Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Summary

Ten artykuł opisuje test o wysokiej przepustowości, który został z powodzeniem opracowany do badania dużych bibliotek małych cząsteczek pod kątem ich potencjalnej zdolności do manipulowania poziomami komórkowymi cyklicznego di-GMP u Pseudomonas aeruginosa, dostarczając nowego potężnego narzędzia do odkrywania leków przeciwbakteryjnych i testowania związków.

Abstract

Oporność bakterii na tradycyjne antybiotyki napędzała próby badawcze mające na celu zidentyfikowanie nowych celów leków w niedawno odkrytych szlakach regulacyjnych. Systemy regulacyjne, które wykorzystują wewnątrzkomórkowy cykliczny di-GMP (c-di-GMP) jako drugi przekaźnik, są jedną z takich klas celów. c-di-GMP to cząsteczka sygnałowa znajdująca się w prawie wszystkich bakteriach, która reguluje szeroki zakres procesów, w tym oporność na antybiotyki, tworzenie biofilmu i zjadliwość. Zrozumienie, w jaki sposób sygnalizacja c-di-GMP kontroluje aspekty rozwoju biofilmu opornego na antybiotyki, sugeruje podejścia, dzięki którym zmiana stężeń komórkowych nukleotydu lub zakłócenie tych szlaków sygnałowych może prowadzić do zmniejszenia tworzenia biofilmu lub zwiększonej podatności biofilmów na antybiotyki. Opisujemy prosty, wysokoprzepustowy protokół bioreporterowy, oparty na białku zielonej fluorescencji (GFP), którego ekspresja jest pod kontrolą promotora reagującego na c-di-GMP cdrA, w celu szybkiego badania przesiewowego małych cząsteczek z potencjałem modulowania poziomów komórkowych c-di-GMP w Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ten prosty protokół może przebadać ponad 3500 związków w ciągu 48 godzin i ma możliwość dostosowania do wielu mikroorganizmów.

Introduction

Szybki rozwój oporności bakterii na klinicznie ważne antybiotyki jest jednym z głównych problemów, z jakimi obecnie borykają się pracownicy służby zdrowia na całym świecie. Niepowodzenie tradycyjnych antybiotyków skłoniło do nowych poszukiwań materii chemicznej, która może zakłócać procesy bakteryjne związane z wirulencją i postępem choroby¹. Jeden z takich systemów regulacyjnych, który wykorzystuje wewnątrzkomórkowy drugi przekaźnik cykliczny di-GMP (c-di-GMP), stał się ostatnio celem o obiecującej trafności^2-4. Ustalono, że ta globalna cząsteczka sygnałowa drugiego przekaźnika reguluje wiele funkcji, w tym oporność na antybiotyki, adhezję, tworzenie biofilmu i choroby^2-4.

Teraz jest zrozumiałe, że poziom komórkowy c-di-GMP w komórce bakteryjnej jest kontrolowany przez syntezę i degradację, dzięki czemu dwie cząsteczki GTP są używane do syntezy c-di-GMP przez cyklazy diguanylanowe zawierające domenę GGDEF (DGC), podczas gdy degradacja c-di-GMP jest katalizowana przez fosfodiesterazy (PDE), które mają domenę EAL lub HD-GYP (omówione w (3, Białka zawierające te domeny często zawierają inne domeny sygnałowe, co sugeruje, że ich aktywność w obrocie c-di-GMP jest regulowana bezpośrednio lub pośrednio przez sygnały środowiskowe lub komórkowe^3,5. W związku z tym sygnalizacja c-di-GMP łączy wyczuwanie różnych sygnałów środowiskowych z modyfikacjami fenotypu bakteryjnego. c-di-GMP wywiera swoje działanie regulacyjne u bakterii na poziomie transkrypcji, po transkrypcji i po translacji za pomocą różnych mechanizmów⁴.

