Ten protokół opisuje szybką i szeroko stosowaną metodę bezstronnego sekwencjonowania RNA próbek wirusa z ludzkich izolatów klinicznych.
Artykuł metodologiczny
Bezstronne, głębokie sekwencjonowanie wirusów RNA z próbek klinicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tutaj przedstawiamy protokół sekwencjonowania RNA nowej generacji, który umożliwia składanie de novo i wywoływanie wariantów wewnątrz gospodarza genomów wirusowych pobranych ze źródeł klinicznych i biologicznych. Metoda jest bezstronna i uniwersalna; wykorzystuje losowe startery do syntezy cDNA i nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat zawartości sekwencji wirusa. Przed budową biblioteki selektywne trawienie oparte na RNazie H jest stosowane w celu wyczerpania niechcianego RNA - w tym nośnika poli(rA) i rybosomalnego RNA - z próbki wirusowego RNA. Selektywne zubożenie poprawia zarówno jakość danych, jak i liczbę unikalnych odczytów w bibliotekach sekwencjonowania wirusowego RNA. Co więcej, w protokole zastosowano etap "tagmentacji" oparty na transpozazie, ponieważ skraca to całkowity czas budowy biblioteki. Protokół umożliwił szybkie, głębokie sekwencjonowanie ponad 600 próbek wirusów Lassa i Ebola – w tym pobranych zarówno z krwi, jak i izolatów tkanek – i ma szerokie zastosowanie w innych badaniach genomiki drobnoustrojów.
Wprowadzenie
Sekwencjonowanie następnej generacji wirusów pochodzących ze źródeł klinicznych może dostarczyć informacji o transmisji i epidemiologii infekcji, a także pomóc w opracowywaniu nowych metod diagnostycznych, szczepionek i terapii. Synteza cDNA z użyciem randomowych starterów umożliwiła wykrywanie i składanie genomów wirusów divergentnych, współinfekujących, a nawet nowych1,2. Podobnie jak w przypadku innych metod bezstronnych, niepożądane zanieczyszczenia zajmują wiele odczytów sekwencjonowania i negatywnie wpływają na wyniki. RNA gospodarza oraz RNA nośnikowe poly(rA) to zanieczyszczenia występujące w wielu istniejących kolekcjach próbek wirusowych.
Protokół opisuje wydajny i kosztowo efektywny sposób głębokiego sekwencjonowania genomów wirusów RNA w oparciu o nieobciążone sekwencjonowanie całkowitego RNA (total RNA-seq). Metoda wykorzystuje etap selektywnego usuwania za pomocą RNazy H3 w celu wyeliminowania niepożądanego rybosomalnego i transporterowego RNA gospodarza. Selektywne usuwanie wzbogaca zawartość wirusową (Rysunek 1) i poprawia ogólną jakość danych sekwencjonowania (Rysunek 2) z próbek klinicznych. Ponadto w protokole zastosowano tagmentację, która znacząco skraca czas przygotowania biblioteki. Metody te zostały wykorzystane do szybkiego generowania dużych zbiorów danych genomów wirusów Ebola i Lassa2,4,5 i mogą być stosowane do badania szerokiego zakresu wirusów RNA. Wreszcie, podejście to nie ogranicza się do próbek ludzkich; użyteczność selektywnego usuwania wykazano na próbkach tkanek pobranych od gryzoni zakażonych wirusem Lassa oraz w modelach chorób u naczelnych5,6.
Rycina 1. Całkowita zawartość RNA odzwierciedla wzbogacenie zawartości wirusa Lassa przy użyciu selektywnego usuwania. Początkowa zawartość ogólna (ilość wprowadzonego RNA) oraz wzbogacenie unikalnych odczytów wirusa Lassa (LASV) (zawartość biblioteki) po usunięciu rRNA z dziewięciu różnych izolatów klinicznych. Rysunek ten został zmodyfikowany z6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.
Rycina 2. Wyższa jakość sekwencjonowania po usunięciu RNA nośniczego. Mediany jakości zasad w poszczególnych cyklach sekwencjonowania dla bibliotek wirusa Lassa zanieczyszczonych poly(rA) (czerwony) oraz kontrolnych (brak nośnika w bibliotece, czarny) z raportu kontroli jakości (QC) 13Zarówno odczyt 1, jak i odczyt 2 z odczytów par końcowych zostają połączone w pliku BAM biblioteki, a wyniki jakości są wyświetlane dla każdej zasady. Rysunek ten został zmodyfikowany z6. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Protokół viral RNA-seq szczegółowo opisuje konstrukcję bibliotek bezpośrednio z wyizolowanego RNA pobranego z próbek klinicznych i biologicznych. Aby zapewnić bezpieczeństwo osobiste, wszystkie próbki surowicy, osocza i tkanek zawierające wirusy powinny zostać inaktywowane w odpowiednich buforach przed ekstrakcją RNA. W niektórych zestawach do inaktywacji i ekstrakcji dołączony jest nośnik poly(rA) RNA; zostanie on usunięty podczas początkowego etapu selektywnego usuwania za pomocą RNazy H. Przy całkowitym odzysku oczekiwane stężenie RNA nośnikowego wynosi 10 ng/µl. W protokole do etapu usuwania stosuje się 10 ng/µl oligo dT RNA (1,1x stężenia nośnika). Jeśli w próbce nie ma nośnika poly(rA), przed etapem usuwania nie należy dodawać oligo(dT).
