Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Głównym zadaniem jelita cienkiego jest często uważane trawienie i wchłanianie składników odżywczych¹. Chociaż ta funkcja metaboliczna jest oczywiście niezbędna, jelito cienkie odgrywa równie istotną rolę w ochronie gospodarza przed ciągłym zaporem antygenów środowiskowych znajdujących się w świetle². Przewód pokarmowy oddziela świat zewnętrzny (np. antygeny świetlne) od środowiska wewnętrznego gospodarza za pomocą warstwy nabłonka o grubości tylko jednej warstwy komórkowej. W związku z tym układ odpornościowy jelita cienkiego ma ogromne zadanie zrównoważenia swojego progu reaktywności, umożliwiając obcym antygenom z diety i mikroorganizmom komensalnym przedostanie się do błony śluzowej przy minimalnej, jeśli w ogóle, odpowiedzi immunologicznej, jednocześnie budując silną odpowiedź przeciwko atakującym patogenom i innym "szkodliwym" antygenom. Nadmierna lub niewłaściwa odpowiedź immunologiczna na te antygeny może prowadzić do choroby patologicznej (np. nieswoiste zapalenie jelit, cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane) i należy jej unikać^3-6.

Ogólnie rzecz biorąc, uważa się, że przewód pokarmowy stanowi największy organ odpornościowy w organizmie, zawierający ponad 70% wszystkich komórek wydzielających przeciwciała⁷. Układ odpornościowy jelita cienkiego składa się z 3 głównych przedziałów - blaszki właściwej (LP), warstwy śródnabłonkowej i plam Peyera (PP) - z których każdy zawiera charakterystyczną grupę limfocytów². Limfocyty LP (LPL) to przede wszystkim limfocyty T ^TCRαβ+ z ~20% komórek B; limfocyty śródnabłonkowe (IEL) zawierają bardzo mało limfocytów B z większą liczbą limfocytów T TCRγδ⁺ niż limfocyty T TCRαβ⁺; a PPs, które są wtórnymi narządami limfatycznymi osadzonymi w ścianie jelita cienkiego, zawierają ~80% komórek B. Chociaż każdy z tych regionów anatomicznych ma nieco odrębne funkcje i podstawy ontologiczne, funkcjonują one w zharmonizowany sposób, aby chronić gospodarza przed patogennymi zniewagami.

Ponadto, coraz częściej docenia się, że mikrobiota jest krytycznym czynnikiem determinującym rozwój jelitowego układu odpornościowego, wraz z rosnącym uznaniem pokrewnego związku między określonymi mikrobami a ontogenezą poszczególnych linii komórkowych^8,9. Ponadto, biorąc pod uwagę, że edukacja jelitowego układu odpornościowego wpływa na odpowiedź immunologiczną w anatomicznie odległych miejscach (np^{. zapalenie} stawów, stwardnienie rozsiane, zapalenie płuc), stało się jasne, że rozwój jelitowego układu odpornościowego jest istotny dla większej liczby procesów chorobowych niż wcześniej sądzono. W związku z tym zainteresowanie ilościową oceną jelitowego układu odpornościowego wykroczyło poza interakcje gospodarz-patogen i obecnie obejmuje interakcje gospodarz-komensal oraz patogenezę wielu chorób ogólnoustrojowych.

Biorąc pod uwagę zmienność obecnych metod izolacji limfocytów jelitowych, coraz bardziej krytyczna jest metoda, która jest zoptymalizowana pod kątem wydajności, żywotności i spójności, przy jednoczesnym równoważeniu wymaganego czasu. Protokoły, które obejmują gradienty Percoll, są czasochłonne i pracochłonne oraz potencjalnie bardziej podatne na błędy ludzkie, co prowadzi do zmiennej wydajności i żywotności¹³. W niniejszym dokumencie przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji i charakterystyki limfocytów ze wszystkich 3 przedziałów immunologicznych jelita cienkiego. Dodatkowo, biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie zmianami w układzie odpornościowym błony śluzowej wywołanymi przez drobnoustroje, uwzględniamy kroki, które można zastosować, aby umożliwić poziomą transmisję mikroorganizmów między myszami, aby ocenić, jak te zmiany wpływają ilościowo na jelitowy układ odpornościowy.

