ~100 μl 20 μg/ml lamininy w PBS.
    Uwaga: Lamininę należy rozmrażać na lodzie, aby zapobiec krzepnięciu.
  7. Inkubować naczynie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  8. Umyj powierzchnię naczynia trzykrotnie PBS i dodaj pożywkę hodowlaną. Umieścić pokryte naczynie z pożywką hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C do momentu użycia.

3. Hodowla neuronów hipokampa z embrionów myszy E15.5

  1. Poddać matkę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i wyizolować trzy zarodki E15,5.
  2. Przetnij nożyczkami skórę i czaszkę strzałkowo w linii środkowej głowy i usuń mózg za pomocą małej łyżki. Ostrożnie przenieś mózg na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 3 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).
  3. Za pomocą skalpela wytnij półkule, w tym korę, hipokamp i prążkowie (ryc. 2A). Następnie wypreparuj obszar hipokampa, ostrożnie usuwając opony mózgowe, i przenieś wypreparowane tkanki hipokampa do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 2 ml roztworu HBSS na lodzie (ryc. 2B-C). Zbierz 6 hipokampów z 3 zarodków w probówce, które wystarczą do hodowli neuronów w 8 szalkach.
  4. Zastąpić roztwór HBSS roztworem trypsyny/EDTA (2 ml) i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut w łaźni wodnej><. Uwaga: Odsysać HBSS bez wirowania i nie dekantować roztworu HBSS poprzez przechylanie probówki.
  5. Zneutralizuj aktywność trypsyny, dodając 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  6. Odwirować mieszaninę przy 100 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad 2 ml pożywki. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  7. Pipetuj hipokampy w górę i w dół 10 razy w pożywce hodowlanej za pomocą końcówki o pojemności 1,000 μl z dużym otworem (odciętą końcówką), aby zdysocjować tkankę.
  8. Zmień końcówkę na zwykłą (nieoszlifowaną) o pojemności 1000 μl i pipetuj zdysocjowaną tkankę w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  9. Oddziel pojedyncze komórki, przepuszczając je przez sitko siatkowe o wielkości 80-100 μm.
  10. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 150 x g przez 5 min.
  11. Usunąć supernatant przez zasysanie i ponownie zawiesić osad (neurony) w 2 ml pożywki hodowlanej.
  12. Policz komórki za pomocą hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, aby określić gęstość i żywotność. Następnie umieść 10 000 neuronów w 150 μl pożywki hodowlanej dla każdego zestawu pasków. Zawieszenie należy ostrożnie umieścić, aby pokryć cały obszar paska.

4. Wizualizacja ciał komórkowych i aksonów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciała anty-Tau1

  1. Po 24 godzinach hodowli odessać pożywkę bez naruszania przylegających komórek i utrwalić neurony wstępnie podgrzanym 4% paraformaldehydem (PFA)/4% sacharozą/PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  2. Umyj powierzchnię płytki 3 razy za pomocą PBS. W razie potrzeby użyj wodoodpornego pisaka, aby narysować okrąg wokół pasiastego obszaru, aby zmniejszyć potrzebną ilość przeciwciała.
  3. Uzdatniaj neurony za pomocą 0,3% Triton X-100/PBS przez 5 minut.
  4. Inkubować neurony z roztworem blokującym zawierającym 3% surowicy osła i 0,1% Triton X-100 przez 30 minut, a następnie inkubować z przeciwciałem anty-Tau1 (1:200) w 1% surowicy osła/0,1% Triton X-100/PBS O/N w temperaturze 4 °C.
  5. Umyj powierzchnię płytki 3 razy za pomocą PBS. Inkubować neurony z fluoroforowym przeciwciałem anty-mysim IgG w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA)/0,1% Triton X-100/PBS przez 30 minut.
  6. Umyj powierzchnię płytki 3 razy za pomocą PBS. Przykryj obszar w paski szkłem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm, używając 50 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu. Unikaj pęcherzyków powietrza, które zakłócają obrazowanie.
  7. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu odpowiedniego systemu, np. soczewki obiektywu x10, zestawów filtrów dla GFP i RFP oraz czasu naświetlania 1000 ms (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozdzielone neurony hipokampa myszy E15.5 wysiano i hodowano przez 24 h na pasach fluorescencyjnie znakowanego kontrolnego Fc (Rysunek 3A-C) lub FLRT2-Fc (Rysunek 3D-F), naprzemiennie z nieznakowanym kontrolnym Fc. W obu przypadkach neurony uległy agregacji i wydłużały swoje aksony w postaci pęczków. Na pasach kontrolnych Fc/Fc neurony rozkładały się równomiernie na pasach znakowanych fluorescencyjnie i nieznakowanych, a ich aksony wydłużały się w przypad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje test paskowy, który wykorzystuje rekombinowane białko i zdysocjowane neurony z hipokampa myszy E15.5. Test ten pozwala na efektywną obserwację odpychających, atrakcyjnych lub neutralnych reakcji neuronów na interesujące nas rekombinowane białko umieszczone w pasiasty wzór. Główną zaletą tego protokołu jest prosta metoda generowania pasków, w której białko jest bezpośrednio drukowane na powierzchni plastikowego naczynia, w porównaniu z tradycyjną metodą, która wymaga specjalnych matryc, systemu próżni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Granty na Badania Naukowe od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (23700412, 25122707 i 26670090 do S.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 15 mlViolamo 1-3500-01
4% paraformaldehyd (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgGThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Przeciwciało przeciw mysim osiołkom ThermoScientificA-21203Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało anty-Tau1ChemiconMAB3420Rozcieńczenie 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481Można zastosować alternatywne media montażowe
Suplement B27Thermo Scientific17504-044Rozcieńczenie 1/50
Albumina surowicy bydlęcejSigma01-2030-2
Sitko komórkowe 100 umBD Falcon352360
WirówkaKubota2410
Szkło nakrywkowe 18mmx18mmMatsunami18x18 mm No. 1
DługopisDAKO DAKOS2002Można użyć alternatywnego długopisu hydrofobowego
Skalpel jednorazowyFeather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Mikroskop fluoostatniNikonE600
Kleszcze nr 5Fine Science Tools11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Rozcieńczenie 1/100
Strzykawka Hamilton805N22 gauge, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
Ludzka IgG, fragment FcJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
Normalna surowica osłaJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicylina-StreptomycynaThermo Scientific15070-063Rozcieńczenie 1/100
Plastikowe naczynie hodowlane, 60 mmThermo Scientific150288
Matryce silikonoweDostępne i do kupienia u Prof. Martina Bastmeyera (bastmeyer@kit.edu)
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ61
Końcówka, 1000 uLWatson125-1000S
Przezroczysta taśma klejącaTesa57315Można użyć alternatywnej taśmy klejącej
Triton X-100SigmaT8787
Trypan niebieski, 0,4%Bio-Rad145-0013
Trypsin/EDTAThermo Scientific25300-054
Pożywkahodowlana Neurobaseal uzupełniona o B27, GlutaMAX i Penicylinę-Streptomycynę.

Bibliografia

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kierowanie aksonamiodpychanie bia kowebia ko FLRT2neurony dysocjowanepowlekanie lamininimmunostaining Tau1hodowla kom rkowawi zanie bia ek

Powiązane artykuły