Głównym wpływem c-di-GMP w wielu komórkach bakteryjnych jest określenie bakteryjnego 'stylu życia', a w szczególności kontrola przejść między ruchliwymi komórkami planktonicznymi a komórkami siedzącymi przyczepionymi do powierzchni lub zorganizowanymi w wielokomórkowe struktury biofilmów^3,5. Ogólnie rzecz biorąc, wysokie poziomy komórkowe c-di-GMP są związane z tworzeniem biofilmu i siedzeniem, podczas gdy niskie poziomy komórkowe sprzyjają ruchliwości i syntezie czynników wirulencji w wielu patogenach bakteryjnych^3,5. W związku z tym bardziej szczegółowa wiedza na temat działania sygnalizacji c-di-GMP może dostarczyć strategii hamowania tworzenia biofilmu i zjadliwości patogenów bakteryjnych. Jest to trudne zadanie, biorąc pod uwagę, że większość genomów bakteryjnych koduje liczne białka z domenami GGDEF, EAL i/lub HD-GYP (na przykład P. aeruginosa ma ponad 40 białek) i wieloma efektorami^6,7.

Jednakże, nawet przy takiej złożoności, ostatnie dowody sugerują, że strategie manipulujące sygnalizacją c-di-GMP mogą zostać opracowane w celu zapobiegania rozwojowi infekcji opornych na antybiotyki lub uczynienia ich podatnymi na działanie układu odpornościowego lub skutecznego leczenia poprzez jednoczesne podawanie klasycznych antybiotyków². W związku z tym wykazano eksperymentalnie, że sztuczne zmniejszenie wewnątrzkomórkowego c-di-GMP u P. aeruginosa hodowanego in vitro prowadzi do zmniejszenia tworzenia biofilmu i zwiększonej podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, podczas gdy biofilmy opracowane przez P. aeruginosa na implantach silikonowych, zlokalizowanych w jamie otrzewnowej myszy, mogą być rozproszone w podobny sposób^8-11.

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy, oparty na fluorescencji test reporterowy do badania małych cząsteczek, które mogą potencjalnie modulować poziomy komórkowe c-di-GMP u P. aeruginosa (Rysunek 1). Test opiera się na pomiarze poziomów komórkowych c-di-GMP przy użyciu wcześniej opracowanego reportera GFP, którego ekspresja jest transkrypcyjnie powiązana z promotorem cdrA reagującym na c-di-GMP¹². Protokół ten opisuje metodologię ekspresji konstruktu reporterowego w będącym przedmiotem zainteresowania szczepie P. aeruginosa, przygotowanie płytki złożonej, inokulację hodowli na płytkach 384-dołkowych, warunki wzrostu, a także szczegóły dotyczące gromadzenia, zarządzania i analizy danych (ryc. 1). Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomoże naukowcom potencjalnie zidentyfikować nowe związki ukierunkowane na sygnalizację c-di-GMP u bakterii oraz do wykorzystania w badaniach mających na celu zrozumienie biologii P. aeruginosa.

Protocol

Uwaga: Procedury klonowania i transformacji oczyszczonego plazmidu reporterowego c-di-GMP są omówione gdzie^{indziej 12}.

1. Generacja GFP Oznaczone c-di-GMP Reporter Szczep P. aeruginosa

1. Zaszczepić 5 ml pożywki bulionu lizogenicznego (LB) pojedynczą kolonią P. aeruginosa i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
2. Przenieść 2 ml kultury na noc do 200 ml świeżej pożywki LB w kolbie o pojemności 1 l i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Monitorować gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) co 30 minut, pobierając próbkę o objętości 1 ml z kolby i badając za pomocą spektrofotometru (jak opisano poprzednio¹²).
4. Gdy OD₆₀₀ osiągnie między 0,3 a 0,5, umieść 40 ml kultury w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Osadzać komórki przez odwirowywanie z prędkością 8 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml lodowatego, sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 300 mM.
6. Osadzać komórki po raz drugi przez odwirowanie zgodnie z opisem w kroku 1.5 i ponownie zawiesić w 20 ml lodowatego, sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 300 mM.
7. Osadzać komórki po raz ostatni przez odwirowanie zgodnie z opisem w kroku 1.5 i ponownie zawiesić w 400 μl lodowatego, sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 300 mM.
   Uwaga: Gęstość komórek w tym momencie powinna wynosić około 1 x 10¹¹ jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml).
8. Schładzamy ogniwa na lodzie przez 30 minut, po czym są gotowe do elektroporacji.
9. Dodać 1 μl roztworu plazmidu ¹² o stężeniu 0,2 μg/μl pCdrA::gfp^C do 40 μl elektrokompetentnych komórek P. aeruginosa przygotowanych powyżej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, która została wstępnie schłodzona na lodzie. Wymieszać zawiesinę i przenieść do wstępnie schłodzonej kuwety elektrodowej o średnicy 2 mm, do elektroporacji.
   Uwaga: pCdrA::gfp^C: pUCP22Not-PcdrA-RBSII-gfp(Mut3)-T_{0-T 1}, Amp^r Gm^r, który daje fluorescencyjny odczyt wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP w szczepach P. aeruginosa, został opracowany i zatwierdzony przez Rybtke i wsp.^{Rozdział 12}.
10. Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą bibuły i umieść kuwetę w komorze na próbki elektroporatora. Impuls o napięciu 2,5 kV, pojemności 25 μF i rezystancji 200 Ω.
11. Wyjmij kuwetę i dodaj 1 ml pożywki LB. Następnie przenieść komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
12. Rozprowadzić 10 μl, 50 μl i 100 μl podwielokrotności kultury na sterylnych płytkach LB-agarowych z dodatkiem ampicyliny (w stężeniu 100 μg/ml) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
13. Potwierdzić ekspresję GFP (wzbudzenie przy 485 nm, emisja przy 520 nm) poprzez badanie płytki pod mikroskopem fluorescencyjnym ze standardowym kanałem GFP i wybrać pojedynczą kolonię do zaszczepienia 5 ml LB. Inkubować przez noc, jak opisano w kroku 1.1. Zmieszać 0,5 ml nocnej hodowli z 0,5 ml 50% glicerolu w 2 ml zakręcanej probówce i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie kultury starterowej do inokulacji