Wszystkie badania zostały przeprowadzone pod ścisłym nadzorem i wytycznymi zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Harvard Medical School, która spełnia standardy weterynaryjne określone przez Amerykańskie Stowarzyszenie Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (AALAS).

1. Pozioma transmisja bakterii przez co-housing (opcjonalnie)

1. Aby zminimalizować zanieczyszczenie egzogenne (szczególnie w przypadku myszy gnotobiotycznych), należy stosować technikę aseptyczną podczas montażu sterylnych jednorazowych klatek, używając żywności i wody, które zostały autoklawowane.
2. Użyj dziurkaczy w uszach lub zawieszek, aby indywidualnie oznaczyć 6-tygodniowe myszy C57BL/6, które mają różne mikrobioty i umieścić je w tej samej klatce. Biorąc pod uwagę, że myszy są koprofagiczne i jedzą granulki kału z podłogi klatki, drobnoustroje będą naturalnie przenoszone poziomo między myszami.
3. Myszy należy hodować wspólnie przez ≥1 tydzień, aby dać czas na transfer drobnoustrojów i zmiany immunologiczne przed analizą.

2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z warstwy śródnabłonkowej jelita cienkiego i blaszki właściwej

1. Przygotowanie roztworów
   1. Przygotować pożywkę ekstrakcyjną (na jelito cienkie): 30 ml RPMI + 93 μl 5% (w/v) ditiotreitolu (DTT) + 60 μl 0,5 M EDTA + 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Dodaj naziemną telewizję cyfrową bezpośrednio przed użyciem.
   2. Przygotuj pożywkę wytrawiającą (na jelito cienkie): 25 ml RPMI + 12,5 mg dyspazy + 37,5 mg kolagenazy II + 300 μl FBS. Dodaj dypazę i kolagenazę bezpośrednio przed użyciem.
   3. We wszystkich inkubacjach przeprowadzanych w temperaturze 37 °C należy wstępnie podgrzać roztwory do temperatury 37 °C.
2. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
3. Połóż mysz grzbietem do dołu i spryskaj brzuch 70% etanolem. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię, sekwencyjnie przecinając skórę, a następnie powięź otrzewnową wzdłuż brzusznej linii środkowej od spojenia łonowego do wyrostka mieczykowatego, odsłaniając w ten sposób jamę otrzewnej.
4. Użyj nożyczek, aby oddzielić jelito cienkie od żołądka poprzez przecięcie zwieracza odźwiernika. Delikatnie usuń jelito cienkie z otrzewnej, usuwając tłuszcz krezkowy.
   1. Aby całkowicie usunąć jelito cienkie, wykonaj drugie nacięcie na połączeniu krętniczo-kątniczym. Umieść wyizolowane jelito cienkie w zimnym (tj. 4 °C) RPMI zawierającym 10% FBS, aby zmaksymalizować żywotność komórek.
5. Delikatnie usuń duże kawałki tłuszczu za pomocą zakrzywionych kleszczy. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć rozerwania samej tkanki jelitowej podczas próby usunięcia tłuszczu.
6. Aby usunąć zawartość jelitową, delikatnie przepłukać jelita 15 - 20 ml zimnego PBS za pomocą igły do karmienia 18 G przymocowanej do strzykawki.
7. Użyj nożyczek do wycięcia PP i umieść je w zimnym RPMI zawierającym 5% FBS. PP znajdują się po stronie antykrezkowej jelita cienkiego i występują jako wielopłatkowa biała masa. W zależności od konkretnego szczepu, mysz ma zazwyczaj 8 - 12 PP.
8. Pokrój jelito cienkie na 3-4 calowe segmenty.
9. Usuń resztki tłuszczu, zwijając każdy segment jelita cienkiego na ręczniku papierowym zwilżonym RPMI, używając skalpela, aby usunąć tłuszcz z tkanki.
10. Odwróć tkankę na lewą stronę, kaniulując segmenty jelita zakrzywionymi kleszczami i chwytając dystalny koniec tkanki. Następnie użyj pary prostych kleszczy, aby delikatnie usunąć segment tkanki z zakrzywionych kleszczy (zaczynając od bliższego końca), co spowoduje odwrócenie tkanki.
11. Umieść segmenty tkanek w kubku zawierającym 30 ml pożywki ekstrakcyjnej i mieszadło. Zabezpiecz pokrywkę na kubku i mieszaj z prędkością 500 obr./min przez 15 minut w temperaturze 37 °C; Mieszanie powinno być energiczne, ale nie burzliwe.
12. Po inkubacji należy użyć stalowego sitka, aby oddzielić kawałki tkanek od supernatantu zawierającego nabłonek, które powinny wydawać się mętne. Ten supernatant zawiera limfocyty śródnabłonkowe, które w razie potrzeby można dalej analizować, przystępując do filtrowania próbki w krokach 2.18 - 2.23.
13. Ręcznie wymieszaj kawałki tkanki w RPMI, aby zmyć resztki pożywki ekstrakcyjnej.
14. Umieść chusteczkę na suchym ręczniku papierowym i kilkakrotnie odwróć ją końcem na koniec, aby ułatwić usunięcie resztek śluzu, który nie został uwolniony przez podłoże ekstrakcyjne.
15. Umieść fragmenty tkanek w probówce o pojemności 1,5 ml z 600 μl pożywki wytrawiającej.
16. Użyj nożyczek, aby zmielić tkankę, aż kawałki przestaną przyklejać się do nożyczek, a roztwór będzie wyglądał na jednorodny. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia pełnego trawienia enzymatycznego tkanki.
17. Dodaj zmielone jelito cienkie do kubka zawierającego 25 ml pożywki trawiącej. Mieszać z prędkością 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W połowie trawienia (tj. po 15 minutach) pipetować pipetą w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aby pomóc rozbić duże kawałki tkanki.
18. Przefiltrować strawioną tkankę (lub warstwę nabłonkową z kroku 2.12 w przypadku przetwarzania IELs) przez sitko do komórek 100 μm do probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz sitko 20 ml RPMI zawierającego 10% FBS.
19. Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
20. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI zawierającym 10% FBS.
21. Przefiltrować zawieszone komórki przez sitko o długości 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz sitko 20 ml RPMI zawierającym 10% FBS.
22. Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
23. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI zawierającym 2% FBS.

