Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje test o wysokiej przepustowości, który został z powodzeniem opracowany do badania dużych bibliotek małych cząsteczek pod kątem ich potencjalnej zdolności do manipulowania poziomami komórkowymi cyklicznego di-GMP u Pseudomonas aeruginosa, dostarczając nowego potężnego narzędzia do odkrywania leków przeciwbakteryjnych i testowania związków.

Streszczenie

Oporność bakterii na tradycyjne antybiotyki napędzała próby badawcze mające na celu zidentyfikowanie nowych celów leków w niedawno odkrytych szlakach regulacyjnych. Systemy regulacyjne, które wykorzystują wewnątrzkomórkowy cykliczny di-GMP (c-di-GMP) jako drugi przekaźnik, są jedną z takich klas celów. c-di-GMP to cząsteczka sygnałowa znajdująca się w prawie wszystkich bakteriach, która reguluje szeroki zakres procesów, w tym oporność na antybiotyki, tworzenie biofilmu i zjadliwość. Zrozumienie, w jaki sposób sygnalizacja c-di-GMP kontroluje aspekty rozwoju biofilmu opornego na antybiotyki, sugeruje podejścia, dzięki którym zmiana stężeń komórkowych nukleotydu lub zakłócenie tych szlaków sygnałowych może prowadzić do zmniejszenia tworzenia biofilmu lub zwiększonej podatności biofilmów na antybiotyki. Opisujemy prosty, wysokoprzepustowy protokół bioreporterowy, oparty na białku zielonej fluorescencji (GFP), którego ekspresja jest pod kontrolą promotora reagującego na c-di-GMP cdrA, w celu szybkiego badania przesiewowego małych cząsteczek z potencjałem modulowania poziomów komórkowych c-di-GMP w Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ten prosty protokół może przebadać ponad 3500 związków w ciągu 48 godzin i ma możliwość dostosowania do wielu mikroorganizmów.

Wprowadzenie

Szybki rozwój oporności bakterii na klinicznie ważne antybiotyki jest jednym z głównych problemów, z jakimi obecnie borykają się pracownicy służby zdrowia na całym świecie. Niepowodzenie tradycyjnych antybiotyków skłoniło do nowych poszukiwań materii chemicznej, która może zakłócać procesy bakteryjne związane z wirulencją i postępem choroby¹. Jeden z takich systemów regulacyjnych, który wykorzystuje wewnątrzkomórkowy drugi przekaźnik cykliczny di-GMP (c-di-GMP), stał się ostatnio celem o obiecującej trafności^2-4. Ustalono, że ta globalna cząsteczka sygnałowa drugiego przekaźnika reguluje wiele funkcji, w tym oporność na antybiotyki, adhezję, tworzenie biofilmu i choroby^2-4.

Teraz jest zrozumiałe, że poziom komórkowy c-di-GMP w komórce bakteryjnej jest kontrolowany przez syntezę i degradację, dzięki czemu dwie cząsteczki GTP są używane do syntezy c-di-GMP przez cyklazy diguanylanowe zawierające domenę GGDEF (DGC), podczas gdy degradacja c-di-GMP jest katalizowana przez fosfodiesterazy (PDE), które mają domenę EAL lub HD-GYP (omówione w (3, Białka zawierające te domeny często zawierają inne domeny sygnałowe, co sugeruje, że ich aktywność w obrocie c-di-GMP jest regulowana bezpośrednio lub pośrednio przez sygnały środowiskowe lub komórkowe^3,5. W związku z tym sygnalizacja c-di-GMP łączy wyczuwanie różnych sygnałów środowiskowych z modyfikacjami fenotypu bakteryjnego. c-di-GMP wywiera swoje działanie regulacyjne u bakterii na poziomie transkrypcji, po transkrypcji i po translacji za pomocą różnych mechanizmów⁴.

Głównym wpływem c-di-GMP w wielu komórkach bakteryjnych jest określenie bakteryjnego 'stylu życia', a w szczególności kontrola przejść między ruchliwymi komórkami planktonicznymi a komórkami siedzącymi przyczepionymi do powierzchni lub zorganizowanymi w wielokomórkowe struktury biofilmów^3,5. Ogólnie rzecz biorąc, wysokie poziomy komórkowe c-di-GMP są związane z tworzeniem biofilmu i siedzeniem, podczas gdy niskie poziomy komórkowe sprzyjają ruchliwości i syntezie czynników wirulencji w wielu patogenach bakteryjnych^3,5. W związku z tym bardziej szczegółowa wiedza na temat działania sygnalizacji c-di-GMP może dostarczyć strategii hamowania tworzenia biofilmu i zjadliwości patogenów bakteryjnych. Jest to trudne zadanie, biorąc pod uwagę, że większość genomów bakteryjnych koduje liczne białka z domenami GGDEF, EAL i/lub HD-GYP (na przykład P. aeruginosa ma ponad 40 białek) i wieloma efektorami^6,7.