Poniższy protokół został opracowany dla 24 reakcji w formacie płytek PCR (objętość do 250 µl). Wcześniejsza wersja tego protokołu została opisana przez Matrangę et al.6.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Pacjenci z gorączką Lassa zostali zakwalifikowani do niniejszego badania zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komisje ds. badań z udziałem ludzi na Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Kenema Government Hospital (KGH), Ministerstwie Zdrowia Stanu Oyo w Ibadan w Nigerii oraz Ministerstwie Zdrowia Sierra Leone. Wszyscy pacjenci otrzymali analogiczny standard opieki i mieli możliwość zastosowania leku Ribavirin, niezależnie od decyzji o udziale w badaniu. W przypadku pacjentów z gorączką Lassa (LF) leczenie rybawiryną odbywało się zgodnie z aktualnie zalecanymi wytycznymi i było zazwyczaj wdrażane tak szybko, jak tylko silnie podejrzewano LF.
Ze względu na gwałtowną epidemię choroby wywołanej wirusem Ebola (EVD), nie było możliwe uzyskanie zgód od pacjentów zgodnie z naszymi standardowymi protokołami. Zamiast tego, wykorzystanie nadmiarowych próbek klinicznych pobranych od pacjentów z EVD zostało ocenione i zatwierdzone przez komisje etyczne (Institutional Review Boards) w Sierra Leone oraz na Uniwersytecie Harvarda. Biuro Komisji Etyki i Przeglądu Naukowego Sierra Leone, Ministerstwo Zdrowia i Sanitacji Sierra Leone oraz Komitet ds. Wykorzystania Ludzkich Obiektów Badawczych Uniwersytetu Harvarda udzieliły zwolnienia z obowiązku uzyskania zgody na sekwencjonowanie i publiczne udostępnienie sekwencji wirusowych uzyskanych z próbek pobranych od pacjentów i osób z nimi miałycych kontakt podczas epidemii Ebola w Sierra Leone. Organy te zezwoliły również na wykorzystanie danych klinicznych i epidemiologicznych dla zanonimizowanych próbek pobranych od wszystkich pacjentów z podejrzeniem EVD, którzy otrzymywali opiekę podczas działań w odpowiedzi na epidemię. Ministerstwo Zdrowia i Sanitacji Sierra Leone zatwierdziło również transport niezakaźnych próbek niebiologicznych z Sierra Leone do Broad Institute i Uniwersytetu Harvarda w celu przeprowadzenia badań genomicznych próbek z epidemii.
1. Traktowanie RNA z próbki nukleazą DNazą (do 5 µl wyekstrahowanego całkowitego RNA, ~4 godz.)
- Przygotować reakcję z DNazą w 96-dołkowej płytce PCR na lodzie w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zgodnie z opisem w Tabeli 1, Krok 1.1 (objętość całkowita, 70 µl/dołek). Uwaga: Można przygotować mieszaninę główną (master mix).
- Wymieszać delikatnie i dokładnie za pomocą wortexa, a następnie odwirować przy 280 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
- Oczyścić za pomocą kulek RNA do odwracalnej immobilizacji w fazie stałej (SPRI).
- Dostosować temperaturę kulek RNA do RT przez 30 min.
- Delikatnie wstrząsnąć butelką z kulkami RNA, aby resuspenderć ewentualne osadzone cząstki magnetyczne. Dodać 1,8x objętości (126 µl) kulek RNA do RNA poddanego działaniu DNazy (70 µl), wymieszać pipetą 10 razy i inkubować przez 5 min w RT (objętość całkowita w dołku, 196 µl).
- Umieścić mieszaninę na stacji magnetycznej. Odczekać do momentu, aż roztwór stanie się klarowny (5 – 10 min).
- Usunąć klarowny roztwór za pomocą pipety, pozostawiając próbkę na stacji, i odrzucić go. Pozostawiając kulki na stacji, przemyć je, pokrywając osad 70% etanolem i inkubując przez 1 min. Usunąć etanol pipetą i odrzucić. Powtórzyć czynność, aby przeprowadzić łącznie dwa przemycia.
Uwaga: Użycie dokładnie 70% świeżo przygotowanego etanolu jest krytyczne, ponieważ wyższe stężenie spowoduje nieefektywne przemywanie mniejszych cząsteczek, natomiast stężenie <70% etanolu może doprowadzić do utraty próbki7. - Pozostawić płytkę na stacji i pozostawić otwartą do wysuszenia na powietrzu. Uwaga: Należy dopilnować, aby kulki całkowicie wyschły, aż zaczną pękać.
