Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Summary

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Abstract

Badanie heterogeniczności pojedynczych komórek jest kluczowe dla wielu zagadnień biologicznych, ale jest technicznie trudne. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prostą, ale wysokowydajną metodę przeprowadzania eksperymentów z hodowlami jednokomórkowymi. W tym miejscu przedstawiamy opartą na chipie mikroprzepływowym strategię wysokowydajnej izolacji pojedynczych komórek (~77%) i demonstrujemy jej zdolność do przeprowadzania długotrwałej hodowli pojedynczej komórki (do 7 d) i analizy heterogeniczności komórkowej przy użyciu testu klonogennego. Zastosowania te zademonstrowano z wykorzystaniem mysich nerwowych komórek macierzystych KT98 oraz ludzkich komórek nowotworowych A549 i MDA-MB-435. Wysoką wydajność izolacji pojedynczych komórek i długoterminową zdolność do hodowli uzyskuje się dzięki zastosowaniu różnych rozmiarów mikrostudzienek na górze i na dole kanału mikroprzepływowego. Mała matryca mikrodołkowa jest przeznaczona do precyzyjnego izolowania pojedynczych komórek, a duża matryca mikrostudzienkowa służy do hodowli klonalnej pojedynczych komórek w chipie mikroprzepływowym. Ta platforma mikroprzepływowa stanowi atrakcyjne podejście do zastosowań w hodowlach jednokomórkowych, ze względu na elastyczność regulowanych przestrzeni do hodowli komórkowych dla różnych strategii hodowli, bez zmniejszania wydajności izolacji.

Introduction

Obecnie umieszczanie pojedynczych komórek pojedynczo w przestrzeni hodowlanej jest zwykle osiągane za pomocą ograniczania rozcieńczania lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Dla wielu laboratoriów ograniczenie rozcieńczenia jest wygodną metodą, ponieważ wymaga jedynie pipety i płytek do hodowli tkankowych, które są łatwo dostępne. W takim przypadku zawiesinę komórek rozcieńcza się seryjnie do odpowiedniej gęstości komórek, a następnie umieszcza w studzienkach hodowlanych za pomocą pipety ręcznej. Te podzielone na przedziały pojedyncze komórki są następnie wykorzystywane do analizy komórek, takiej jak badanie przesiewowe heterogeniczności^{genetycznej 1} i tworzenie kolonii². Jednak metoda ta jest niskoprzepustowa i pracochłonna, bez użycia ramienia robotycznego do pomocy, ponieważ charakter rozkładu Poissona metody ograniczającego rozcieńczanie ogranicza zdarzenia pojedynczej komórki do maksymalnego prawdopodobieństwa 37%³. Maszyny FACS ze zintegrowanym ramieniem robota mogą przezwyciężyć ograniczenia związane z dystrybucją Poissona poprzez dokładne umieszczanie jednej pojedynczej komórki w dołku hodowlanym^{na raz 4}. Jednak wysokie mechaniczne naprężenia ścinające (a tym samym obniżona żywotność komórek)⁵ oraz koszty zakupu i eksploatacji maszyn ograniczyły ich zastosowanie w wielu laboratoriach.

Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowano urządzenia mikroskalowe, które bardzo efektywnie ładują pojedyncze komórki do mikrostudzienek⁶. Jednak mikrostudzienki nie zapewniają odpowiedniej przestrzeni do namnażania się załadowanych komórek, ze względu na konieczność zbliżenia rozmiaru każdej mikrostudzienki do wielkości pojedynczej komórki, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo obciążenia pojedynczej komórki. Ponieważ testy hodowlane są wymagane w wielu zastosowaniach opartych na komórkach (np. test klonogenny⁷), zastosowano również większe mikrostudzienki (o średnicy od 90 do 650 μm lub długości boku), aby umożliwić rozszerzone hodowle komórkowe. Jednak, podobnie jak metoda rozcieńczania ograniczającego, charakteryzują się one również niską wydajnością ładowania pojedynczych komórek, wynoszącą od 10 do 30%. ^8,9

pkt.