1. Dwa dni przed badaniem przesiewowym należy rozprowadzić szczep P. aeruginosa (zawierający plazmid ^C pCdrA::gfp) z zapasu w temperaturze -80 °C na płytce LB-agar (uzupełnionej ampicyliną w stężeniu 100 μg/ml), delikatnie rozprowadzając bakterie na płytce za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Wieczorem przed badaniem przesiewowym należy zaszczepić pojedynczą kolonię P. aeruginosa z płytki w 10 ml pożywki LB (uzupełnionej ampicyliną o stężeniu 100 μg/ml) w probówce i inkubować hodowlę wstępną przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. W dniu badania przesiewowego przygotuj subkulturę z nocnej hodowli wstępnej, rozcieńczając ją najpierw świeżym podłożem LB do OD₆₀₀ 1,0, a następnie dalej rozcieńczając 5% LB do OD₆₀₀ 0,04 (stosunek 1:25).
   Uwaga: Całkowita objętość zaszczepionej pożywki zależy od liczby płytek, które mają być badane. 5% LB wytwarza się przez rozcieńczenie 100% LB solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do wymaganego stężenia. Co ważne, pożywka (5% LB) umożliwia konstytutywną aktywację pCdrA::gfp^C u P. aeruginosa.
4. Dodaj sterylne mieszadło magnetyczne do pojemnika i mieszaj kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, pozwalając bakteriom zaaklimatyzować się w pożywce przed dozowaniem do płytek 384-dołkowych.

3. Inokulacja i inkubacja 384-dołkowych płytek zawierających małe cząsteczki

Uwaga: Sterylność i dobre techniki aseptyczne są najważniejsze dla następujących kroków.

1. Aby przygotować kontrolę pozytywną (100% inhibicja), dodać 20 μl siarczanu tobramycyny (25 mg/ml) do 10 ml (odpowiednio na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Odpipetować 40 μl kultury kontroli dodatniej do studzienek A23 - P23 (ryc. 2).
2. Aby przygotować kontrolę ujemną (inhibicja 0%), dodać 30 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 10 ml (odpowiednio na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Odpipetować 40 μl kultury kontroli ujemnej do studzienek A24 - P24 (ryc. 2).
3. Dla każdej z płytek oznaczonych małymi cząsteczkami, zaszczepić objętość 40 μl rozcieńczonych kultur nocnych (opisanych w kroku 2.3) do studzienek A1 - P22 (Rysunek 2).
   Uwaga: Można to osiągnąć za pomocą robota do obsługi cieczy. Ze względu na niejednorodne właściwości kultur bakteryjnych ważne jest utrzymanie ciągłego i umiarkowanego mieszania, aby bakterie były równomiernie rozmieszczone w pożywce podczas dozowania. Aby to zrobić, podczas dozowania należy mieszać magnetycznie zaaklimatyzowaną kulturę z kroku 2.4.
4. Uszczelnić płytki pokrywą przepuszczającą powietrze i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Uszczelnienie przepuszczające powietrze ma kluczowe znaczenie dla utrzymania niezmiennych warunków we wszystkich 384 studzienkach i uniknięcia potencjalnego rozwoju gradientów tlenu na płycie.