Jednakże, nawet przy takiej złożoności, ostatnie dowody sugerują, że strategie manipulujące sygnalizacją c-di-GMP mogą zostać opracowane w celu zapobiegania rozwojowi infekcji opornych na antybiotyki lub uczynienia ich podatnymi na działanie układu odpornościowego lub skutecznego leczenia poprzez jednoczesne podawanie klasycznych antybiotyków². W związku z tym wykazano eksperymentalnie, że sztuczne zmniejszenie wewnątrzkomórkowego c-di-GMP u P. aeruginosa hodowanego in vitro prowadzi do zmniejszenia tworzenia biofilmu i zwiększonej podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, podczas gdy biofilmy opracowane przez P. aeruginosa na implantach silikonowych, zlokalizowanych w jamie otrzewnowej myszy, mogą być rozproszone w podobny sposób^8-11.

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy, oparty na fluorescencji test reporterowy do badania małych cząsteczek, które mogą potencjalnie modulować poziomy komórkowe c-di-GMP u P. aeruginosa (Rysunek 1). Test opiera się na pomiarze poziomów komórkowych c-di-GMP przy użyciu wcześniej opracowanego reportera GFP, którego ekspresja jest transkrypcyjnie powiązana z promotorem cdrA reagującym na c-di-GMP¹². Protokół ten opisuje metodologię ekspresji konstruktu reporterowego w będącym przedmiotem zainteresowania szczepie P. aeruginosa, przygotowanie płytki złożonej, inokulację hodowli na płytkach 384-dołkowych, warunki wzrostu, a także szczegóły dotyczące gromadzenia, zarządzania i analizy danych (ryc. 1). Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomoże naukowcom potencjalnie zidentyfikować nowe związki ukierunkowane na sygnalizację c-di-GMP u bakterii oraz do wykorzystania w badaniach mających na celu zrozumienie biologii P. aeruginosa.

Protokół

Uwaga: Procedury klonowania i transformacji oczyszczonego plazmidu reporterowego c-di-GMP zostały omówione w innym opracowaniu¹².

1. Generowanie szczepu P. aeruginosa będącego reporterem c-di-GMP z tagiem GFP

1. Zaszczep jedną kolonię do 5 ml pożywki LB (lysogeny broth) P. aeruginosa i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 obr./min.
2. Przenieś 2 ml kultury nocnej do 200 ml świeżej pożywki LB w kolbie o pojemności 1 l i inkubuj w 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Monitoruj gęstość optyczną przy 600 nm (OD600)₆₀₀) co 30 min, pobierając z kolby próbkę o objętości 1 ml i analizując ją za pomocą spektrofotometru (zgodnie z wcześniejszym opisem¹²).
4. Gdy wartość OD₆₀₀ po osiągnięciu wartości od 0,3 do 0,5, przenieść 40 ml hodowli do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Odwirować komórki, wirując z prędkością 8 000 obr./min przez 10 min w temperaturze 4 °Codrzucić nadsącz i zawiesić komórki ponownie w 40 ml lodowatego, sterylnego, 300 mM roztworu sacharozy.
6. Ponownie osadź komórki poprzez wirowanie zgodnie z opisem w kroku 1.5, a następnie zawieś je w 20 ml lodowatego, sterylnego, 300 mM roztworu sacharozy.
7. Ostatni raz zwirować komórki w celu otrzymania osadu, zgodnie z opisem w punkcie 1.5, a następnie zawiesić je ponownie w 400 µl lodowatego, sterylnego, 300 mM roztworu sacharozy.
   Uwaga: Gęstość komórek w tym momencie powinna wynosić około 1 x 10¹¹ jednostki tworzące kolonie na mililitr (CFU/ml).
8. Schłodzić komórki na lodzie przez 30 min, po czym będą one gotowe do elektroporacji.
9. Dodaj 1 µl z 0.2 µg/µl pCdrA::gfp^C plazmid ¹² rozwiązanie dla 40 µl z P. aeruginosa komórki elektrokompetentne przygotowane powyżej w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, uprzednio schłodzonej na lodzie. Wymieszać zawiesinę i przenieść do uprzednio schłodzonej kuwety do elektroporacji z przerwą międzyelektrodową 2 mm.
   Uwaga: pCdrA::gfp^CpUCP22Not-P_cdrA-RBSII-gfp(Mut3)-T₀-T₁, Amp^{Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.} Gm^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.}, co pozwala na fluorescencyjny odczyt wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP w P. aeruginosa szczepy, została opracowana i zwalidowana przez Rybtke i wsp.¹².
10. Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą ręcznika papierowego i umieść kuwetę w komorze próbkowej elektroporatora. Wykonaj impuls przy napięciu 2,5 kV i pojemności 25 µF oraz opornością 200 Ω.
11. Wyjmij kuwetę i dodaj 1 ml pożywki LB. Następnie przenieś komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubuj przez 2 h w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
12. Rozprzestrzenianie 10 µl, 50 µl i 100 µl alikwoty hodowli na sterylne płytki z agarem LB z dodatkiem ampicyliny (w stężeniu 100 µg/ml), a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
13. Potwierdzić ekspresję GFP (wzbudzenie przy 485 nm, emisja przy 520 nm), badając płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym z zastosowaniem standardowego kanału GFP, a następnie pobrać pojedynczą kolonię do zaszczepienia 5 ml pożywki LB. Inkubować przez noc zgodnie z opisem w kroku 1.1. W probówce z nakrętką o pojemności 2 ml zmieszać 0,5 ml nocnej kultury z 0,5 ml 50% glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie kultury startowej do inokulacji