Poprzednio opracowaliśmy wysokoprzepustową platformę mikroprzepływową do izolowania pojedynczych komórek w pojedynczych mikrodołkach i demonstrowania jej zastosowania w testach klonogenicznych izolowanych komórek. ¹⁰ Urządzenie zostało wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) i składa się z dwóch zestawów matryc mikrostudzienek o różnych rozmiarach mikrostudzienek, co może znacznie poprawić wydajność ładowania pojedynczej komórki do mikrostudzienki, której rozmiar jest znacznie większy niż komórka. Warto zauważyć, że ta koncepcja "podwójnej studzienki" pozwala na elastyczne dostosowanie wielkości obszaru hodowli bez wpływu na skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek, co ułatwia dostosowanie konstrukcji urządzenia do różnych typów komórek i zastosowań. Ta metoda o wysokiej skuteczności powinna być przydatna w długoterminowych eksperymentach z hodowlami komórkowymi do badań heterogeniczności komórek i tworzenia monoklonalnych linii komórkowych.

Protocol

Uwaga: Projekty fotomasek do produkcji naszych urządzeń mikroprzepływowych zostały narysowane przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Projekty zostały następnie wykorzystane do produkcji chromowanych fotomasek za pomocą usługi komercyjnej. Urządzenia PDMS zostały wykonane technikami miękkiej litografii. ¹¹

1. Wytwarzanie form wzorcowych metodą litografii

1. Przed procesem fotolitografii¹² należy użyć 4-calowych wafli krzemowych jako podłoża i odwodnić je w konwencjonalnym piecu w temperaturze 120 °C przez 10 minut.
2. Oczyść odwodnione płytki krzemowe za pomocą plazmy tlenowej o mocy 100 watów przez 30 sekund w odkurzaczu plazmowym.
3. Rozgrzej dwie płyty grzejne odpowiednio w temperaturze 65 °C i 95 °C do następnego procesu pieczenia.
4. Pokryć 5 g ujemnego fotorezystu (PR) na oczyszczonych płytkach krzemowych za pomocą powlekarki wirowej; wirować z prędkością 1200 obr./min (SU-8 50) przez 30 sekund, aby uzyskać warstwę mikrokanałową.
5. Umieść wafel pokryty PR na rozgrzanej płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 12 minut i przenieś go na inną podgrzaną płytę grzejną w temperaturze 95 °C na 33 minuty (dla wzorów o grubości 100 μm), aby przeprowadzić proces pieczenia na miękko.
6. Po upieczeniu umieść płytkę silikonową pokrytą PR na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównaj ją z przezroczystą fotomaską o rozdzielczości 25 400 dpi.
7. Wystaw płytkę krzemową pokrytą PR na działanie światła UV (365 nm) w dawce 500 mJ/cm², aby stworzyć wzór PR na płytce krzemowej.
8. Wyjmij wafel z nakładki i umieść go na płycie grzejnej do pieczenia po upieczeniu w temperaturze 95 °C na 12 minut.
9. Namocz wafle w roztworze wywoływacza SU-8 (octan eteru monometylowego glikolu propylenowego, PGMEA) w celu zmycia nieusieciowanego PR przez 12 minut i delikatnie osusz gazowym azotem, aby odsłonić ślady wyrównania.
10. Ponownie pokryj 5 g ujemnego fotorezystu na płytkach za pomocą powlekarki wirowej; wiruj z prędkością 700 obr./min (SU-8 100) przez 30 sekund i 1,200 obr./min (SU-8 10) przez 30 sekund, aby uzyskać odpowiednio wzór o grubości 300 μm i wzór o grubości 27 μm, aby utworzyć warstwę mikrostudzienki.
11. Umieścić płytkę pokrytą PR na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 4 minuty i w temperaturze 95 °C na 8 minut (dla warstwy studzienki wychwytującej o głębokości 27 μm); oraz w temperaturze 65 °C na 40 minut i w temperaturze 95 °C na 110 minut (dla warstwy dołka o głębokości 300 μm).
12. Po schłodzeniu umieść wafel silikonowy pokryty PR na nakładce maski wyposażonej w światło UV.
13. Wystaw płytkę krzemową pokrytą PR na działanie światła UV (365 nm) w dawce 250 mJ/^cm2 (dla wzoru o grubości 27 μm) i 700 mJ/^cm2 (dla wzoru o grubości 300 μm).
14. Wafle pieczemy w temperaturze 95 °C odpowiednio przez 5 minut (wzór o grubości 27 μm) i 30 minut (wzór o grubości 300 μm).
15. Nieusieciowany PR należy zmyć za pomocą PGMEA odpowiednio przez 6 minut (wzór o grubości 27 μm) i 25 minut (wzór o grubości 300 μm), a następnie wysuszyć je gazowym azotem.
16. Zmierz wysokość cech wzoru na płytce za pomocą skanującego profilometru laserowego, umieszczając płytkę na stoliku xy skanującego profilometru laserowego.
    1. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby wyraźnie pokazać cechy wzoru na płytce, korzystając z trybu obserwacji "widok z kamery" pod obiektywem 20X.
    2. Przełącz tryb obserwacji z "widoku kamery" na "widok laserowy" i ustaw górną i dolną pozycję funkcji.
    3. Ustaw tryb pomiaru, obszar, jakość i podziałkę z odpowiednio na przezroczystość (góra), 1 linia (1 024 x 1), wysoka dokładność i 0.5 μm, a następnie naciśnij początek na dole, aby rozpocząć pomiar.