4. Pomiar wzrostu (OD₆₀₀) i wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP (GFP)

1. Około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym należy podgrzać czytnik płytek do temperatury 37 °C, aby uniknąć kondensacji.
2. Przed czytaniem delikatnie zdejmij przepuszczającą powietrze uszczelkę pokrywy. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy.
3. Przed pomiarem fluorescencji należy dokonać automatycznej regulacji wzmocnienia i ogniskowej w oparciu o studzienkę A24 (kontrola ujemna) i ustawić docelową wartość wzmocnienia na 75% (ryc. 2).
   1. W oprogramowaniu sterującym czytnikiem płytek kliknij na rozpocznij pomiar i kliknij na zakładkę ''Regulacja ostrości i wzmocnienia/ID płyty''.
   2. Wybierz ''Regulacja ostrości'' i ''Kanał A'' po prawej stronie okna.
   3. Wybierz ''Regulacja wzmocnienia'' i ''Dobrze wybrane'', a następnie wpisz ''75'' jako ''Wartość docelowa''. Na koniec wybierz dobrze A24 w układzie tabliczek, zanim klikniesz na ''Rozpocznij korektę''. Po dokonaniu regulacji kliknij na ''Rozpocznij pomiar''.
   4. Zmierzyć fluorescencję z reportera GFP przy maksimum wzbudzenia/emisji 485/520 nm przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy.
4. Zbierz dane ze wszystkich badanych płyt. Uwaga: Odczyty danych są automatycznie zapisywane domyślnie przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek.
   1. View odczyty, klikając ikonę "Mars" w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.
   2. Odzyskaj dane, "klikając dwukrotnie" na interesujący Cię numer rejestracyjny, aby uzyskać dostęp do danych do analizy.

5. Analiza danych

1. Oceń jednorodność i odtwarzalność testu za pomocą solidnej analizy z', która jest najczęstszym wskaźnikiem jakości zgłaszanym w przypadku badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Obliczanie solidnej z' za pomocą wzoru:
   
   Gdzie MAD (mediana odchylenia bezwzględnego) jest oszacowaniem odchylenia standardowego, p jest kontrolą dodatnią (100% inhibicji), a n jest kontrolą ujemną (0% inhibicji) zarówno dla wartości OD₆₀₀, jak i GFP. Uwaga: Test o solidnej wartości z' (obliczonej zarówno dla surowych danych OD₆₀₀, jak i GFP) większej lub równej 0,5 jest uważany za doskonały test.
2. Obliczać% zahamowania wzrostu za pomocą wzoru:
   
   Gdzie Xi_OD600 jest iterowaną wartością OD₆₀₀ dla każdej studzienki próbki. % Hamowanie_OD600 > 0, inhibitor wzrostu; % Hamowanie_OD600 < 0, stymulator wzrostu.
3. Ocenić % zahamowania wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP za pomocą wzoru (zmiana dowolnych jednostek intensywności fluorescencji jest korygowana o zmianę gęstości komórek):
   
   Gdzie_{Xi GFP} jest iterowaną wartością GFP dla każdej studzienki próbki. % Hamowanie_GFP > 0, inhibitor c-di-GMP; % Hamowanie_GFP < 0, promotor c-di-GMP.
4. Ustaw próg wykrywania trafień na poziomie 3 MAD od mediany (mediana ±3 MAD), obliczony na podstawie odczytów studzienek próbki z każdej płytki, przy założeniu normalnego rozkładu punktów danych. Uwaga: W razie potrzeby można jednak wybrać granicę inhibicji na poziomie ±50%, aby uzyskać bardziej powtarzalne i dokładne testy odpowiedzi na dawkę.