- Dodać do płytki 5 µl wody wolnej od nukleaz w celu elucji RNA. Zdjąć płytkę ze stacji, aby dokładnie wymieszać kulki z wodą za pomocą pipetowania. Uwaga: Alternatywnie można użyć mniejszej ilości wody (≤ 10 µl) w celu zagęszczenia całkowitego RNA.
- Umieścić płytkę z powrotem na stacji. Odczekać do momentu, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie przenieść go pipetą do nowej probówki z nakrętką do długoterminowego przechowywania (-80 °C). Przenieść 5 µl RNA do nowej 96-dołkowej płytki PCR w celu przeprowadzenia procesu deplekcji (krok 2.4).
- Opcjonalnie: Odstawić i rozcieńczyć 1 µl w 19 µl wody (1:20) do qRT-PCR rRNA (np. 18S, 28S rRNA) (Tabela 2) oraz markerów wirusowych5.
2. Selektywne usuwanie rybosomalnego i transporterowego RNA z próbki RNA wirusa (~4 godz.)
- Przygotować 5x bufor do hybrydyzacji, 10x bufor do reakcji z RNazą H oraz wodę wolną od nukleaz z liniowym akrylamidem jako nośnikiem, zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Przygotować reakcję hybrydyzacji, łącząc RNA z oligonukleotydami do usuwania rRNA (Tabela 3) oraz oligo(dT) na lodzie w 96-dołkowej płytce PCR, zgodnie z opisem w Tabeli 1.
Uwaga: Można przygotować mieszaninę główną (master mix). W celu monitorowania procesu sekwencjonowania wirusowego oraz potencjalnej kontaminacji krzyżowej odczytów indeksów można dodać 50 femtogramów (fg) unikalnego syntetycznego RNA (ERCCs8).- Wymieszać delikatnie wortexie, a następnie odwirować przy 280 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min.
Inkubować w 95 °C przez 2 min, z powolnym obniżaniem temperatury do 45 °C w tempie -0,1 °C na sekundę. Wstrzymać pracę termocyklera przy 45 °C.
- Wymieszać delikatnie wortexie, a następnie odwirować przy 280 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min.
- Przygotować mieszaninę do reakcji z RNazą H na lodzie, zgodnie z opisem w Tabeli 1, a następnie wstępnie podgrzać w 45 °C przez 2 min. Uwaga: Można przygotować mieszaninę główną (master mix).
- Dodać podgrzaną mieszaninę RNazy H do reakcji hybrydyzacji w płytce, utrzymując płytkę w termocyklerze w temperaturze 45 °C.
- Dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując 6–8 razy. Inkubować w 45 °C przez kolejne 30 min. Umieścić na lodzie.
- Przygotować mieszaninę do reakcji z DNazą na lodzie, zgodnie z opisem w Tabeli 1. Uwaga: Można przygotować mieszaninę główną (master mix).
- Dodać do reakcji z RNazą H w płytce, wymieszać delikatnie wortexie, a następnie odwirować przy 280 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min. Inkubować w 37 °C przez 30 min.
- Zatrzymać reakcję DNazy, dodając 5 µl 0,5 M EDTA. Wymieszać delikatnie wortexie, a następnie odwirować przy 280 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min.
- Przeprowadzić oczyszczanie za pomocą kulek do RNA (patrz krok 1.3), stosując objętość kulek 1,8x (144 µl). Eluować w 1 µl wody wolnej od nukleaz. Uwaga: W celu bezpiecznego przechowywania w niskiej temperaturze, próbki z usuniętym rRNA należy przechowywać w -80 °C przez noc (O/N).
3. Synteza cDNA (~6 godz.)
- Wymieszaj RNA pozbawione rRNA/nośnika z randomowymi starterami na lodzie w 96-dołkowej płytce PCR zgodnie z opisem w Tabeli 1, delikatnie i dokładnie wymieszaj na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przy 280 x g w temperaturze RT przez 1 min.
- Podgrzej mieszaninę do 70 °C przez 10 min w termocyklerze. Natychmiast po denaturacji termicznej umieść RNA na lodzie na 1 - 5 min. Nie pozostawiaj RNA (nawet na lodzie) na dłużej niż 5 min przed reakcją syntezy pierwszej nici.
- Przygotuj mieszaninę reakcyjną do syntezy pierwszej nici na lodzie zgodnie z opisem w Tabeli 1.
Uwaga: Można przygotować master-mix.- Dodaj do mieszaniny RNA/randomowych starterów w płytce, delikatnie i dokładnie wymieszaj na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przy 280 x g w temperaturze RT przez 1 min. Inkubuj w temperaturze 22 - 25 °C przez 10 min.