2. Przygotowanie urządzeń PDMS do izolacji pojedynczych komórek

1. Przed odlaniem PDMS należy sylianizować formy główne trichlorosilanem, aby uzyskać hydrofobową powierzchnię, która ułatwia odklejanie replik PDMS od form głównych.
   1. Umieścić formy wzorcowe i łódkę ważącą zawierającą 200 μl trichlorosilanu w eksykatorze i stosować podciśnienie (-85 kPa) przez 15 minut.
   2. Zatrzymaj próżnię, a następnie pozostaw formy wzorcowe w eksykatorze w celu silanizowania form wzorcowych w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
   3. Wyjąć formy wzorcowe z eksykatora i umieścić każdą formę wzorcową na szalce Petriego o średnicy 10 cm.
2. Wymieszaj łączną ilość 17,6 g zestawu polimerów PDMS zawierającego bazę i utwardzacz w stosunku 10:1, a następnie wlej PDMS na formę wzorcową na szalce Petriego.
3. Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze i stosować podciśnienie (-85 kPa) przez 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z PDMS.
4. Wyjąć szalkę Petriego z eksykatora i umieścić ją w tradycyjnym piekarniku w temperaturze 65 °C na 3-6 godzin w celu utwardzenia PDMS.
5. Wyjmij utwardzone repliki PDMS z form wzorcowych i przebij dwa otwory jako wlot i wylot na dwóch końcach mikrokanału w replice PDMS z matrycą wychwytującą za pomocą dziurkacza o średnicy wewnętrznej 0,75 mm dla kanału płynowego (Rysunek 2A).
6. Użyj taśmy, aby oczyścić powierzchnię replik PDMS, a następnie umieść repliki PDMS w czyszczarce plazmowej w celu krótkiej obróbki plazmą tlenową (100 watów przez 14 sekund).
7. Usuń repliki PDMS z maszyny plazmy tlenowej.
8. Ustawić ręcznie górną (zawierającą mikrostudzienki wychwytujące) i dolną replikę PDMS (zawierającą mikrostudzienki hodowlane) pod mikroskopem stereoskopowym i doprowadzić je do kontaktu.
9. Umieść wyrównane repliki PDMS w piekarniku w temperaturze 65 °C na 24 godziny, aby uzyskać trwałe połączenie między replikami PDMS w celu utworzenia urządzenia końcowego.
10. Zanurzyć urządzenie PDMS w pojemniku wypełnionym wodą dejonizowaną (DI) i umieścić pojemnik w eksykatorze pod próżnią (-85 kPa) na 15 minut w celu usunięcia powietrza z mikrokanalika urządzenia PDMS.
11. Umieść urządzenie PDMS wypełnione wodą DI w kapturze do hodowli tkankowej i użyj światła UV (długość fali światła: 254 nm) do sterylizacji urządzenia przez 30 minut.
12. Zastąp wodę DI w urządzeniu PDMS 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 1x roztworze PBS i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby zapobiec przywieraniu komórek do powierzchni PDMS.
    Uwaga: Powłoka BSA ma kluczowe znaczenie dla poprawy wydajności transferu izolowanych komórek z dołka wychwytującego do dołka hodowlanego.
13. Zastąp 5% roztwór BSA w urządzeniu PDMS wysterylizowanym roztworem 1x PBS.

