Method Article

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/54105

⸱

June 16th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, Taiwan, 2Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie heterogeniczności pojedynczych komórek jest kluczowe dla wielu zagadnień biologicznych, ale jest technicznie trudne. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prostą, ale wysokowydajną metodę przeprowadzania eksperymentów z hodowlami jednokomórkowymi. W tym miejscu przedstawiamy opartą na chipie mikroprzepływowym strategię wysokowydajnej izolacji pojedynczych komórek (~77%) i demonstrujemy jej zdolność do przeprowadzania długotrwałej hodowli pojedynczej komórki (do 7 d) i analizy heterogeniczności komórkowej przy użyciu testu klonogennego. Zastosowania te zademonstrowano z wykorzystaniem mysich nerwowych komórek macierzystych KT98 oraz ludzkich komórek nowotworowych A549 i MDA-MB-435. Wysoką wydajność izolacji pojedynczych komórek i długoterminową zdolność do hodowli uzyskuje się dzięki zastosowaniu różnych rozmiarów mikrostudzienek na górze i na dole kanału mikroprzepływowego. Mała matryca mikrodołkowa jest przeznaczona do precyzyjnego izolowania pojedynczych komórek, a duża matryca mikrostudzienkowa służy do hodowli klonalnej pojedynczych komórek w chipie mikroprzepływowym. Ta platforma mikroprzepływowa stanowi atrakcyjne podejście do zastosowań w hodowlach jednokomórkowych, ze względu na elastyczność regulowanych przestrzeni do hodowli komórkowych dla różnych strategii hodowli, bez zmniejszania wydajności izolacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie umieszczanie pojedynczych komórek pojedynczo w przestrzeni hodowlanej jest zwykle osiągane za pomocą ograniczania rozcieńczania lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Dla wielu laboratoriów ograniczenie rozcieńczenia jest wygodną metodą, ponieważ wymaga jedynie pipety i płytek do hodowli tkankowych, które są łatwo dostępne. W takim przypadku zawiesinę komórek rozcieńcza się seryjnie do odpowiedniej gęstości komórek, a następnie umieszcza w studzienkach hodowlanych za pomocą pipety ręcznej. Te podzielone na przedziały pojedyncze komórki są następnie wykorzystywane do analizy komórek, takiej jak badanie przesiewowe heterogenicznościgenety....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Projekty fotomasek do produkcji naszych urządzeń mikroprzepływowych zostały narysowane przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Projekty zostały następnie wykorzystane do produkcji chromowanych fotomasek za pomocą usługi komercyjnej. Urządzenia PDMS zostały wykonane technikami miękkiej litografii. 11

1. Wytwarzanie form wzorcowych metodą litografii

  1. Przed procesem fotolitografii12 należy użyć 4-calowych wafli krzemowych jako podłoża i odwodnić je w konwencjonalnym piecu w temperaturze 120 °C przez 10 minut.
  2. Oczyść odwodnione płytki krzemowe za pomocą plazmy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platforma mikroprzepływowa do izolacji i hodowli pojedynczych komórek składa się z mikrokanału (o wysokości 200 μm) z dwoma zestawami układów mikrodołków (Rysunek 2A). Dwa zestawy układów mikrostudzienek są określane jako studzienka wychwytująca (średnica 25 μm i głębokość 27 μm) i studnia hodowlana (średnica 285 μm i głębokość 300 μm) odpowiednio do izolacji pojedynczej komórki i hodowli, a każda studzienka wychwytująca jest umieszczona w środku studzienki hodowlanej, gd.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy urządzeń oparte na mikrostudzienkach6,14 zostały wykorzystane do manipulacji i analizy pojedynczych komórek, takich jak pułapki pojedynczych komórek na dużą skalę6 i proliferacja pojedynczych hematopoetycznych komórek macierzystych15. Chociaż rozmiar, liczbę i kształt studni można dostosować do konkretnych zastosowań, skuteczność izolacji pojedynczej komórki jest zawsze zagrożona, gdy zwiększa się rozmiar studni. 9,15

Aby przezwyciężyć to ogr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Oprogramowanie AutoCADAutodeskAutoCAD LT 2011Nr części 057C1-74A111-1001
Wafel krzemowy Korporacja EltechSPE0039
Piec konwencjonalnyFirma YEONG-SHINovp45
Czyszczarka plazmowaNordsonAP-300Stacjonarny system obróbki plazmowej
SU-8 50 ujemny fotorezystorMicroChemY131269
SU-8 100 ujemny fotorezystorMicroChemY131273
Powlekarka wirowaSynrex Co., Ltd.SC-HMI 2 "~ 6"
Płyta grzejnaYOTEC firmyYS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
SU-8 deweloperGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCOctan eteru monometylowego glikolu propylenowego
Skaningowy profilometr laserowyKEYENCEVK-X 100
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl. Niebezpieczny. Działa żrąco na drogi oddechowe, gwałtownie reaguje z wodą.
EksykatorBel-Art ProductsF42020-0000Eksykator próżniowy oszczędzający miejsce 190  mm biała podstawa
Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS)Dow corningSylgard 184
Dziurkacz Harris Uni-CoreTed Pella Inc.15072średnicy wewnętrznej 0,75 mm
3M CompanyTaśma usuwalna Scotch 811
Mikroskop stereoskopowyLeicaMicrosystems Leica E24
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Technologia BersingaALB001.500
DMEM podłoże podstawoweGibco12800-017
Surowica bydlęca płoduThermo HyclonSH30071.03HI Antybiotyki
BiowestL0014-100Glutamina-penicylina-Streptomycyna
Rekombinowana mieszanina enzymówInnowacyjna technologia komórkowaAM-105Accumax
DiIC12(3) barwnik błony komórkowejBD Biosciences354218Używany jako urządzenie do śledzenia komórek
Pompa strzykawkowaAparat Harvarda703007
Tworzywo sztuczne strzykawka (1 ml)BD Biosciences309659
igły o rozmiarze 23 EverSharp Technology, Inc.TD21
Rurka z politetrafluoroetenu (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23Tśrednica wewnętrzna, 0,51  Mm; średnica zewnętrzna, 0,82  Mm
z taśmą usuwalną o Firma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell IsolationMicrofluidic ChipHigh throughput CultureMicrowell ArrayCell Capture WellsGravitational LoadingPDMS FabricationPlasma BondingClonal CultureHeterogeneity Analysis

Related Articles