- Inkubuj w temperaturze 55 °C w inkubatorze powietrznym przez 60 min. Umieść płytkę na lodzie, aby przerwać reakcję. Uwaga: Zaleca się stosowanie inkubatora powietrznego w celu zapewnienia stopniowego ogrzewania reakcji syntezy pierwszej nici, podczas którego następuje przyłączanie starterów i rozpoczyna się elongacja pierwszej nici.
- Przygotuj mieszaninę reakcyjną do syntezy drugiej nici na lodzie zgodnie z opisem w Tabeli 1.
Uwaga: Można przygotować master-mix.- Dodaj do reakcji syntezy pierwszej nici w płytce, delikatnie i dokładnie wymieszaj na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przy 280 x g w temperaturze RT przez 1 min. Inkubuj przez 2 godz. w temperaturze 16 °C (utrzymując temperaturę pokrywki na poziomie 25 °C). Nie dopuszczaj do wzrostu temperatury powyżej 16 °C.
- Umieść płytkę na lodzie, a następnie dezaktywuj reakcję, dodając 5 µl 0,5 M EDTA; wymieszaj delikatnie i dokładnie, a następnie odwiruj przy 280 x g w temperaturze RT przez 1 min.
- Oczyść preparat za pomocą kulek do oczyszczania DNA (protokół opisany w kroku 1.3), stosując 1,8-krotność objętości (153 µl) kulek. Eluuj w 9 µl buforu do elucji (EB). Odstaw 1 µl do kwantyfikacji. W kolejnych krokach wykorzystaj 1 ng cDNA. Jeśli stężenie cDNA jest zbyt niskie, aby je wykryć, użyj 4 µl cDNA do tagmentacji (patrz krok 4.1).
- W celu bezpiecznego przechowywania w niskich temperaturach, przechowuj dwuniciowe cDNA w temperaturze 4 °C przez noc (O/N) lub w -20 °C do długotrwałego przechowywania.
4. Przygotowanie biblioteki — konstrukcja biblioteki DNA (~4 godz.)
- Transfer 4 µl cDNA do płytki 96-dołkowej i zachować pozostałe cDNA na wypadek konieczności powtórzenia próby.
- Przygotować reakcję tagmentacji w warunkach ochłodzenia (na lodzie), zgodnie z opisem w Tabela 1.
Uwaga: Można przygotować mieszaninę główną (master-mix). Aby zmniejszyć tło oraz całkowity koszt, całkowitą objętość reakcji tagmentacji zmniejszono z 20 do 10 µlPonieważ cDNA jest czynnikiem ograniczającym, ilość ATM (t. j. ilość transposomu wykorzystanego w reakcji została również zmniejszona w celu ograniczenia liczby miejsc integracji.- Dodaj mieszaninę do tagmentacji do cDNA na płytce, delikatnie i dokładnie wymieszaj w wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przy 280 x g (w temperaturze pokojowej) przez 1 min. Inkubuj w 55 °C przez 5 min, utrzymać w temperaturze 10 °C.
- Gdy już się znajdą w 10 °C, natychmiast dodać 2.5 µl buforu Neutralize Tagment Buffer (NT), aby przerwać reakcję. Wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie, a następnie odwirować z prędkością 280 x g (w temperaturze pokojowej) przez 1 min.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Przygotować reakcję amplifikacji PCR na lodzie, zgodnie z opisem w Tabela 1.
- Delikatnie i dokładnie wymieszać na wibratorze laboratoryjnym, a następnie wirować z prędkością 280 x g w temperaturze pokojowej przez 1 min.
- Przeprowadzić reakcję PCR w termocyklerze zgodnie z warunkami opisanymi w Tabela 1.
Uwaga: w przypadku 1 ng tagmentowanego cDNA sugeruje się przeprowadzenie 12 cykli PCR; jednak w klinicznych próbkach wirusowych ilość cDNA jest często niewykrywalna. W przypadku niskich ilości cDNA (<(1 ng), przeprowadź do 18 cykli PCR, aby przygotować wystarczającą ilość biblioteki do sekwencjonowania.
- Przygotowanie biblioteki — oczyszczanie i łączenie do sekwencjonowania
- Dopełnić próbkę do 50 µl z EB.
- Oczyszczanie za pomocą kulek DNA (protokół opisany w punkcie 1.3) przy użyciu 0,6-krotnej objętości (30 µl) kulek. Eluuj do 15 µl EB.
- Wyznaczenie stężenia biblioteki (Rysunek 3) poprzez przeprowadzenie analizy regionu (od 150 do 1 0 bp) przy użyciu oprogramowania bioanalizatora9z wyłączeniem dimerów starterów (~120 bp) z analizy regionu. Uwaga: Alternatywnie do ilościowego określenia bibliotek można zastosować qPCR 10.
- Połącz biblioteki przy najniższym stężeniu molarnym wynoszącym 1 nM lub więcej. Jeśli stężenie biblioteki jest niższe niż 1 nM, dodaj do puli niewielką objętość tej biblioteki (~1x objętość pozostałych bibliotek), aby przechwycić informacje sekwencyjne z tych bibliotek.