3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z plastrów Peyera

1. Przenieść wycięte PP do kubka z 25 ml pożywki wytrawiającej i mieszadłem. Zabezpiecz pokrywę i wiruj z prędkością 500 obr./min przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
2. Przefiltrować strawione PP przez sitko o wielkości 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Jeśli pozostaną jakieś grudki, przecisnąć je przez sitko za pomocą płaskiego końca tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml.
3. Przepłucz sitko 10 ml RPMI zawierającego 10% FBS.
4. Odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml RPMI zawierającym 2% FBS.

4. Barwienie powierzchni w cytometrii przepływowej

1. Podzielić odpowiednią objętość komórek (np. 200 μl LPL) na 96-dołkową płytkę okrągłodenną.
2. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.
3. Ponownie zawiesić komórki w 90 μl RPMI zawierającym 2% FBS i rozcieńczeniu anty-CD16/32 (blok Fc) w stosunku 1:100. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Dodać 10 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.
5. Zawieś komórki w 250 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.
6. (Opcjonalnie) W razie potrzeby wybarwić ogniwa barwnikiem żywotności, postępując zgodnie z protokołem producenta.
7. Zawieś komórki w 100 μl 1% formaliny, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.
8. Dodać 200 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.
9. Zawieś komórki w 250 μl PBS. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant przez odwrócenie płytki.
10. Zawieś komórki w 200 μl PBS. Analizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna pojedynczych zawiesin komórkowych limfocytów jelita cienkiego powinna dać dyskretną populację komórek, które mają podobne cechy rozproszenia do przodu i na boki jak splenocyty (Rysunki 1A i 1B). Limfocyty mogą zacząć obumierać, jeśli tkanka nie jest utrzymywana w temperaturze 4 °C podczas początkowych etapów izolacji, co powoduje, że populacja limfocytów ma mniejsze rozproszenie do przodu i jest trudniejsza do oddzielenia od innych komórek nabłonkowych i martwych (ryc. 1C). Co więcej, jeśli tkanka jelita cienkiego nie zostanie całkowicie oczyszczona z tłuszczu krezkowego, następuje praktycznie całkowita utrata limfocytów (ryc. 1D). Cechy te ilustrują, jak szybka praca (tj. niedopuszczenie do rozgrzania tkanki) i zwrócenie uwagi na szczegóły (tj. usunięcie nawet niewielkich ilości tłuszczu krezkowego) jest niezbędne do zapewnienia jakości próbki. Zazwyczaj uzyskujemy ~80% żywotności dla LPL w jelicie cienkim (ryc. 1E).