1. Na dwa dni przed przesiewaniem, wysejati szczep P. aeruginosa (zawierający plazmid pCdrA::gfp^C) z mrożonki -80 °C na płytkę z agarem LB (uzupełnionym ampicyliną w stężeniu 100 µg/ml), delikatnie rozprowadzając bakterie po powierzchni płytki za pomocą sterylnej pętli szczepiącej. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Wieczorem przed przesiewaniem, zaszczepić pojedynczą kolonię P. aeruginosa z płytki do 10 ml pożywki LB (uzupełnionej ampicyliną w stężeniu 100 µg/ml) w probówce i inkubować prekulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm.
3. W dniu przesiewania, przygotować subkulturę z nocnej prekultury, rozcieńczając ją najpierw świeżą pożywką LB do OD₆₀₀ wynoszącej 1,0, a następnie dalej rozcieńczając 5% LB do OD₆₀₀ wynoszącej 0,04 (stosunek 1:25).
   Uwaga: Całkowita objętość zaszczepionej pożywki zależy od liczby płytek przeznaczonych do testów. 5% LB przygotowuje się poprzez rozcieńczenie 100% LB w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do wymaganego stężenia. Co ważne, pożywka (5% LB) umożliwia konstytutywną aktywację pCdrA::gfp^C u P. aeruginosa.
4. Włożyć sterylny mieszadło magnetyczne do naczynia i mieszać kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić bakteriom aklimatyzację do pożywki przed ich rozniesieniem do płytek 384-dołkowych.

3. Inokulacja i inkubacja płytek 384-dołkowych zawierających małe cząsteczki

Uwaga: Sterylność i stosowanie prawidłowych technik aseptycznych są kluczowe w poniższych krokach.

1. Aby przygotować kontrolę pozytywną (100% inhibicji), dodać 20 µl siarczanu tobramycyny (25 mg/ml) do 10 ml (ilość wystarczająca na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Nanieść pipetą 40 µl kultury kontroli pozytywnej do dołków A23 - P23 (Rysunek 2).
2. Aby przygotować kontrolę negatywną (0% inhibicji), dodać 30 µl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 10 ml (ilość wystarczająca na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Nanieść pipetą 40 µl kultury kontroli negatywnej do dołków A24 - P24 (Rysunek 2).
3. W przypadku każdej z płytek z naniesionymi małymi cząsteczkami, zaszczepić objętość 40 µl rozcieńczonych kultur nocnych (opisanych w kroku 2.3) do dołków A1 - P22 (Rysunek 2).
   Uwaga: Można to wykonać przy użyciu robota do obsługi cieczy. Ze względu na heterogeniczne właściwości kultur bakteryjnych, ważne jest utrzymanie ciągłego i umiarkowanego mieszania, aby bakterie były równomiernie rozłożone w pożywce podczas dozowania. W tym celu należy stale mieszać magnetycznie zaklimatyzowaną kulturę z kroku 2.4 podczas dozowania.
4. Uszczelnić płytki przepuszczalną powietrznie folią uszczelniającą i inkubować przez 6 hr w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Przepuszczalna powietrznie folia jest kluczowa dla utrzymania niezmiennych warunków we wszystkich 384 dołkach i zapobiegania potencjalnemu powstawaniu gradientów tlenu na całej płytce.