- Oczyścić pulę za pomocą kulek DNA 0,7x zgodnie z powyższym opisem (patrz krok 2). Eluować do 15 µl EB. Uwaga: Objętość kulek zależy od końcowej objętości puli.
- Analiza puli9Wyznaczyć stężenie molowe, przeprowadzając analizę regionu (od 150 do 1 0 bp)9Uwaga: Alternatywnie do ilościowego oznaczenia puli biblioteki można zastosować qPCR. 10.
- Załaduj sekwenator przy stężeniu biblioteki 10 pM w celu wygenerowania odczytów parzystych (paired-end) o długości 101 bp z podwójnymi odczytami kodów kreskowych (dual barcode reads)11.
Rycina 3. Biblioteki przygotowane z próbek klinicznych wirusa Ebola. Obraz żelu dla 4 reprezentatywnych bibliotek wirusa Ebola (EBOV). Przedstawiono regiony biblioteki oraz dimerów starterów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wyniki
Opisany protokół umożliwia generowanie wysokiej jakości odczytów sekwencjonowania z próbek wirusowego RNA o niskim wkładzie przy jednoczesnym wzbogacaniu o unikalną zawartość wirusa. Jak pokazano na rysunku 1, protokół wzbogacił unikalną zawartość wirusa Lassa co najmniej pięciokrotnie we wszystkich próbkach (w porównaniu z niezubożonymi kontrolami) o co najmniej milion kopii 18S rRNA (~100 pg całkowitego RNA). Podobnie, sukces sekwencjonowania również korelował z ilością wirusa w danej próbce. Używając qRT-PCR jako substytutu ilości wirusa, próbki, które zawierały ~ 1,000 lub więcej kopii genomu wirusa, najczęściej tworzyły pełne zespoły (dane nie pokazane). Co więcej, zubożenie nośnika poli(rA) zmniejsza sekwencje homopolimerowe A i T w bibliotekach, co skutkuje czystszymi preparatami i zapewnia lepszą jakość odczytów sekwencjonowania (Rysunek 2). Końcowe biblioteki z próbek klinicznych wirusów o niskim poziomie wejściowym często mają szeroką długość fragmentu od 150 do 1,000 pz (ryc. 3).
Po sekwencjonowaniu, aby zmniejszyć błędną identyfikację próbki i przesłuchy między bibliotekami w puli12, odczytuje się tylko indeks z bazowym wynikiem jakości 25 (q25) i zapewnia zerowe niezgodności podczas procesu demultipleksowania. Genomy wirusów są składane przy użyciu potoku bioinformatycznego specyficznego dla wirusów rozbieżnych2,4-6. Narzędzia te są dostępne na https://github.com/broadinstitute/viral-ngs lub za pośrednictwem komercyjnych platform chmurowych4.
Rozdział Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. pkt. Rozdział| Krok 1.1: Reakcja DNazy | |
| Odczynnik | Objętość na reakcję (μl) |
| 10x bufor DNazy | 7 |
| Woda wolna od nukleaz | 6 |
| Wyekstrahowane wirusowe RNA | 55 |
| DNaza (2 U/μl) | cyfra arabska |
| Całkowita objętość | 70 |
| Krok 2.1: 5x bufor hybrydyzacyjny | |
| Odczynnik | Objętość na 1 ml (μl) |
| 5 M NaCl | 200 |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,4) | 500 |
| Woda wolna od nukleaz | 300 |
| Całkowita objętość | 1 000 |
| Krok 2.1: 10x bufor reakcyjny RNazy H | |
| Odczynnik | Objętość na 1 ml (μl) |
| 5 M NaCl | 200 |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,5) | 500 |
| 1 M MgCl2 | 200 |
| Woda wolna od nukleaz | 500 |
| Całkowita objętość | 1 000 |
| Krok 2.1: Woda z liniowym akrylamidem | |
| Odczynnik | Objętość na 1 ml buforu (μl) |
| Woda wolna od nukleaz | Z numerem 992 |
| Akrylamid liniowy (5 mg/ml) | 8 |
| Całkowita objętość | 1 000 |
| Krok 2.2: Reakcja hybrydyzacji dla selektywnego zubożenia | |
| Odczynnik | Objętość na reakcję (μl) |