3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

1. Hodowla nerwowych komórek macierzystych KT98 oraz ludzkich komórek rakowych A549 i MDA-MB-435 na szalce Petriego w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ i 95% wilgotności) w celu przygotowania komórek do eksperymentu komórkowego z urządzeniem PDMS.
2. Usuń i wyrzuć zużytą pożywkę hodowlaną (podłoże podstawowe DMEM zaopatrzone w 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków) z szalki hodowlanej z komórkami wyhodowanymi do zbiegu 70 - 80%.
3. Delikatnie umyj komórki trzykrotnie wysterylizowanym PBS.
4. Usunąć i wyrzucić PBS i dodać 2 ml rekombinowanej mieszaniny enzymów o działaniu proteolitycznym, kolagenolitycznym i DNazy (szczegółowe informacje można znaleźć w Wykazie materiałów).
5. Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie postukaj w szalkę hodowlaną, aby ułatwić odłączenie komórek.
6. Dodać 4 ml wysterylizowanego PBS w celu rozproszenia komórek, a następnie przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
7. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
8. Delikatnie zawiesić osad komórek w 1 ml wysterylizowanego PBS i policzyć liczbę żywych komórek przy użyciu standardowej metody wykluczania błękitu trypanowego¹³,
   Uwaga: Ten etap ponownego zawieszania ma kluczowe znaczenie dla przygotowania dobrze zdysocjowanej zawiesiny pojedynczej komórki w celu poprawy wydajności izolacji pojedynczej komórki.

4. Izolacja pojedynczej komórki i hodowla klonalna

1. Załadować 50 μl zawiesiny komórek o stężeniu 2,2 - 2,5 x10⁶ komórek/ml do mikrokanalika urządzenia PDMS przez otwór wylotowy urządzenia za pomocą ręcznej pipety.
   Uwaga: Pipeta ładująca zawiesinę komórek musi zostać zatrzymana i przytrzymana w pierwszej pozycji zatrzymania, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrokanału.
2. Załaduj kolejne 50 μl zawiesiny komórek przez otwór wlotowy, aby równomiernie wypełnić cały mikrokanalik komórkami.
3. Uszczelnij otwór wylotowy zatyczką (nylonowa żyłka o długości 3 mm i średnicy 1 mm), aby uniknąć przepływu wywołanego ciśnieniem hydrostatycznym z kropelek na otworach wlotowych i wylotowych.
   Uwaga: Zatyczki zostały wysterylizowane promieniami UV w kapturze do hodowli tkankowych przed użyciem.
4. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml pożywką hodowlaną, usuń z niej pęcherzyki powietrza i umieść ją na pompie strzykawkowej.
5. Podłączyć średnio obciążoną strzykawkę do otworu wlotowego urządzenia PDMS za pomocą igły 23 G i rurki z politetrafluoroetenu (PTFE).
6. Wyjmij wtyczkę z otworu wylotowego i odczekaj 2-minutowy odstęp czasu, aby komórki mogły osiąść w studzienkach wychwytywania pojedynczych komórek pod wpływem siły grawitacyjnej.
7. Niewychwycone komórki przepłukać 300 μl pożywki hodowlanej o natężeniu przepływu 600 μl/min napędzanym przez pompę strzykawkową.
8. Odczekaj 2 minuty, aby ustabilizować urządzenie i uszczelnij otwory wlotowe i wylotowe zatyczkami, aby utworzyć zamknięty system hodowli.
9. Odwróć urządzenie ręcznie, aby przenieść uchwycone pojedyncze komórki do mikrodołków hodowlanych.
10. Umieść urządzenie PDMS w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i dodaj 10 ml wysterylizowanego PBS wokół urządzenia, aby uniknąć parowania pożywki hodowlanej z mikrokanału.
11. Przenieść naczynie hodowlane do konwencjonalnego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ i 95% wilgotności) w celu hodowli klonalnej pojedynczych komórek.