4. Pomiar wzrostu (OD₆₀₀) i wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP (GFP)

1. Około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym wstępnie podgrzej czytnik płytek do 37 °C, aby uniknąć kondensacji.
2. Przed odczytem ostrożnie usuń przepuszczalną dla powietrza membranę uszczelniającą. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm, ustawiając 10 błysków na dołek i czas stabilizacji 0,2 sec.
3. Przed pomiarem fluorescencji wykonaj automatyczną regulację wzmocnienia i ogniskowania w oparciu o dołek A24 (kontrola negatywna) i ustaw docelową wartość wzmocnienia na 75% (Rysunek 2).
   1. W oprogramowaniu sterującym czytnikiem płytek kliknij „start measurement” i przejdź do karty „Focus and Gain Adjustment/Plate IDs”.
   2. Po prawej stronie okna wybierz „Focus Adjustment” oraz „Channel A”.
   3. Wybierz „Gain Adjustment” i „Selected well”, a następnie wpisz „75” jako „Target value”. Na koniec wybierz dołek A24 w układzie płytek przed kliknięciem „Start Adjustment”. Po przeprowadzeniu regulacji kliknij „Start measurement”.
   4. Zmierz fluorescencję reportera GFP przy maksimach wzbudzenia/emisji 485/520 nm, ustawiając 10 błysków na dołek i czas stabilizacji 0,2 sec.
4. Zbierz dane ze wszystkich badanych płytek. Uwaga: Odczyty danych są automatycznie zapisywane domyślnie przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek.
   1. Przejrzyj odczyty, klikając ikonę „Mars” w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.
   2. Pobierz dane, wykonując „podwójne kliknięcie” na numer interesującej Cię płytki, aby uzyskać dostęp do danych do analizy.

5. Analiza danych

1. Oceń jednorodność i powtarzalność testu za pomocą analizy robust z', która jest najczęściej raportowanym wskaźnikiem jakości w badaniach wysokoprzepustowych. Oblicz robust z' korzystając ze wzoru:
   
   Gdzie MAD (Median Absolute Deviation) jest szacunkiem odchylenia standardowego, p to kontrola dodatnia (100% inhibicji), a n to kontrola ujemna (0% inhibicji) zarówno dla wartości OD₆₀₀, jak i GFP. Uwaga: Test z wartością robust z' (obliczoną dla surowych danych OD₆₀₀ i GFP) większą niż lub równą 0,5 jest uważany za test doskonały.
2. Oblicz % inhibicji wzrostu korzystając ze wzoru:
   
   Gdzie Xi_OD600 to iterowana wartość OD₆₀₀ dla każdej studzienki z próbką. % Inhibicji_OD600 > 0 oznacza inhibitor wzrostu; % Inhibicji_OD600 < 0 oznacza promotor wzrostu.
3. Oceń % inhibicji wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP korzystając ze wzoru (zmiany w arbitralnych jednostkach intensywności fluorescencji są korygowane o zmianę gęstości komórek):
   
   Gdzie Xi_GFP to iterowana wartość GFP dla każdej studzienki z próbką. % Inhibicji_GFP > 0 oznacza inhibitor c-di-GMP; % Inhibicji_GFP < 0 oznacza promotor c-di-GMP.
4. Ustal próg detekcji hitów na poziomie 3 MAD od mediany (mediana ±3 MAD), obliczony z odczytów studzienek z próbkami dla każdej płytki, zakładając normalny rozkład punktów danych. Uwaga: W razie potrzeby, dla bardziej powtarzalnych i dokładnych testów zależności dawka-odpowiedź, można wybrać próg odcięcia inhibicji ±50%.