| 5x Bufor Hybrydyzacyjny | cyfra arabska |
| mieszanina oligonugołów zubożających rRNA (100 μM) | Pytanie 1,22 |
| Oligo(d)T (550 ng/μl) | 1 |
| Całkowite RNA poddane działaniu DNazy | maksymalnie 5 |
| Spike in RNA (Jest to opcjonalne) | 0,5 |
| Woda (z liniowym akrylamidem) | Łącznie do 10 |
| Całkowita objętość | 10 |
| Krok 2.3: Reakcja RNazy H na selektywne zubożenie | |
| Odczynnik | Objętość na reakcję (μl) |
| 10x Bufor reakcyjny RNazy H | cyfra arabska |
| Woda (z liniowym akrylamidem) | 5 |
| Termostabilna RNaza H (5 U/μl) | 3 |
| Całkowita objętość | 10 |
| Krok 2.4: Reakcja DNazy po selektywnym wyczerpaniu | |
| Odczynnik | Objętość na reakcję (μl) |
| 10x bufor DNazy | 7,5 |
| Woda (z liniowym akrylamidem) | 44,5 |
| Inhibitor RNazy (20 U/μl) | 1 |
| DNaza I wolna od RNaz (2,72 U/μl) | cyfra arabska |
| Objętość całkowita (z reakcją RNazy H) | 75 |
| Krok 3.1: synteza cDNA, losowa hybrydyzacja starterów | |
| Odczynnik | Objętość na reakcję (μl) |
| rRNA/RNA zubożone w nośnik | 10 |
| 3 μg losowo wyrywkowego startera | 1 |
| Całkowita objętość | 11 |
| Krok 3.2: Reakcja syntezy pierwszej nici cDNA | |
| Odczynnik | Objętość (μl) |
| 5x bufor reakcyjny pierwszej nici | 4 |
| 0,1 mln naziemnej telewizji cyfrowej | cyfra arabska |
| Miks 10 mM dNTP | 1 |
| Inhibitor RNazy (20 U/μl) | 1 |
| Odwrotna transkryptaza (dodaj ostatnią) | 1 |
| Objętość całkowita (z RNA powyżej) | 20 |
| Krok 3.3: Reakcja syntezy drugiej nici cDNA | |
| Odczynnik | Objętość (μl) |
| Woda wolna od RNaz | Rozdział 43 |
| 10x bufor reakcyjny drugiej nici | 8 |
| Miks 10 mM dNTP | 3 |
| Ligaza DNA E. coli (10 U/μl) | 1 |
| Polimeraza DNA E. coli I (10 U/μl) | 4 |
| RNaza E. coli H (2 U/μl) | 1 |
| Objętość całkowita (z reakcją 1. nici) | Rozdział 80 |
| Krok 4.2: Reakcja na tagowanie | |
| Odczynnik | Objętość (μl) |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | 1 |
| Bufor DNA do znakowania (TD) | 5 |
| Objętość całkowita (z cDNA) | 10 |
| Krok 4.3: Reakcja PCR w bibliotece | |
| Odczynnik | Objętość (μl) |
| Mistrzowska mieszanka PCR (NPM) | 7,5 |
| Indeks 1 elementarz (i7) | Rozdział 2.5 |
| Indeks 2 starter (i5) | Rozdział 2.5 |
| Objętość całkowita (z oznakowanym cDNA) | 25 |
| Krok 4.3.2: Warunki PCR biblioteki | |
| 72 °C, 3 min | |
| 95 °C, 30 s | |
| do 18 cykli-10 sekund w 95 °C, 30 sekund w 55 °C, 30 sekund w 72 °C | |
| 72 °C, 5 min | |
| 10 °C, na zawsze | |
Tabela 1: Konfiguracja reakcji i. Tabele krok po kroku z zawartością wszystkich i mieszanin reakcyjnych.
powiedział:| Nazwa oligo | Sekwencja (od 5' do 3') |
| Wirus Ebola KGH FW | GTCGTTCCAACAATCGAGCG powiedział: |
| Ebola KGH RV | CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT powiedział: |
| Ebola KULESH FW | TCTGACATGGATTACCACAAGATC powiedział: |
| Ebola KULESH RV | GGATGACTCTTTGCCGAACAATC |
| Lassa SL FW | GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC |
| Lassa SL RV | AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A |
| 18S rRNA FW | TCCTTTAACGAGGATCCATTGG |
| 18S rRNA RV | CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT |
Tabela 2: Sekwencje starterów qRT-PCR. Startery używane do pomiaru zawartości gospodarza (18S rRNA) i wirusów (Ebola i Lassa). "KGH" to Szpital Rządowy Kenema w Sierra Leone, w którym przetestowano szczepionki przeciwko wirusowi Ebola 2. "Kulesh" jest badaczem, który zaprojektował zestaw starterów 14.