Results

Opisane tutaj podejście pozwala pojedynczemu badaczowi na efektywne i skuteczne przebadanie średnio 3 500 związków w ciągu 48 godzin. Przegląd protokołu wysokoprzepustowych badań przesiewowych przedstawiono na rysunku 1 w postaci schematu blokowego. Na potrzeby niniejszego artykułu przeprowadziliśmy badania przesiewowe biblioteki związków zgodnych z zasadą pięciu pod kątem potencjalnych związków modulujących c-di-GMP przy końcowym stężeniu 600 μM. Istnieje jednak wiele dostępnych na rynku zestawów związków podobnych do leków i niepodobnych, które można zastosować w teście. Zestawy te mogą być związkami skoncentrowanymi na bakteriach lub losowo połączonymi związkami, ale każda biblioteka miałaby przypisane właściwości fizykochemiczne i cechy, takie jak zestaw ekranowany tutaj, który miał biegunowe grupy funkcyjne i wiele centrów stereogenicznych. W tym protokole bakterie są inokulowane na płytce wraz ze związkami, pozytywną kontrolą antybiotyku i kontrolą nośnika DMSO, zgodnie z układem pokazanym na rysunku 2. Rysunek 3 przedstawia wyniki pierwotnego badania przesiewowego na przykładzie pojedynczej płytki bibliotecznej. Reprezentatywne surowe dane OD₆₀₀ i GFP przedstawiono odpowiednio na rysunkach 3A i 3B. Do wartości studni zastosowano mapę cieplną z gradientem kolorów, w której kolory gorące (czerwony) do chłodnych (zielony) wskazują niskie lub wysokie wartości OD₆₀₀/GFP. Mapy cieplne zostały wygenerowane w arkuszu kalkulacyjnym poprzez zastosowanie formatowania warunkowego w skali 3 kolorów od najniższego odczytu OD₆₀₀/GFP do najwyższego odczytu OD₆₀₀/GFP. Niskie wartości OD₆₀₀ i GFP w odniesieniu do kontroli ujemnej DMSO odpowiadają odpowiednio zahamowaniu wzrostu i poziomom c-di-GMP, podczas gdy wysokie wartości w stosunku do kontroli negatywnej DMSO odpowiadają odpowiednio wzrostowi i poziomom c-di-GMP. Wartości odporności z' dla OD₆₀₀ i GFP oblicza się zgodnie ze wzorem podanym w protokole (5.1). Ponieważ oba są powyżej 0,5 (odpowiednio 0,694 i 0,761), jakość testu uznano za solidną, a dane poddano dalszej analizie. % zahamowania wzrostu (OD₆₀₀) i wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP (GFP) oblicza się za pomocą wzorów zawartych w protokole (5.2, 5.3). Reprezentatywne dane przedstawiono odpowiednio na rysunkach 4A i 4B. Do wartości dołka zastosowano mapę cieplną z gradientem kolorów, w której kolory od gorącego (czerwony) do chłodnego (zielonego) wskazują na niski lub wysoki % hamowania. Wykres punktowy % inhibicji _(OD600/GFP) z poszczególnych studzienek w oparciu o ekran pierwotny przedstawiono na rysunkach 5A i 5B odpowiednio dla danych OD₆₀₀ i GFP. Do wykrywania trafień wybierany jest punkt odcięcia ±50% (oznaczony liniami przerywanymi). Potencjalne trafienia oparte na tym odcięciu są oznaczone czerwonymi kropkami. Z testu można wyróżnić dwa rodzaje związków będących przedmiotem zainteresowania. Trafienia zidentyfikowane na rysunku 5A są związkami hamującymi wzrost bakterii, podczas gdy trafienia zidentyfikowane na rysunku 5B są związkami, które potencjalnie posiadają zdolność do modulowania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP. Dwa związki zostały zidentyfikowane jako reprezentatywne trafienia dla tego testu. Są to związek A, potencjalny inhibitor wzrostu i związek B, potencjalny inhibitor c-di-GMP. Związek A odpowiada studzience F8 na rysunkach 3 i 4 i miał 72,5% zahamowanie wzrostu. Spodziewano się odpowiedniego zahamowania cyklicznych poziomów di-GMP. Związek B odpowiada studzience K3 na rysunkach 3 i 4 i miał 61% hamowanie cyklicznych poziomów di-GMP bez zmian we wzroście. Wybrane związki trafione poddano dalszym testom za pomocą 10-punktowego testu dawka-odpowiedź z najwyższym stężeniem 2 mM i serią dwukrotnych rozcieńczeń. Wartości IC₅₀ oblicza się na podstawie krzywych dawka-odpowiedź (ryc. 6A i B).