Wyniki

Opisana tutaj metoda pozwala jednemu badaczowi na wydajne i skuteczne przesianie średnio 3500 związków w ciągu 48 godzin. Przegląd protokołu wysokoprzepustowych przesiewów przedstawiono w formie schematu blokowego w Rycina 1W niniejszym artykule prześwietliliśmy bibliotekę związków zgodnych z regułą pięciu w poszukiwaniu potencjalnych związków modulujących c-di-GMP przy stężeniu końcowym wynoszącym 600 µMDostępnych jest jednak wiele komercyjnych zestawów związków o charakterze lekopodobnym i nielekopodobnym, które można wykorzystać w tym teście. Zestawy te mogą składać się ze związków ukierunkowanych na bakterie lub z losowo dobranych pul związków, przy czym każda biblioteka posiada przypisane przewidywane właściwości i charakterystyki fizykochemiczne, podobnie jak zestaw wykorzystany w niniejszym badaniu, który charakteryzował się obecnością polarnych grup funkcyjnych oraz wielu centrów stereogenicznych. W niniejszym protokole bakterie są inokulowane na płytkę wraz ze związkami, dodatnią kontrolą antybiotykową oraz kontrolą nośnika DMSO, zgodnie z układem przedstawionym w Rycina 2. Rycina 3 przedstawia wyniki przesiewania pierwotnego na przykładzie pojedynczej płytki bibliotecznej. Reprezentatywna wartość OD₆₀₀ a surowe dane GFP przedstawiono w Rycina 3A i 3Bodpowiednio. Gradientowa mapa ciepła, w której kolory od ciepłych (czerwonych) do chłodnych (zielonych) wskazują niskie i wysokie wartości OD₆₀₀wartości /GFP zostały zastosowane do wartości w dołkach. Mapy ciepła zostały wygenerowane w programie arkusza kalkulacyjnego poprzez zastosowanie formatowania warunkowego w skali 3 kolorów, obejmującej zakres od najniższej wartości OD₆₀₀odczyt GFP do najwyższej wartości OD₆₀₀odczyt GFP. Niska OD₆₀₀ a wartości GFP w stosunku do ujemnej kontroli DMSO odpowiadają odpowiednio zahamowaniu wzrostu oraz poziomu c-di-GMP, podczas gdy wysokie wartości w stosunku do ujemnej kontroli DMSO odpowiadają odpowiednio stymulacji wzrostu oraz poziomu c-di-GMP. Niezawodne wartości z' dla OD₆₀₀ oraz GFP oblicza się zgodnie z formułą podaną w protokole (5.1). Ponieważ obie wartości przekraczają 0,5 (odpowiednio 0,694 i 0,761), uznano, że jakość testu jest stabilna i przystąpiono do dalszej analizy danych. Procent hamowania wzrostu (OD₆₀₀) oraz wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP (GFP) oblicza się zgodnie z formułami podanymi w protokole (5.2, 5.3). Reprezentatywne dane przedstawiono w Rycina 4A i 4B odpowiednio. Do wartości w dołkach zastosowano kolorystyczną mapę ciepła z gradientem od barw ciepłych (czerwonych) do zimnych (zielonych), wskazujących odpowiednio niski i wysoki procent inhibicji. Wykres rozrzutu procentu inhibicji_(OD600/GFP) z poszczególnych dołków na podstawie przesiewu pierwotnego przedstawiono na Rycina 5A i 5B do pomiaru OD₆₀₀ oraz dane GFP odpowiednio. Do wykrywania hitów wybrano próg ±50% (oznaczony liniami przerywanymi). Potencjalne hity wyznaczone na podstawie tego progu zaznaczono czerwonymi kropkami. W analizie można wyróżnić dwa rodzaje związków interesujących. Hity zidentyfikowane w Rycina 5A są związkami hamującymi wzrost bakterii, podczas gdy trafienia zidentyfikowane w Rycina 5B są związkami, które potencjalnie posiadają zdolność do modulowania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP. W ramach tego testu zidentyfikowano dwa związki jako reprezentatywne trafienia. Są to związek A, będący potencjalnym inhibitorem wzrostu, oraz związek B, będący potencjalnym inhibitorem c-di-GMP. Związek A odpowiada studzience F8 w Rysunki 3 i 4 i wykazało 72,5% zahamowania wzrostu. Odnotowano oczekiwany, odpowiadający temu spadek poziomu cyklicznego di-GMP. Związek B odpowiada studzience K3 w Rycina 3 i 4 i wykazały 61% inhibicji poziomu cyklicznego di-GMP bez wpływu na wzrost. Wybrane związki hitowe zostały poddane dalszym badaniom w 10-punktowym teście zależności dawka-odpowiedź z maksymalnym stężeniem 2 mM i dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń. IC₅₀ wartości są obliczane na podstawie krzywych zależności dawka-odpowiedź (Rysunek 6A i B).