Tabela 3: Oligokleotydy zubożające rybosomalne RNA (rRNA). 195 długich sekwencji 50-nukleotydowych komplementarnych do ludzkiego rRNA do selektywnego etapuzubożenia 6. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Przedstawione podejście umożliwia solidne, uniwersalne i szybkie sekwencjonowanie i zostało wykorzystane do sekwencjonowania wirusa Ebola podczas wybuchu epidemii w 2014 r.2,4. Dzięki sprzężeniu selektywnego zubożenia i syntezy cDNA z budową biblioteki tagowania, całkowity czas procesu został skrócony o ~2 dni w porównaniu z poprzednimi metodami ligacji adaptera. Niedawno protokół ten został zastosowany przez międzynarodowych współpracowników i inne podmioty z dużym sukcesem15,16 i zostanie wdrożony w laboratoriach w Afryce Zachodniej w celu wspierania lokalnych badań naukowych i diagnostyki opartych na genomice17.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje losowe startery do przygotowania cDNA dla wirusowych bibliotek sekwencyjnych RNA. W przeciwieństwie do poprzednich podejść sekwencyjnych wirusowego RNA, nie wymaga to apriorycznej wiedzy na temat danych sekwencyjnych ani skomplikowanego i czasochłonnego projektowania starterów dla konkretnego wirusa lub kladu. Metodę można zastosować do dowolnej próbki wirusowego RNA. Na przykład wykorzystano go do wygenerowania treści wirusowej zarówno z próbek wirusa Ebola, jak i Lassa6. Protokół może być również wykorzystywany w projektach sekwencjonowania transkryptomicznego, metagenomicznego i odkrywania patogenów gospodarza 1.
Kluczowym etapem protokołu jest ukierunkowane trawienie RNazy H, wysoce przepustowa i tania metoda usuwania niechcianego nośnika i RNA gospodarza z próbek wirusa. Etap selektywnego wyczerpywania protokołu wykorzystuje wiele komponentów i wymaga umiejętności oraz dokładności. Podczas wstępnej konfiguracji należy poświęcić dodatkowy czas i zachować ostrożność.
Ponieważ większość klinicznych próbek surowicy i osocza często zawiera bardzo mało materiału kwasu nukleinowego, zanieczyszczenie i utrata próbki są powszechne. Aby uniknąć tych problemów, należy zachować szczególną ostrożność podczas korzystania z tego protokołu. Po pierwsze, RNA jest bardzo podatne na degradację; Dlatego wszystkie obszary powinny być czyste i wolne od nukleaz. Po drugie, w celu zidentyfikowania próbek nadających się do wykorzystania w tym protokole, do oceny ilościowej należy zastosować testy qRT-PCR zarówno dla RNA gospodarza, jak i wirusa5,6. Porównując ilości wejściowe z wynikami sekwencjonowania z protokołu, sukces sekwencjonowania (tj. wygenerowanie wystarczającej ilości danych do pełnego złożenia wirusa) korelował z próbkami, które zawierały co najmniej 100 pg całkowitego RNA i 1000 kopii wirusa. Po trzecie, należy unikać narażenia na środowiskowe źródła kwasów nukleinowych. Przedstawiony tutaj protokół jest wykonywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zapewnienia środków ostrożności i ograniczenia zanieczyszczeń środowiska. Co więcej, nasza grupa i inni zauważyli, że komercyjne enzymy mogą być kolejnym źródłem zanieczyszczenia bakteryjnych kwasów nukleinowych w próbkach o niskiej wartości wejściowej6,18. Stosowanie czystego miejsca pracy (np. okapu do PCR, komory bezpieczeństwa biologicznego) i kontroli ujemnych (np. wody lub buforu) pomoże odpowiednio złagodzić i śledzić zanieczyszczenie. W przypadku próbek zawierających <100 pg całkowitego RNA, tylko RNA nośnika poli(rA), a nie rRNA, powinno być zubożone, aby zapewnić wysoką jakość wyników sekwencjonowania przy jednoczesnym ograniczeniu strat materiału. W przypadku próbek wejściowych o bardzo niskiej wartości metody amplifikacji cDNA mogą być bardziej odpowiednie19, chociaż nośnik poli(rA) powinien zostać usunięty przed syntezą cDNA.
Zubożenie rRNA gospodarza wzbogaca zawartość wirusa w bibliotekach sekwencjonowania i ma zastosowanie do różnych kolekcji próbek, w tym surowicy lub osocza oraz wielu rodzajów tkanek gryzoni i naczelnych innych niż ludzie5,6. W organizmach innych niż ludzie odczyty zgodne z 28S rRNA pozostały po wyczerpaniu, co sugeruje, że 28S rRNA jest mniej konserwatywne między ludźmi a innymi gatunkami6,20. W przypadku stosowania tej metody z izolatami innymi niż ludzki może być konieczne uzupełnienie oligonukleotydami DNA komplementarnymi do rozbieżnych sekwencji rRNA określonego gospodarza 3,21.