Rysunek 2A pokazuje, jak skład mikrobioty może znacząco wpływać na liczbę określonych populacji komórek. Jak wykazaliśmy wcześniej, myszy wolne od zarazków (GF), które są całkowicie pozbawione jakichkolwiek mikroorganizmów, mają układ odpornościowy jelita cienkiego, który jest wyraźnie niedojrzały w porównaniu z myszami wolnymi od specyficznych patogenów (SPF), a kolonizacja myszy GF z normalną mikrobiotą myszy (MMb) powoduje przywrócenie układu odpornościowego jelita cienkiego14. W przeciwieństwie do tego, myszy gnotobiotyczne posiadające normalną ludzką mikrobiotę (HMb) - i które mają podobną liczbę i różnorodność bakterii kałowych jak myszy MMb - mają układ odpornościowy jelita cienkiego, który jest nie do odróżnienia od myszy GF14.

Wykorzystując koprofagiczną naturę myszy, wspólne trzymanie myszy razem stanowi prostą, ale potężną metodę umożliwiającą poziome przenoszenie organizmów między myszami. Takie podejście pozwala sprawdzić, czy wynikająca z tego zmiana w mikrobiocie wpływa na układ odpornościowy jelita cienkiego. Na przykład wykazaliśmy, że wspólne zamieszkiwanie myszy HMb z myszami MMb przez 4 tygodnie spowodowało normalizację liczby limfocytów T CD3 + CD8 + w SI LP (Figura 2B) 14. Wynik ten potwierdza, że różnice między myszami MMb i HMb zaobserwowane na rysunku 2A wynikają z różnic w mikrobiocie między tymi myszami – różnic, które można przezwyciężyć poprzez wspólne trzymanie myszy.

Rysunek 1. Limfocyty jelitowe mają cechy FSC i SSC podobne do splenocytów. A - D. Wykresy kropkowe przedstawiające SSC i FSC dla optymalnie przygotowanych komórek splenocytów (A) i blaszki właściwej jelita cienkiego (SI LP) (B - D). B. Próbkę SI LP przygotowano zgodnie z opisanym protokołem. C. Tkanka jelitowa została celowo ogrzana, aby zademonstrować, że komórki SI LP zaczynają mieć niższy FSC. D. Tłuszcz krezkowy nie został oczyszczony z jelita cienkiego przed przygotowaniem pojedynczych komórek, co spowodowało utratę dostrzegalnej populacji limfocytów SI LP. E. Próbka przedstawiona na panelu B została wybarwiona w kroku 4.7 barwnikiem o utrwalającej żywotności (np. eFluor 780) zgodnie z instrukcjami producenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Mikrobiota wpływa na dojrzewanie układu odpornościowego jelita cienkiego. A. Limfocyty T CD3 + CD8 + zostały wyliczone w SI LP myszy SPF, MMb, HMb i GF. B. Myszy HMb były trzymane razem z myszami MMb przez 4 tygodnie przed zliczeniem limfocytów T CD3 + CD8 + w SI LP. Myszy MMb i HMb, które nie były trzymane razem, przeanalizowano w celu porównania. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz, a poziome paski odzwierciedlają średnią. NS, nieznaczące; *, p <0,05; **, p <0,01; , p <0,001. Rysunki są reprodukowane - za zgodą - z odnośnika 14, z niewielką modyfikacją B. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.