Rycina 1. Przegląd: Układ wysokoprzepustowy do przesiewania małych cząsteczek pod kątem ich potencjału do modulowania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP w P. aeruginosa. Ten przegląd przedstawia krok po kroku reprezentację protokołu zastosowanego w tym teście. Kolonię bakteryjną P. aeruginosa hoduje się przez noc w kulturze startowej LB. Przy użyciu dyspensera odczynników komórki są inokulowane do płytek 384-dołkowych zawierających wybrane związki. Płytki inkubuje się przez 6 godzin, po czym mierzy się wartości OD₆₀₀ oraz GFP. Na podstawie tych odczytów można zidentyfikować związki, które wpływają na wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2. Plan płytki 384-dołkowej wykorzystanej w teście screeningu małych cząsteczek. Związki z biblioteki (jasnoniebieski) są rozdzielane do dołków A1 - P22. „Kontrolę pozytywną” (czerwony), składającą się z końcowego stężenia 50 µg/ml siarczanu tobramycyny, dodaje się do dołków A23 - P23, a „kontrolę negatywną” (zielony), zawierającą końcowe stężenie 1% DMSO, do dołków A24 - P24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Reprezentatywne wyniki dla jednej 384-dołkowej płytki przesiewowej. Reprezentatywne surowe dane dla OD₆₀₀ (A) oraz GFP (B). Do wartości w dołkach zastosowano kolorystyczną mapę ciepła z gradientem od barw ciepłych (Czerwony: OD₆₀₀ = 0.65 lub GFP = 250,000) do zimnych (Zielony: OD₆₀₀ = 0.10 lub GFP = 40,000), wskazującymi wartości od niskich do wysokich. Dołki z niższymi odczytami OD₆₀₀/GFP w stosunku do negatywnej kontroli DMSO będą miały tendencję do koloru czerwonego, natomiast dołki z wyższymi odczytami OD₆₀₀/GFP w stosunku do kontroli DMSO będą miały tendencję do koloru zielonego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Reprezentatywne wyniki obliczonego procentu hamowania dla płytki 384-dołkowej. Przedstawiono przeanalizowane dane dotyczące % hamowania dla odczytów OD₆₀₀ (A) oraz GFP (B). Do wartości w dołkach zastosowano mapę ciepła z gradientem kolorów od ciepłych (czerwony: OD₆₀₀ = -150% lub GFP = -20%) do zimnych (zielony: OD₆₀₀ = 100% lub GFP = 100%), gdzie kolory wskazują wartości hamowania od niskich do wysokich. Małe cząsteczki, które potencjalnie hamują wzrost i wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP, będą miały tendencję do barwy zielonej, natomiast małe cząsteczki, które potencjalnie promują wzrost i poziom wewnątrzkomórkowego c-di-GMP, będą miały tendencję do barwy czerwonej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5. Reprezentatywne wykresy rozrzutu dla % hamowania_(OD600/GFP) uzyskane dla każdej przetestowanej małej cząsteczki. Każda mała cząsteczka jest reprezentowana przez kropkę, a przedstawiono rozkład % hamowania dla odczytów OD₆₀₀ (A) oraz GFP (B). Jako próg identyfikacji hitów wybrano wartość ±50%. Potencjalne hity zostały zaznaczone na czerwono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 6. Reprezentatywne wyniki testu zależności dawka-odpowiedź. Dwa związki (potencjalny inhibitor wzrostu A oraz potencjalny inhibitor c-di-GMP B) zidentyfikowane w poprzednich przesiewach zostały poddane dalszym testom w 10-punktowym badaniu zależności dawka-odpowiedź z maksymalnym stężeniem 2 mM i dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń. Dopasowanie czteroparametrowej funkcji logistycznej do danych pozwoliło wyznaczyć wartości IC₅₀ wynoszące odpowiednio 158 µM i 193 µM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Oczywiste jest, że aby poprawić leczenie zakażeń bakteryjnych, konieczne jest lepsze zrozumienie zachowania bakterii na molekularnym poziomie regulacyjnym. Opisana tutaj procedura będzie korzystna dla mikrobiologów, biochemików i klinicystów, którzy chcą odkryć małe cząsteczki, które mogą manipulować lub zakłócać stężenie komórkowe c-di-GMP w bakteriach. Metoda wykorzystuje niedawno opracowany bioreporter GFP do monitorowania komórkowych poziomów c-di-GMP w P. aeruginosa¹². Ten bioreporter został zwalidowany i wykazano, co ważne, że nie wpływa na wzrost używanego szczepu, gdy jest hodowany w 5% LB w PBS. Zastosowanie badania przesiewowego całej komórki do identyfikacji małych cząsteczek, które zmieniają poziomy c-di-GMP in vivo , pozwala przezwyciężyć główne trudności związane z odkrywaniem leków na podstawie celów w zakresie przenikania cząsteczek przez błony bakteryjne, w szczególności przez błony bakterii Gram-ujemnych. Co ważne, test wydaje się bardzo solidny, ponieważ we wszystkich dotychczasowych badaniach przesiewowych zaobserwowano solidną wartość z' stale powyżej 0,5. Badania przesiewowe przy użyciu tego protokołu ujawnią szereg małych cząsteczek, które hamują i/lub promują wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP u P. aeruginosa. Co więcej, test ten ma również potencjał do identyfikacji związków bakteriobójczych lub bakteriostatycznych powodujących zmniejszenie odczytu OD₆₀₀ .