Rysunek 1. Przegląd: Wysokoprzepustowa konfiguracja do badań przesiewowych małych cząsteczek pod kątem ich potencjału do modulowania komórkowych poziomów c-di-GMP u P. aeruginosa. Ten przegląd przedstawia krok po kroku reprezentację protokołu używanego w tym teście. Kolonia bakteryjna P. aeruginosa jest hodowana przez noc w kulturze starterowej LB. Za pomocą dozownika odczynników komórki są inokulowane do 384-dołkowych płytek zawierających wybrane związki. Płytki inkubuje się przez 6 godzin, po czym mierzy się wartości OD₆₀₀ i GFP. Za pomocą tych odczytów można zidentyfikować związki, które wpływają na poziomy komórkowe c-di-GMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Mapa płytki z 384 dołkami używana do testu przesiewowego małych cząsteczek. Związki z biblioteki (jasnoniebieskie) są rozdzielane do studzienek A1 - P22. "Kontrolę pozytywną" (kolor czerwony) składającą się z końcowego stężenia 50 μg/ml siarczanu tobramycyny dodaje się do studzienek A23 - P23, a "kontrolę ujemną" (zieloną) zawierającą końcowe stężenie 1% DMSO dodaje się do studzienek A24 - P24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki dla jednej 384-dołkowej płytki przesiewowej. Reprezentatywne dane surowe dotyczą OD₆₀₀ (A) i GFP (B). Do wartości studni zastosowano gradientową mapę cieplną kolorów z gorącymi (czerwonymi: OD₆₀₀ = 0,65 lub GFP = 250 000) i chłodnymi (zielonymi: OD₆₀₀ = 0,10 lub GFP = 40 000) kolorami wskazującymi niskie lub wysokie wartości. Studnie, które mają niższe odczyty OD₆₀₀ / GFP w stosunku do kontroli negatywnej DMSO, będą miały tendencję do bycia na czerwono, podczas gdy studnie, które mają wyższe odczyty OD₆₀₀ / GFP w stosunku do kontroli DMSO, będą miały tendencję do bycia na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki dla procentowej inhibicji obliczonej dla płytki 384-dołkowej. Analizowane dane dotyczące % inhibicji są reprezentowane zarówno dla odczytów OD₆₀₀ (A), jak i GFP (B). Do wartości studzienek zastosowano kolorową gradientową mapę cieplną z gorącymi (czerwonymi: OD₆₀₀ = -150% lub GFP = -20%) i chłodnymi (zielonymi: OD₆₀₀ = 100% lub GFP = 100%) kolorami wskazującymi niskie do wysokich wartości inhibicji. Małe cząsteczki, które potencjalnie hamują wzrost i wewnątrzkomórkowe c-di-GMP, będą miały tendencję do bycia na zielono, podczas gdy małe cząsteczki, które potencjalnie promują wzrost i wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP, będą miały tendencję do bycia na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Reprezentatywne wykresy rozrzutu dla % inhibicji _(OD600/GFP) uzyskane z każdej badanej małej cząsteczki. Każda mała cząsteczka jest reprezentowana przez kropkę i pokazany jest % rozkład inhibicji dla każdego z odczytów OD₆₀₀ (A) i GFP (B). Do identyfikacji trafień wybierany jest punkt odcięcia ±50%. Potencjalne trafienia są wyróżnione na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Reprezentatywne wyniki testu dawka-odpowiedź. Dwa związki (potencjalny inhibitor wzrostu A i potencjalny inhibitor c-di-GMP B) zidentyfikowane na podstawie poprzednich badań przesiewowych są dalej testowane w 10-punktowym teście dawka-odpowiedź z najwyższym stężeniem 2 mM i serią dwukrotnych rozcieńczeń. Dopasowanie czteroparametrowej funkcji logistycznej do danych dało wartości IC₅₀ wynoszące odpowiednio 158 μM i 193 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Oczywiste jest, że aby poprawić leczenie zakażeń bakteryjnych, konieczne jest lepsze zrozumienie zachowania bakterii na molekularnym poziomie regulacyjnym. Opisana tutaj procedura będzie korzystna dla mikrobiologów, biochemików i klinicystów, którzy chcą odkryć małe cząsteczki, które mogą manipulować lub zakłócać stężenie komórkowe c-di-GMP w bakteriach. Metoda wykorzystuje niedawno opracowany bioreporter GFP do monitorowania komórkowych poziomów c-di-GMP w P. aeruginosa¹². Ten bioreporter został zwalidowany i wykazano, co ważne, że nie wpływa na wzrost używanego szczepu, gdy jest hodowany w 5% LB w PBS. Zastosowanie badania przesiewowego całej komórki do identyfikacji małych cząsteczek, które zmieniają poziomy c-di-GMP in vivo , pozwala przezwyciężyć główne trudności związane z odkrywaniem leków na podstawie celów w zakresie przenikania cząsteczek przez błony bakteryjne, w szczególności przez błony bakterii Gram-ujemnych. Co ważne, test wydaje się bardzo solidny, ponieważ we wszystkich dotychczasowych badaniach przesiewowych zaobserwowano solidną wartość z' stale powyżej 0,5. Badania przesiewowe przy użyciu tego protokołu ujawnią szereg małych cząsteczek, które hamują i/lub promują wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP u P. aeruginosa. Co więcej, test ten ma również potencjał do identyfikacji związków bakteriobójczych lub bakteriostatycznych powodujących zmniejszenie odczytu OD₆₀₀ .