Ponieważ protokół jest bezstronny, odczyty wirusowe mogą stanowić tylko niewielki ułamek całkowitej zawartości biblioteki. Chociaż rRNA jest najliczniejszym gatunkiem RNA gospodarza i tylko niewielki procent odczytów rRNA (<1%) znajduje się po selektywnym wyczerpaniu, wszystkie inne RNA gospodarza (np. mRNA) pozostaną po wyczerpaniu i mogą odpowiadać za wiele odczytów sekwencjonowania z próbki. W związku z tym wymagane jest "nadpróbkowanie" (tj. nadsekwencjonowanie) poszczególnych bibliotek, aby mieć wystarczające pokrycie dla składania wirusów i wywoływania wariantów. W naszych badaniach staramy się sekwencjonować ~ 20 milionów odczytów na próbkę, aby uzyskać wystarczającą głębokość do analizy genomu wirusa i powiązanych wariantów, a także zawartości metagenomicznej2,5. W przypadku badań metagenomicznych i odkrywania patogenów ważne jest, aby pamiętać, że zanieczyszczające DNA gospodarza jest usuwane przez trawienie DNazy. W związku z tym wirusy i inne patogeny zawierające genomy DNA mogą zostać utracone podczas tego procesu, jednak produkty pośrednie RNA mogą być nadal sekwencjonowane.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została częściowo sfinansowana z funduszy federalnych z National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) oraz z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, na podstawie umów (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C i U19AI110818).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96-dołkowe płytki PCR | VWR | 47743-953 | |
| Paski po osiem nakrętek | VWR | 47745-512 | |
| Woda bez nukleaz | Ambion | AM9937 | Butelka 50 ml |
| TURBO DNase | Ambion | AM2238 | etap ekstrakcji RNA, 2 U/&mikro; l, bufor w zestawie |
| cykler | dowolne cyklery PCR | ||
| Koraliki Agencourt RNAClean XP SPRI | Kulki Beckman Coulter Genomics | A63987 | do oczyszczania RNA |
| qPCR w czasie rzeczywistym | dowolny system | ||
| DynaMag-96 Magnes z bocznymi listwami | Invitrogen | 12027 | |
| 70% etanolu | przygotuj świeże | ||
| startery qRT-PCR | IDT DNA | patrz Tabela 2 | |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9760G | |
| 1 M Tris-HCl pH 7,4 | Sigma | T2663-1L | |
| 1 M Tris-HCl pH 7,5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
| Akrylamid liniowy | Ambion | AM9520 | |
| obejmujące cały region rRNA | IDT DNA | patrz Tabela 3, zamów laboratoryjnie gotowy na 100 &mikro; M | |
| Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt długie, odsolone | |
| Hybrydaza Termostabilna RNaza H | Epicentrum | H39100 | |
| Zestaw DNaz wolnych od RNaz | Qiagen | 79254 | etap po selektywnym wyczerpaniu |
| Inhibitor RNazy SUPERase-In | Ambion | AM2694 | |
| Losowe startery | Invitrogen | 48190-011 | głównie heksamery |
| 10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
| SuperScript III Odwrotna transkrypcja | Invitrogen | 18080-093 | z buforem pierwszej nici, |
| inkubator | dowolne cyklery inkubatorów powietrznych | ||
| NEBNext Synteza drugiej nici (bez dNTP) Bufor reakcyjny | New England Biolabs | B6117S | 10x |
| E. coli Ligaza DNA | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μ l |
| E. coli Polimeraza DNA I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μ l |
| E. coli RNaza H New | England Biolabs | M0297L | 2 U/μ l |
| 0,5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
| Koraliki Agencourt AMPure XP SPRI | Beckman Coulter | Genomics A63881 | do oczyszczania DNA |
| Bufor elucyjny | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8,5 | |
| Quant-iT dsDNA HS Zestaw testowy | Fluorometr kubitowy Invitrogen | Q32854 | |
| Invitrogen | Q32857 | ||
| Nextera XT | Zestaw indeksu DNA Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT | Illumina | FC-131-1001 | |
| Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
| odczynniki D1000 o wysokiej czułości | Agilent | 5067-5585 | |
| Taśma ekranowa D1000 o wysokiej czułości | Agilent | 5067-5584 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
| Odczynniki DNA o wysokiej czułości | Biblioteka Agilent | 5067-4626 | |
| Kompletny zestaw do kwantyfikacji (uniwersalny) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternatywa dla tapestation, bioanalizator do bibliotecznej kwantyfikacji |
Bibliografia
- Stremlau, M. H., et al. Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa. PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631(2015).
- Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345, 1369-1372 (2014).
- Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue. PLoS One. 7, e42882(2012).
- Park, D. J., et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone. Cell. 161, 1516-1526 (2015).
- Andersen, K. G., et al. Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus. Cell. 162, 738-750 (2015).
- Matranga, C. B., et al. Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples. Genome Biol. 15, 519(2014).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
- Jiang, L., et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).
- Agilennt Technologies. , Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf. (2015).
- Kapa Biosystems. , Available from: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2015).
- Illumina Technologies. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf. (2015).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 40, 3(2012).
- Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Hu, Y., et al. Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing. Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713(2015).
- Simon-Loriere, E., et al. Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic. Nature. 524, 102-104 (2015).
- Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. Empowering African genomics for infectious disease control. Genome Biol. 15, 515(2014).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, 19(2011).
- Malboeuf, C. M., et al. Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification. Nucleic Acids Res. 41, 13(2013).
- Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny. Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nat Methods. 10, 623-629 (2013).
Przedruki i uprawnienia