Chociaż nie zostało to omówione w sekcji dotyczącej protokołu, istnieje kilka ważnych kwestii związanych z przygotowaniem eksperymentu. Należy pamiętać, że bioreporter GFP jest oparty na plazmidzie. Chociaż wiadomo, że plazmid reporterowy jest bardzo stabilny u P. aeruginosa, może zostać utracony po ciągłym ponownym posiewaniu, stąd potrzeba użycia świeżo posianych szczepów z glicerolu o temperaturze -80 °C, a sprawdzenie ekspresji fluorescencji ma kluczowe znaczenie. Bardzo cenne jest również utrzymanie jednolitych warunków wzrostu na całym ekranie, ponieważ wszelkie wahania tych warunków mogą mieć efekt domina na ekranie. Obejmowałoby to upewnienie się, że pożywki i antybiotyki są wstępnie przygotowane w partiach i stosowane przez cały czas trwania badania. Kultury bakterii, które nie rosną w sposób jednolity (na podstawie odczytów OD₆₀₀ ) są częstym problemem w przypadku większości tego rodzaju przesiewaczy o wysokiej przepustowości. Może to być spowodowane efektami krawędzi lub dozowaniem niejednorodnej kultury bakteryjnej do płytek. W pierwszym przypadku niezbędne jest upewnienie się, że podczas inkubacji używana jest uszczelka przepuszczająca gaz. Natomiast w przypadku tych ostatnich zaleca się zalewanie rurki do obsługi cieczy objętością kultury co najmniej trzykrotnie większą niż objętość martwa samego przewodu. Bardzo ważne jest, aby mieszadło magnetyczne działało na minimalnej prędkości podczas dozowania. Podczas gdy monitorowanie i przechowywanie płytek 384-dołkowych w celu stałego wzrostu w trakcie eksperymentów jest najważniejsze, sytuacją, której należy unikać, jest układanie płytek w stosy podczas inkubacji, ponieważ może to powodować niepożądane gradienty tlenu prowadzące do przekrzywienia wzorca wzrostu. Ważne jest również, aby upewnić się, że nośnik DMSO używany jako kontrola ujemna nie wpływa negatywnie na wzrost szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. Wielu z tych problemów związanych ze wzrostem można uniknąć, wykonując próbne badanie przesiewowe z interesującym szczepem bakteryjnym przed badaniem przesiewowym. Interpretacja danych również zasługuje na rozważenie, biorąc pod uwagę, że wyniki hamowania c-di-GMP są obliczane na podstawie zmiany dowolnych jednostek intensywności fluorescencji, które należy skorygować o zmianę gęstości komórek. Mając to na uwadze, należy również rozważyć różne wzory matematyczne do oceny danych wyjściowych z tych eksperymentów. Na przykład związek może wydawać się inhibitorem c-di-GMP, ale w rzeczywistości być inhibitorem wzrostu lub odwrotnie, co wymaga ostrożnej interpretacji zidentyfikowanych trafień.

Istnieje kilka wad i ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania i działania tego wysokowydajnego ekranu komórkowego. Na przykład, bioreporter działa w oparciu o pośredni pomiar komórkowych poziomów c-di-GMP za pomocą sondy fluorescencyjnej, na której właściwości detekcyjne mogą potencjalnie wpływać małe cząsteczki użyte w badaniu przesiewowym. Istotną kwestią jest fakt, że test komórkowy nie dostarcza żadnych informacji na temat mechanizmu stojącego za zmianami poziomów wewnątrzkomórkowego c-di-GMP. Dlatego ważne obserwacje z eksperymentów muszą zostać potwierdzone przy użyciu podejścia opartego na wysokosprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, która jest uważana za "złoty standard" metody pomiaru wewnątrzkomórkowych fluktuacji c-di-GMP u bakterii. Co więcej, nasza procedura może dostarczyć jedynie informacji na temat zachowania bakterii hodowanych in vitro, ponieważ komórki bakteryjne hodowane w kontekście gospodarza (in vivo) szybko modyfikują swoje działania pod wpływem tego środowiska. Co więcej, proces korzystania z bioreportera GFP oznacza, że ekran nie bierze pod uwagę stanu fizjologicznego komórek bakteryjnych. Protokół można jednak dostosować do mikroskopowego monitorowania poszczególnych studni w trakcie badania przesiewowego.

Nawet biorąc pod uwagę te rozważania i ograniczenia, ten wysokoprzepustowy test jest nadal solidnym badaniem przesiewowym dla małych cząsteczek zdolnych do zakłócania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP. Ponieważ wiele gatunków drobnoustrojów, w tym wiele patogenów bakteryjnych, zostało przebadanych w celu scharakteryzowania modulacji wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP, nasz protokół może być zastosowany do różnych gatunków bakterii i rozszerzony o badanie bardziej złożonych wielogatunkowych modeli bakterii. Test można łatwo zoptymalizować pod kątem innych gatunków bakterii, zmieniając stosowane warunki wzrostu, lub można go dostosować do odczytu innych wyników przy użyciu różnych bioreporterów. W zależności od fazy wzrostu będącej przedmiotem zainteresowania można zastosować różne czasy inkubacji. Jednak przy zwiększaniu skali lub zwiększaniu przepustowości należy pamiętać, że bakterie będą nadal rosły podczas przygotowywania płytek i pomiarów odczytu. Dlatego zaleca się przesiewanie maksymalnie 15 płyt jednocześnie przy użyciu tego protokołu. Co więcej, używanie płytek z więcej niż 384 dołkami może nie pozwolić na równomierny wzrost, co wymaga dalszej optymalizacji. Przy zmniejszaniu liczby płytek bardziej odpowiednie może być ręczne zaszczepianie za pomocą pipety elektronicznej zamiast robota do obsługi płynów. Oczywiste jest, że protokół ten może być wykorzystany do badania małych cząsteczek, które rozpraszają biofilmy, biorąc pod uwagę, że związki anty-biofilmu zakłócają sygnalizację c-di-GMP. Protokół może również zostać opracowany ponownie, aby zrozumieć różne aspekty fizjologii bakterii. Biorąc pod uwagę, że sygnalizacja c-di-GMP jest powszechna u większości bakterii, badając fizjologię tych organizmów za pomocą tego protokołu, możemy zidentyfikować różne bodźce chemiczne, aby określić, czy ich mechanizmy działania wymagają sygnalizacji c-di-GMP.

Podsumowując, solidność i wszechstronność podejścia przedstawionego w tym protokole pomoże w identyfikacji chemicznych modulatorów sygnalizacji c-di-GMP w wielu systemach biologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół lizogeniczny (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Rosół lizogeniczny z agarem (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicylina sodowa	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glicerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Buforowany fosforanem Sól fizjologiczna, pH 7,4	Technologie życiowe	10010-056
Siarczan tobramycyny	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Sulftlenek dimetylu (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Spektrofotometr UV-Vis Genesys 10S	Thermoscientific	840-208100
Kuweta elektroporatora 2 mm	Bio-Rad	1652092
Elektroporator BioRad GenePulser XCell	Bio-Rad	1652662
Stereomikroskop fluorescencyjny Leica	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND mieszadło magnetyczne, PTFE, cylindryczne z pierścieniem obrotowym (przed użyciem sterylizować w autoklawie)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-dołkowe, białościenne, przezroczyste płytki	Greiner	781098
Dozownik odczynników Multidrop Combi	Thermo Scientific	5840300
Rurka Multidrop Combi	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-kanałowa pipeta elektroniczna	Integra Biosciences	4642
100 ml sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki	Fisher Scientific	12399175
Membrany przepuszczające powietrze AeraSeal	Sigma Aldrich
Czytnik płytek Pherastar (Wersja oprogramowania: 4.00 R4, Wersja oprogramowania: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS

MKBQ1886