Chociaż nie zostało to omówione w sekcji dotyczącej protokołu, istnieje kilka ważnych kwestii związanych z przygotowaniem eksperymentu. Należy pamiętać, że bioreporter GFP jest oparty na plazmidzie. Chociaż wiadomo, że plazmid reporterowy jest bardzo stabilny u P. aeruginosa, może zostać utracony po ciągłym ponownym posiewaniu, stąd potrzeba użycia świeżo posianych szczepów z glicerolu o temperaturze -80 °C, a sprawdzenie ekspresji fluorescencji ma kluczowe znaczenie. Bardzo cenne jest również utrzymanie jednolitych warunków wzrostu na całym ekranie, ponieważ wszelkie wahania tych warunków mogą mieć efekt domina na ekranie. Obejmowałoby to upewnienie się, że pożywki i antybiotyki są wstępnie przygotowane w partiach i stosowane przez cały czas trwania badania. Kultury bakterii, które nie rosną w sposób jednolity (na podstawie odczytów OD₆₀₀ ) są częstym problemem w przypadku większości tego rodzaju przesiewaczy o wysokiej przepustowości. Może to być spowodowane efektami krawędzi lub dozowaniem niejednorodnej kultury bakteryjnej do płytek. W pierwszym przypadku niezbędne jest upewnienie się, że podczas inkubacji używana jest uszczelka przepuszczająca gaz. Natomiast w przypadku tych ostatnich zaleca się zalewanie rurki do obsługi cieczy objętością kultury co najmniej trzykrotnie większą niż objętość martwa samego przewodu. Bardzo ważne jest, aby mieszadło magnetyczne działało na minimalnej prędkości podczas dozowania. Podczas gdy monitorowanie i przechowywanie płytek 384-dołkowych w celu stałego wzrostu w trakcie eksperymentów jest najważniejsze, sytuacją, której należy unikać, jest układanie płytek w stosy podczas inkubacji, ponieważ może to powodować niepożądane gradienty tlenu prowadzące do przekrzywienia wzorca wzrostu. Ważne jest również, aby upewnić się, że nośnik DMSO używany jako kontrola ujemna nie wpływa negatywnie na wzrost szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. Wielu z tych problemów związanych ze wzrostem można uniknąć, wykonując próbne badanie przesiewowe z interesującym szczepem bakteryjnym przed badaniem przesiewowym. Interpretacja danych również zasługuje na rozważenie, biorąc pod uwagę, że wyniki hamowania c-di-GMP są obliczane na podstawie zmiany dowolnych jednostek intensywności fluorescencji, które należy skorygować o zmianę gęstości komórek. Mając to na uwadze, należy również rozważyć różne wzory matematyczne do oceny danych wyjściowych z tych eksperymentów. Na przykład związek może wydawać się inhibitorem c-di-GMP, ale w rzeczywistości być inhibitorem wzrostu lub odwrotnie, co wymaga ostrożnej interpretacji zidentyfikowanych trafień.