5. Uzupełnienie podłoża hodowlanego

1. Po 1 d hodowli zastąp pożywkę hodowlaną w urządzeniu PDMS świeżą pożywką, aby poprawić proliferację komórek.
2. Umieść dwie kropelki pożywki hodowlanej na górze urządzenia PDMS w pobliżu otworów wlotowych i wylotowych, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do mikrokanału podczas wykonywania następnego kroku.
3. Przebij dwa otwory od góry urządzenia PDMS w pobliżu dwóch końców mikrokanału jako wlot i wylot mikrokanału.
   Uwaga: Nie przebijaj całych dwóch warstw urządzenia PDMS; zamiast tego po prostu przebij górną warstwę PDMS.
4. Podłączyć plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą świeżą pożywkę do wlotu za pomocą igły 23 G i rurki z PTFE.
5. Wlej 120 μl świeżej pożywki do urządzenia na 5 minut, aby zastąpić starą pożywkę.
6. Włóż dwie zatyczki, aby uszczelnić otwory wlotowe i wylotowe, a następnie włóż urządzenie z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.
7. Odświeżać pożywkę co 2 dni w okresie hodowli, usuwając zatyczki uszczelniające, a następnie powtarzając kroki 5.4-5.5.

Results

Platforma mikroprzepływowa do izolacji i hodowli pojedynczych komórek składa się z mikrokanału (o wysokości 200 μm) z dwoma zestawami układów mikrodołków (Rysunek 2A). Dwa zestawy układów mikrostudzienek są określane jako studzienka wychwytująca (średnica 25 μm i głębokość 27 μm) i studnia hodowlana (średnica 285 μm i głębokość 300 μm) odpowiednio do izolacji pojedynczej komórki i hodowli, a każda studzienka wychwytująca jest umieszczona w środku studzienki hodowlanej, gd...

Discussion

Systemy urządzeń oparte na mikrostudzienkach^6,14 zostały wykorzystane do manipulacji i analizy pojedynczych komórek, takich jak pułapki pojedynczych komórek na dużą skalę⁶ i proliferacja pojedynczych hematopoetycznych komórek macierzystych¹⁵. Chociaż rozmiar, liczbę i kształt studni można dostosować do konkretnych zastosowań, skuteczność izolacji pojedynczej komórki jest zawsze zagrożona, gdy zwiększa się rozmiar studni. ^9,15

Aby przezwyciężyć to ogr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprogramowanie AutoCAD	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Nr części 057C1-74A111-1001
Wafel krzemowy	Korporacja Eltech	SPE0039
Piec konwencjonalny	Firma YEONG-SHIN	ovp45
Czyszczarka plazmowa	Nordson	AP-300	Stacjonarny system obróbki plazmowej
SU-8 50 ujemny fotorezystor	MicroChem	Y131269
SU-8 100 ujemny fotorezystor	MicroChem	Y131273
Powlekarka wirowa	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2 "~ 6"
Płyta grzejna	YOTEC firmy	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 deweloper	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego
Skaningowy profilometr laserowy	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl. Niebezpieczny. Działa żrąco na drogi oddechowe, gwałtownie reaguje z wodą.
Eksykator	Bel-Art Products	F42020-0000	Eksykator próżniowy oszczędzający miejsce 190  mm biała podstawa
Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS)	Dow corning	Sylgard 184
Dziurkacz Harris Uni-Core	Ted Pella Inc.	15072	średnicy wewnętrznej 0,75 mm
	3M Company	Taśma usuwalna Scotch 811
Mikroskop stereoskopowy	Leica	Microsystems Leica E24
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Technologia Bersinga	ALB001.500
DMEM podłoże podstawowe	Gibco	12800-017
Surowica bydlęca płodu	Thermo Hyclon	SH30071.03HI Antybiotyki
	Biowest	L0014-100	Glutamina-penicylina-Streptomycyna
Rekombinowana mieszanina enzymów	Innowacyjna technologia komórkowa	AM-105	Accumax
DiIC12(3) barwnik błony komórkowej	BD Biosciences	354218	Używany jako urządzenie do śledzenia komórek
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvarda	703007
Tworzywo sztuczne strzykawka (1 ml)	BD Biosciences	309659
igły o rozmiarze 23 Ever	Sharp Technology, Inc.	TD21
Rurka z politetrafluoroetenu (PTFE)	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	średnica wewnętrzna, 0,51  Mm; średnica zewnętrzna, 0,82  Mm