Istnieje kilka wad i ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania i działania tego wysokowydajnego ekranu komórkowego. Na przykład, bioreporter działa w oparciu o pośredni pomiar komórkowych poziomów c-di-GMP za pomocą sondy fluorescencyjnej, na której właściwości detekcyjne mogą potencjalnie wpływać małe cząsteczki użyte w badaniu przesiewowym. Istotną kwestią jest fakt, że test komórkowy nie dostarcza żadnych informacji na temat mechanizmu stojącego za zmianami poziomów wewnątrzkomórkowego c-di-GMP. Dlatego ważne obserwacje z eksperymentów muszą zostać potwierdzone przy użyciu podejścia opartego na wysokosprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, która jest uważana za "złoty standard" metody pomiaru wewnątrzkomórkowych fluktuacji c-di-GMP u bakterii. Co więcej, nasza procedura może dostarczyć jedynie informacji na temat zachowania bakterii hodowanych in vitro, ponieważ komórki bakteryjne hodowane w kontekście gospodarza (in vivo) szybko modyfikują swoje działania pod wpływem tego środowiska. Co więcej, proces korzystania z bioreportera GFP oznacza, że ekran nie bierze pod uwagę stanu fizjologicznego komórek bakteryjnych. Protokół można jednak dostosować do mikroskopowego monitorowania poszczególnych studni w trakcie badania przesiewowego.

Nawet biorąc pod uwagę te rozważania i ograniczenia, ten wysokoprzepustowy test jest nadal solidnym badaniem przesiewowym dla małych cząsteczek zdolnych do zakłócania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP. Ponieważ wiele gatunków drobnoustrojów, w tym wiele patogenów bakteryjnych, zostało przebadanych w celu scharakteryzowania modulacji wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP, nasz protokół może być zastosowany do różnych gatunków bakterii i rozszerzony o badanie bardziej złożonych wielogatunkowych modeli bakterii. Test można łatwo zoptymalizować pod kątem innych gatunków bakterii, zmieniając stosowane warunki wzrostu, lub można go dostosować do odczytu innych wyników przy użyciu różnych bioreporterów. W zależności od fazy wzrostu będącej przedmiotem zainteresowania można zastosować różne czasy inkubacji. Jednak przy zwiększaniu skali lub zwiększaniu przepustowości należy pamiętać, że bakterie będą nadal rosły podczas przygotowywania płytek i pomiarów odczytu. Dlatego zaleca się przesiewanie maksymalnie 15 płyt jednocześnie przy użyciu tego protokołu. Co więcej, używanie płytek z więcej niż 384 dołkami może nie pozwolić na równomierny wzrost, co wymaga dalszej optymalizacji. Przy zmniejszaniu liczby płytek bardziej odpowiednie może być ręczne zaszczepianie za pomocą pipety elektronicznej zamiast robota do obsługi płynów. Oczywiste jest, że protokół ten może być wykorzystany do badania małych cząsteczek, które rozpraszają biofilmy, biorąc pod uwagę, że związki anty-biofilmu zakłócają sygnalizację c-di-GMP. Protokół może również zostać opracowany ponownie, aby zrozumieć różne aspekty fizjologii bakterii. Biorąc pod uwagę, że sygnalizacja c-di-GMP jest powszechna u większości bakterii, badając fizjologię tych organizmów za pomocą tego protokołu, możemy zidentyfikować różne bodźce chemiczne, aby określić, czy ich mechanizmy działania wymagają sygnalizacji c-di-GMP.

Podsumowując, solidność i wszechstronność podejścia przedstawionego w tym protokole pomoże w identyfikacji chemicznych modulatorów sygnalizacji c-di-GMP w wielu systemach biologicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rosół lizogeniczny (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Rosół lizogeniczny z agarem (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicylina sodowa	Sigma Aldrich	A0166-25G
Glicerol	Sigma Aldrich	G5516-1L
Buforowany fosforanem Sól fizjologiczna, pH 7,4	Technologie życiowe	10010-056
Siarczan tobramycyny	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Sulftlenek dimetylu (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Spektrofotometr UV-Vis Genesys 10S	Thermoscientific	840-208100
Kuweta elektroporatora 2 mm	Bio-Rad	1652092
Elektroporator BioRad GenePulser XCell	Bio-Rad	1652662
Stereomikroskop fluorescencyjny Leica	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND mieszadło magnetyczne, PTFE, cylindryczne z pierścieniem obrotowym (przed użyciem sterylizować w autoklawie)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-dołkowe, białościenne, przezroczyste płytki	Greiner	781098
Dozownik odczynników Multidrop Combi	Thermo Scientific	5840300
Rurka Multidrop Combi	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-kanałowa pipeta elektroniczna	Integra Biosciences	4642
100 ml sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki	Fisher Scientific	12399175
Membrany przepuszczające powietrze AeraSeal	Sigma Aldrich
Czytnik płytek Pherastar (Wersja oprogramowania: 4.00 R4, Wersja oprogramowania: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS