Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Streszczenie

Mutageneza ukierunkowana na miejsce od dawna jest stosowana jako metoda badania struktury, funkcji i ewolucji białek. Niedawne postępy w technologii sekwencjonowania masowo równoległego otworzyły możliwość oceny efektów funkcjonalnych lub sprawności dużej liczby mutacji jednocześnie. W tym miejscu przedstawiamy protokół eksperymentalnego określania skutków wszystkich możliwych mutacji pojedynczych aminokwasów w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, na przykładzie enzymu oporności na antybiotyki 263 aminokwasów TEM-1 β-laktamazy. W tym podejściu biblioteka mutagenezy nasycenia całych białek jest konstruowana za pomocą ukierunkowanego na miejsce mutagennego PCR, losowo przydzielając każdą pozycję indywidualnie do wszystkich możliwych aminokwasów. Biblioteka jest następnie przekształcana w bakterie i selekcjonowana pod kątem zdolności do nadawania oporności na antybiotyki β-laktamowe. Efekt dopasowania każdej mutacji jest następnie określany przez głębokie sekwencjonowanie biblioteki przed i po selekcji. Co ważne, protokół ten wprowadza metody, które maksymalizują głębokość odczytu sekwencjonowania i pozwalają na jednoczesny wybór całej biblioteki mutacji, poprzez mieszanie sąsiednich pozycji w grupy o długości dostosowanej do długości odczytu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i wykorzystanie starterów ortogonalnych do kodowania kreskowego każdej grupy. Reprezentatywne wyniki przy użyciu tego protokołu uzyskano poprzez ocenę wpływu na dopasowanie wszystkich mutacji pojedynczych aminokwasów w TEM-1 przy klinicznie istotnej dawce ampicyliny. Metodę tę powinno można łatwo rozszerzyć na inne białka, dla których stosuje się wysokoprzepustowy test selekcyjny.

Wprowadzenie

Mutageneza od dawna jest stosowana w laboratorium do badania właściwości systemów biologicznych i ich ewolucji, a także do produkcji zmutowanych białek lub organizmów o ulepszonych lub nowych funkcjach. Podczas gdy wczesne podejścia opierały się na metodach, które powodowały losowe mutacje w organizmach, pojawienie się technologii rekombinacji DNA umożliwiło naukowcom wprowadzenie wybranych zmian w DNA w sposób specyficzny dla danego miejsca, tj. mutageneza ukierunkowana^{na miejsce 1,2}. Przy obecnych technikach, zazwyczaj wykorzystujących mutagenne oligonukleotydy w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stosunkowo łatwo jest stworzyć i ocenić niewielką liczbę mutacji (np. mutacji punktowych) w danym genie^3,4. Jest to jednak o wiele trudniejsze, gdy cel zbliża się, na przykład, do stworzenia i oceny wszystkich możliwych mutacji jednomiejscowych (lub wyższego rzędu).

Chociaż wiele nauczyliśmy się z wczesnych badań próbujących ocenić dużą liczbę mutacji w genach, stosowane techniki były często pracochłonne, na przykład wymagały oceny każdej mutacji niezależnie przy użyciu bezsensownych szczepów supresorowych^5-7, lub były ograniczone w swojej zdolności ilościowej ze względu na niską głębokość sekwencjonowania Sanger⁸. Techniki stosowane w tych badaniach zostały w dużej mierze wyparte przez metody wykorzystujące technologię sekwencjonowania o wysokiej przepustowości^9-12. Te koncepcyjnie proste podejścia pociągają za sobą stworzenie biblioteki składającej się z dużej liczby mutacji, poddanie biblioteki badaniu przesiewowemu lub selekcji pod kątem funkcji, a następnie głębokie sekwencjonowanie (tj. w kolejności >10⁶ odczytów sekwencjonowania) biblioteki uzyskanej przed i po selekcji. W ten sposób efekty fenotypowe lub dostosowawcze dużej liczby mutacji, reprezentowane jako zmiana częstości występowania każdego mutanta, mogą być oceniane jednocześnie i bardziej ilościowo.

Poprzednio wprowadziliśmy proste podejście do oceny bibliotek wszystkich możliwych mutacji pojedynczych aminokwasów w białkach (tj. bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek), mające zastosowanie do genów o długości dłuższej niż długość odczytu sekwencjonowania^11,13: Po pierwsze, każda pozycja aminokwasu jest losowo wybierana przez mutagenny PCR skierowany na miejsce. Podczas tego procesu gen jest dzielony na grupy złożone z przyległych pozycji o całkowitej długości pomieszczonej przez platformę sekwencjonowania. Mutagenne produkty PCR dla każdej grupy są następnie łączone, a każda grupa niezależnie poddawana selekcji i sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Zachowując zgodność między lokalizacją mutacji w sekwencji a długością odczytu sekwencjonowania, podejście to ma tę zaletę, że maksymalizuje głębokość sekwencjonowania: podczas gdy można po prostu sekwencjonować takie biblioteki w krótkich oknach bez dzielenia na grupy (np. za pomocą standardowego podejścia do sekwencjonowania typu shotgun), większość uzyskanych odczytów byłaby typu dzikiego, a zatem większość przepustowości sekwencjonowania zostałaby zmarnowana (np. W przypadku biblioteki mutagenezy nasycenia całych białek białka składającego się z 500 aminokwasów sekwencjonowanych w oknach 100 aminokwasów (300 pz), co najmniej 80% odczytów będzie sekwencją typu dzikiego).

Tutaj prezentowany jest protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek, korzystając z powyższego podejścia (opisanego na rysunku 1). Co ważne, wprowadzamy zastosowanie starterów ortogonalnych w procesie klonowania biblioteki do kodowania kreskowego każdej grupy sekwencji, co pozwala na ich multipleksowanie do jednej biblioteki, jednoczesne poddawanie ich selekcji lub selekcji, a następnie demultipleksowanie w celu głębokiego sekwencjonowania. Ponieważ grupy sekwencji nie są poddawane selekcji niezależnie, zmniejsza to obciążenie pracą i zapewnia, że każda mutacja doświadcza tego samego poziomu selekcji. Jako system modelowy stosuje się TEM-1 β-laktamazę, enzym, który nadaje wysoki poziom oporności na antybiotyki β-laktamowe (np. ampicylinę) u bakterii^14-16. Opisano protokół oceny biblioteki mutagenezy wysycenia całych białek TEM-1 u E. coli poddanych selekcji na przybliżonym poziomie surowicy dla klinicznej dawki ampicyliny (50 μg/ml)^17,18.

Protokół

Uwaga: Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć zarys protokołu. Kilka kroków i odczynników w protokole wymaga środków bezpieczeństwa (oznaczonych "UWAGA"). Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki. Wszystkie kroki protokołu są wykonywane w RT, chyba że wskazano inaczej.

1. Przygotuj podłoża hodowlane i płytki

1. Przygotuj i sterylizuj w autoklawie 1 l oczyszczonej wody, 100 ml bulionu Super Optimal (SOB; Tabela 1), 1 L bulionu Luria-Bertani (LB; Tabela 2) i 1 l LB-agaru (tabela 3). Przygotować oddzielnie i wysterylizować trzy kolby hodowlane, z których każda zawiera 1 l LB.
   Uwaga: W całym protokole "woda" odnosi się do oczyszczonej wody sterylizowanej w autoklawie; SOB, LB i LB-agar odnoszą się do roztworów sterylizowanych w autoklawie.
2. Przygotować zapas 12 mg/ml Tet, rozpuszczając 0,12 g chlorowodorku tetracykliny w 10 ml 70% etanolu. Sterylizować za pomocą filtra 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C w miejscu chronionym przed światłem.
3. Schłodzić LB-agar do temperatury 50 °C, a następnie dodać 1 ml bulionu Tet (końcowe stężenie 12 μg/ml Tet). Wlać do płytek Petriego i ostudzić w temperaturze RT chronionej przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.

2. Budowa biblioteki mutagenezy nasycenia całego genu

Uwaga: Startery; zakończone PCR-y, restrykcyjne trawienia i ligacje; oraz oczyszczone próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

1. Projektowanie starterów mutagenezy
   1. Aby zmutować każdą pozycję aminokwasu do wszystkich możliwych aminokwasów, zaprojektuj parę komplementarnych starterów mutagenezy (sense/forward i antysens/reverse) dla każdej pozycji aminokwasowej zgodnie z następującymi wytycznymi:
      1. Zastąp kodon odpowiadający aminokwasowi, który ma być mutagenizowany przez NNS (gdzie N jest mieszaniną wszystkich czterech zasad nukleotydowych, a S jest mieszaniną cytozyny (C) i guaniny (G)) i wyśrodkuj w starterze, otoczony około 15 nukleotydami z każdej strony.
      2. Upewnij się, że końce 5' i 3' kończą się w C lub G i że temperatura topnienia (T_m) wynosi około 70 °C³. Użyj skryptu obliczeniowego NNS_PrimerDesign.m (patrz plik kodu uzupełniającego), aby zaprojektować startery mutagenezy NNS zgodnie z tymi wytycznymi.
   2. Zamów podkłady ze źródła komercyjnego. Dla ułatwienia należy je zsyntetyzować w formacie płytki 96-dołkowej i wstępnie rozcieńczyć w wodzie do 50 μM, przy czym jeden zestaw płytek zawiera startery mutagenezy sensownej, a drugie startery antysensowne.
   3. Napełnij miskę na pipety wodą i za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 95 μl do 263 dołków na trzech 96-dołkowych płytkach. Rozcieńczyć startery 20-krotnie do 2,5 μM za pomocą pipety wielokanałowej, aby przenieść 5 μl z 96-dołkowych płytek zawierających startery mutagenezy sensownej do pokrewnych dołków płytek zawierających wodę.
   4. Powtórzyć krok 2.1.3 protokołu, aby rozcieńczyć startery mutagenezy antysensownej.
2. Synteza podbibliotek NNS dla każdej pozycji aminokwasu za pomocą dwuetapowej mutagenezy ukierunkowanej na miejsce PCR
   1. Wykonać pierwszą rundę mutagennych reakcji PCR. Dla każdego startera mutagenezy przygotuj 25 μl reakcji PCR, używając plazmidu pBR322_AvrII jako matrycy i starterów AatII_F lub AvrII_R (startery mutagenezy sensownej w połączeniu ze starterem AvrII_R i startery mutagenezy antysensownej w połączeniu ze starterem AatII_F; łącznie 526 PCR). Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami AatII_F i AvrII_R.
      1. Przygotować "mieszankę wzorcową" do PCR, dodając odczynniki z tabeli 4 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przenieść do miski na pipety. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 15 μl do 263 dołków na trzech 96-dołkowych płytkach PCR. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 10 μl z 96-dołkowych płytek zawierających rozcieńczone startery mutagenezy sensownej do pokrewnych dołków w płytkach PCR.
      2. Przykryj każdą płytkę PCR 96-dołkową uszczelką. Wirować przy 200 x g przez 2 min.
      3. Przenieś płytki PCR do termocyklera i uruchom następujący program: 98 °C przez 30 sekund; 20 cykli: 98 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 1 minutę; 72 °C przez 2 minuty; trzymaj w temperaturze 4 °C.
      4. Powtórzyć kroki protokołu 2.2.1.1 - 2.2.1.3 dla 96-dołkowych płytek zawierających rozcieńczone startery mutagenezy antysensownej.
   2. Wykonaj drugą rundę mutagennych reakcji PCR. Dla każdej pozycji aminokwasowej należy przygotować reakcję PCR o objętości 25 μl, używając starterów AatII_F i AvrII_R oraz zmieszanych i rozcieńczonych mutagennych produktów PCR pierwszej rundy jako matrycy (łącznie 263 PCR).
      1. Napełnij miskę pipety wodą i za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 198 μl do 263 dołków na trzech 96-dołkowych płytkach.
      2. Połączyć i rozcieńczyć 100-krotnie mutagenne produkty PCR dla każdej pozycji aminokwasowej za pomocą pipety wielokanałowej, aby najpierw przenieść 1 μl z 96-dołkowych płytek PCR zawierających produkty PCR powstałe w wyniku starterów mutagenezy zmysłowej do pokrewnych studzienek płytek zawierających wodę. Następnie powtórzyć transfer dla produktów PCR powstałych z antysensownych starterów mutagenezy.
      3. Przygotować "mieszankę główną" PCR, dodając odczynniki z tabeli 5 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przenieść do miski na pipety. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 24 μl do 263 dołków na trzech 96-dołkowych płytkach PCR. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 1 μl z 96-dołkowych płytek zawierających zmieszane i rozcieńczone mutagenne produkty PCR pierwszej rundy do pokrewnych dołków w płytkach PCR.
      4. Przykryj każdą płytkę PCR 96-dołkową uszczelką. Wirować przy około 200 x g przez 2 min. Przenieś płytki do termocyklera i uruchom ten sam program, co w kroku protokołu 2.2.1.3.
   3. Przeanalizuj wyniki drugiej rundy mutagennych reakcji PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Upewnij się, że wszystkie produkty mają odpowiedni rozmiar i nie zawierają produktów zanieczyszczających.
      1. Dodaj 2 ml 2x barwnika ładującego żel do miski na pipety, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 6 μl do 263 dołków na trzech 96-dołkowych płytkach. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 6 μl z 96-dołkowych płytek PCR zawierających mutagenne produkty drugiej rundy PCR do pokrewnych dołków 96-dołkowych płytek zawierających barwnik.
      2. Przygotuj 1,5% żel agarozowy z 0,2 μg/ml bromku etydyny (UWAGA).
      3. Załaduj drabinę DNA na pierwszym i ostatnim pasie każdego rzędu. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej załadować 10 μl próbek z kroku 2.2.3.1 protokołu.
      4. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 40 minut i zobrazuj na transiluminatorze UV.
      5. Powtarzać kroki protokołu 2.2.3.2 - 2.2.3.4, aż wszystkie próbki zostaną przeanalizowane.
   4. Dokładnie zmierz stężenie każdego produktu PCR z podbiblioteki NNS za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA.
      1. Przenieść około 15 ml buforu EB do miski na pipety. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 49 μl do 263 dołków na trzech 96-dołkowych, czarnościennych, przezroczystych płytkach testowych z dnem.
      2. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 1 μl każdego produktu PCR drugiego etapu (krok 2.2.2 protokołu) do pokrewnych dołków na 96-dołkowych płytkach testowych.
      3. Przygotować krzywą wzorcową stężenia DNA, rozcieńczając DNA faga lambda do 2 ng/μl w 300 μl buforze EB, a następnie wykonać dziesięć dwukrotnych rozcieńczeń (w sumie 11 stężeń). przenieść 50 μl do pierwszych jedenastu kolumn rzędu jednej z 96-dołkowych płytek testowych z poprzedniego etapu, który nie zawiera próbki; Do dwunastej kolumny dodać 50 μl buforu EB (ślepa próba odczynnika).
      4. Przygotować odczynnik do oznaczania ilościowego dsDNA, dodając 75 μl odczynnika (patrz tabela materiałów) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodać 15 ml buforu EB. Wymieszać za pomocą rurki odwracającej, a następnie przenieść do miski na pipety. Chronić odczynnik przed światłem.
      5. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50 μl przygotowanego odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA do każdego dołka na płytkach testowych. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, chroniąc je przed światłem.
      6. Zmierzyć fluorescencję każdej próbki za pomocą czytnika mikropłytek i standardowych długości fal fluoresceiny (wzbudzenie 485 nm, emisja 520 nm; 0,1 s).
      7. Odjąć wartość fluorescencji ślepej próby odczynnika od wszystkich próbek. Wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie pomiarów fluorescencji próbek fagów lambda. Obliczyć stężenie każdej próbki, korzystając z odpowiednich pomiarów fluorescencji i krzywej wzorcowej.
3. Klonowanie podbibliotek NNS do wektorów wyboru
   1. Wymieszaj 100 ng każdego produktu PCR z podbiblioteki NNS w pięć grup podbibliotek SNS. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania DNA, a następnie zmierz stężenie za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA.
      Uwaga: Każda grupa składa się z około 53 ciągłych pozycji aminokwasów rozmieszczonych wzdłuż sekwencji TEM-1 (grupy podbibliotek NNS 1 - 5 składają się odpowiednio z pozycji 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236 i 237 - 290; numeracja według Amblera i wsp.^{Rozdział 19}).
   2. Utwórz wektory klonowania dla każdej grupy bibliotek podrzędnych usługi NNS.
      1. Przygotować pięć 100 μl PCR zgodnie z tabelą 6, używając starterów AvrII_F i AatII_OP1_R - AatII_OP5_R oraz plazmidów pBR322_OP1-5 jako matrycy (AatII_OP1_R sparowane z pBR322_OP1 itp.).
      2. Przenieś do termocyklera i uruchom następujący program: 98 °C przez 30 sekund; 25 cykli: 98 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 1,5 min; 72 °C przez 2 minuty; trzymaj w temperaturze 4 °C. ZobaczT able of Materials, aby zapoznać się z sekwencjami AatII_R i AvrII_F.
      3. Przygotuj 1% żel agarozowy z 0,2 μg/ml bromku etydyny (UWAGA).
      4. Dodaj 20 μl 6x barwnika ładującego żel do każdej próbki PCR. Załaduj pierwszą linię żelu drabinką DNA; Załadować całą objętość każdej próbki, pomijając co najmniej jedną studzienkę między próbkami.
      5. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 50 minut.
      6. Wizualizuj żel za pomocą oświetlacza UV o dużej długości fali (UWAGA). Plastry akcyzy zawierające produkt PCR w ilości ~3,500 pz; Przenieść do oddzielnych probówek do mikrofuge. Plastry żelu można przechowywać w temperaturze -20 °C.
      7. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, oczyść próbki za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i zmierz stężenie za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA.
   3. Zarówno dla grup podbibliotek NNS (krok protokołu 2.3.1), jak i wektorów klonowania (krok protokołu 2.3.2) należy skonfigurować skróty restrykcyjne z enzymami AatII i AvrII zgodnie z Table 7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania DNA, a następnie zmierz stężenie za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA.
   4. Skonfiguruj reakcje ligacji zgodnie z tabelą 8 dla każdej grupy podbiblioteki NNS trawionej restrykcyjnie z pokrewnym wektorem klonowania trawionym restrykcyjnie (grupa podbiblioteki NNS 1 z pBR322_OP1 itd.). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Oczyść reakcje za pomocą zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta; wymyć DNA za pomocą 20 μl wody.
   5. Przekształć całość oczyszczonych reakcji ligacji w wydajne bibliotekowo komórki E. coli za pomocą elektroporacji.
      1. Rozmrozić elektrokompetentne komórki E. coli, a następnie umieścić komórki i oczyszczone reakcje ligacji na lodzie.
      2. Przenieść 10 μl rozmrożonych komórek do każdej oczyszczonej reakcji ligacji, a następnie przenieść do kuwety elektroporacyjnej. Elektroporacja przy napięciu 1,8 kV.
      3. Odzyskaj komórki przez ponowne zawieszenie w 1 ml SOB. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      4. Zawiesić ponownie 10 μl każdej kultury regeneracyjnej w 990 μl LB; rozprowadzić 100 μl na płytkach agarowych LB zawierających 12 μg/ml Tet. Inkubować płytki O/N (~16 h) w temperaturze 37 °C.
      5. Dla każdej kultury odzysku należy przygotować kolbę hodowlaną o pojemności 250 ml z 50 ml LB i 50 μl bulionu Tet. Przenieść do kolby pozostały ~1 ml kultury odzysku. Inkubować O/N (~16 h) w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem (~200 obr./min).
   6. Policz liczbę kolonii na każdej tablicy. Oblicz liczbę udanych transformantów jako , gdzie to liczba kolonii, to objętość kultury odzysku (1 000 μl), a to objętość kultury odzysku posianej (1 μl).
      Uwaga: Aby zapewnić pełne pokrycie wszystkich mutacji, z reguły liczba udanych transformantów powinna być ≥100-krotnie większa od liczby oczekiwanych mutacji. Każda podbiblioteka NNS ma ~53 pozycje, więc oczekiwana liczba mutacji wynosi 53 pozycje × 32 kodony/pozycję ≈ 1,7 × 10³; Aby nadać bibliotece rozmiar ≥100-krotnie (≥1,7 × 10⁵), na każdej płycie powinno znajdować się ≥170 kolonii.
   7. Zgodnie z instrukcjami producenta wyizoluj plazmidowe DNA z kultur za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu, a następnie zmierz stężenia za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA. Wymieszaj ze sobą 100 ng każdego plazmidu. W ten sposób powstaje ostateczna biblioteka mutagenezy nasycenia całych białek.

3. Wybór biblioteki mutagenezy nasycenia całych białek TEM-1 pod kątem oporności na antybiotyki

1. Przygotowanie kultury preselekcji.
   1. Rozcieńczyć plazmid z kroku protokołu 2.3.7 do 0,5 ng/μl w wodzie i przenieść 20 μl do probówki mikrowirówkowej. Przeprowadzić transformację, odzysk, posiawóz i wzrost O/N zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku protokołu 2.3.5, z wyjątkiem przeniesienia 1 μl kultury odzysku SOB do 999 μl LB.
   2. Policz liczbę kolonii. Aby zapewnić pełne pokrycie wszystkich mutacji, powinno być ≥100 kolonii, co wskazuje ≥10⁶ udanych transformantów (100 × 263 pozycje × 32 kodony/pozycję ≈ 10⁶).
   3. Zmierzyć stężenie 50 ml kultury O/N.
      1. Przygotować ślepą próbę LB, dodając 1 ml LB do kuwety spektrofotometru. Zmierz OD600 na spektrofotometrze.
      2. Rozcieńczyć kulturę O/N 10-krotnie, ponownie zawieszając 100 μl w 900 μl LB. Zmierzyć OD600. Odejmij odczyt OD600 ślepej próby i pomnóż przez 10, aby uzyskać OD600 kultury O/N.
   4. Wstępnie ogrzać trzy kolby hodowlane od kroku 1.1 protokołu przez ~30 minut w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć kulturę O/N do OD600 = 0,1 i dodać 1 ml do jednej kolby (końcowy OD600 = 0,001). Jest to "kultura preselekcji".
   5. Inkubować "kulturę preselekcji" w temperaturze 37 °C, energicznie wstrząsając (200 obr./min). Okresowo monitoruj wzrost, mierząc OD600 jak w kroku protokołu 3.1.3 (nie jest konieczne 10-krotne rozcieńczanie kultury), aż OD600 = 0,1 (~2,5 godziny).
   6. Przenieść 100 ml kultury preselekcyjnej do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Wirować przy 4 000 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu i połączyć w jedną 15-stożkową probówkę. Powtórzyć wirowanie i usunąć cały supernatant. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Selekcja pod kątem oporności na ampicylinę.
   1. Podczas inkubacji kultury preselekcyjnej należy przygotować 50 mg/ml preparatu Amp w wodzie, rozpuszczając 0,5 g ampicyliny sodowej w 10 ml wody. Sterylizować za pomocą filtra 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Do pozostałych dwóch kolb dodać Tet do końcowego stężenia 12 μg/ml i objętości kultury preselekcyjnej tak, aby końcowy OD600 = 0,001. Do jednej kolby dodać 1 ml Amp, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml - jest to "kultura selekcyjna".
   3. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, energicznie wstrząsając (200 obr./min). Monitoruj wzrost hodowli, do której w poprzednim kroku nie dodano ampicyliny, aż OD600 = 0,1 (~ 2,5 godziny). W tym czasie należy również zmierzyć OD600 kultury selekcyjnej.
   4. Podzielić OD600 z kultury selekcyjnej na 0,1 i pomnożyć przez 100 ml. Przenieść tę objętość (~400 ml) do 50 ml stożkowych probówek i odwirować przy 4 000 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu i połączyć w jedną 15-stożkową probówkę. Powtórzyć wirowanie i usunąć cały supernatant.
   5. Zgodnie z instrukcjami producenta, wyizoluj plazmidowe DNA z osadów hodowli komórek preselekcji (krok protokołu 3.1.6) i selekcji (krok protokołu 3.2.4), a następnie zmierz stężenia za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA.

4. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości w celu określenia wpływu mutacji na dopasowanie

1. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
   1. Przygotowanie 25 μl PCR w celu demultipleksacji grup podbibliotek NNS za pomocą starterów ortogonalnych
      1. Przygotować wzorcową mieszankę do PCR zgodnie z tabelą 9; przenieść 23 μl do dziesięciu probówek PCR.
      2. Dodać 1 μl oczyszczonego plazmidowego DNA o stężeniu 0,5 ng/μl z kultury preselekcyjnej do probówek PCR 1 - 5 i z kultury selekcyjnej do probówek 6 - 10.
      3. Zmieszać ze sobą 50 μl 50 μM starterów ortogonalnych do przodu OP1_F - OP5_F z odpowiednimi starterami odwrotnymi ortogonalnymi OP1_R - OP5_R. W tej samej kolejności przenieś 1 μl do probówek PCR 1 - 5 i 6 - 10. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami OP1_F - OP5_F i OP1_R - OP5_R.
      4. Przenieś probówki PCR do termocyklera. Uruchom następujący program: 98 °C przez 30 sekund; 20 cykli: 98 °C przez 10 s, 55 °C przez 20 s, 72 °C przez 1,5 min; 72 °C przez 2 min; przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotuj 25 μl PCR, aby wyizolować każdą z grup podbibliotek NNS
      1. Rozcieńczyć 100-krotnie dziesięć PCR z kroku protokołu 4.1.1.4, przenosząc 1 μl każdego z nich do oddzielnych probówek PCR i dodając 99 μl wody. Wymieszać, a następnie odpipetować 99 μl i wyrzucić.
      2. Zmieszać ze sobą 50 μl 50 μM starterów do przodu Group1_F - Group5_F z odpowiednimi starterami odwrotnymi Group1_R - Group5_R. W tej samej kolejności przenieś 1 μl do probówek PCR 1 - 5 i 6 - 10. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami Group1_F - Group5_F i Group1_R - Group5_R.
      3. Przygotować główną mieszankę PCR zgodnie z tabelą 9, przenieść 23 μl do każdej probówki PCR. Przenieś probówki PCR do termocyklera; Uruchom ten sam program, co w kroku 2.2.1.3 Protokół.
   3. Przeprowadzić ostatnie 25 μl PCR, aby dodać sekwencje indeksujące
      1. Rozcieńczyć 100-krotnie dziesięć PCR z kroku protokołu 4.1.2.3, przenosząc 1 μl każdego z nich do oddzielnych probówek PCR i dodając 99 μl wody. Wymieszać, a następnie odpipetować 99 μl i wyrzucić.
      2. Przygotować główną mieszankę PCR zgodnie z tabelą 9, przenieść 23 μl do każdej probówki PCR.
      3. W przypadku probówek z szablonem pochodzącym z grup podbibliotek NNS 1-5, należy przenieść 0,5 μl na probówkę starterów do przodu odpowiednio 501_F - 505_F. W przypadku probówek z matrycą powstałą w wyniku kultur wstępnej selekcji i selekcji, należy przenieść 0,5 μl na probówkę starterów odwróconych odpowiednio 701_R i 702_R. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z sekwencjami 501_F - 505_F oraz 701_R i 702_R.
      4. Przenieś probówki PCR do termocyklera i uruchom program od kroku 2.2.1.3.
   4. Mieszanie i oczyszczanie próbek
      1. Zmierz stężenia za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać 100 ng każdego produktu PCR w jednej probówce do mikrowirówki.
      2. Przygotuj 2% żel agarozowy z 0,2 μg/ml bromku etydyny (UWAGA).
      3. Dodaj 6x barwnik ładujący żel do próbki zmieszanych produktów PCR. Załaduj pierwszą linię żelu drabinką DNA; załadować całą objętość próbki.
      4. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 50 minut. Zwizualizuj żel za pomocą oświetlacza UV o dużej długości fali (UWAGA). Plaster akcyzowy zawierający produkt PCR w stężeniu ~360 pz; Przenieś do probówki do mikrofuge. Plasterek żelu można przechowywać w temperaturze -20 °C.
      5. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, oczyść próbkę za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i zmierz stężenie za pomocą odczynnika do oznaczania ilościowego dsDNA. Jest to końcowa próbka do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
      .
   5. Sekwencja na platformie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (patrz tabela materiałów dla platformy używanej w tym protokole).
      1. Oblicz stężenie próbki w nM jako , gdzie oznacza stężenie próbki w ng/μl, a to długość sekwencji próbki DNA (~360 pz). Rozcieńczyć próbkę do 4 nM w buforze EB.
      2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby denaturować próbkę i rozcieńczyć do 9 pM w buforze hybrydyzacyjnym.
      3. Załadować 600 μl próbki do wkładu z odczynnikiem. Sekwencja postępuje zgodnie z instrukcjami producenta i instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
2. Analiza danych sekwencjonowania
   1. Pobierz FLASh (Fast Length Adjustment of Short reads)²⁰, umieść w folderze wraz z plikami fastq.gz uzyskanymi z sekwencjonowania.
   2. Użyj FLASh, aby połączyć fastq.gz pliki odpowiadające odczytom sparowanym końcówkom dla każdej pary indeksów (odczyty do przodu i do tyłu dla każdej grupy podbibliotek NNS dla kultur preselekcji i selekcji).
      1. Otwórz wiersz polecenia i zmień katalog na folder w kroku protokołu 4.2.1. Połącz każdą parę odczytów za pomocą polecenia: flash , gdzie mates1.fastq.gz i mates2.fastq.gz są plikami zawierającymi odpowiednio odczyty do przodu i do tyłu.
   3. Po dołączeniu każdej pary odczytów umieść plik wyjściowy out.extendedFrags.fastq w oddzielnych folderach dla wyników z kultur preselekcji lub selekcji. Zmień nazwę pliku wyjściowego out.extendedFrags.fastq zgodnie z grupą bibliotek podrzędnych NNS, do której odpowiada (np. 1.fastq, 2.fastq itd.).
   4. Uruchom skrypt obliczeniowy NNS_DataAnalyzer.m (patrz plik kodu uzupełniającego) z każdego folderu, aby obliczyć liczby dla każdej pojedynczej mutacji aminokwasu oraz liczby dla typu dzikiego dla każdej grupy bibliotek podrzędnych NNS.
   5. Oblicz efekt dopasowania każdej mutacji na każdej pozycji jako logarytm o podstawie dziesięciu stosunków liczb uzyskanych w zaznaczeniu () w stosunku do preselekcji ( ) warunek względem typu dzikiego:
      .

Wyniki

Mapa plazmidów dla pięciu zmodyfikowanych plazmidów pBR322 zawierających ortogonalne miejsca primingu (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) jest pokazana na rysunku 2A. Aby sprawdzić, czy startery ortogonalne są specyficzne, PCR przeprowadzono przy użyciu każdej pary starterów ortogonalnych indywidualnie, wraz ze wszystkimi pięcioma plazmidami pBR322_OP1-5 lub ze wszystkimi plazmidami bez plazmidu pasującego do ortogonalnej pary starterów. Właściwy produkt uzyskano tylko wtedy, gdy u...

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół do przeprowadzania oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek, przy użyciu technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ważnym aspektem metody jest zastosowanie starterów ortogonalnych podczas procesu klonowania. Krótko mówiąc, każda pozycja aminokwasu jest losowo przydzielana przez mutagenny PCR i mieszana razem w grupy pozycji, których łączna długość sekwencji jest dostosowywana przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Grupy te są klonowane do wek...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
	Typtone Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Ekstrakt drożdżowy	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-212
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Chlorowodorek tetracykliny	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Płytki Petriego	Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Startery oligonukleotydowe	Zintegrowane technologie DNA	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	skali 25 nmol, standardowe pBR322_AvrII odsalania
	dostępne na żądanie		plazmid pBR322 zmodyfikowany tak, aby zawierał miejsce restrykcyjne AvrII za genem TEM-1
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	dostępne na życzenie		pięć zmodyfikowanych plazmidów pBR322, z których każdy zawiera parę ortogonalnych miejsc primingu
Polimeraza DNA o wysokiej wierności Q5	New England Biolabs	M0491L	zawiera 5x bufor PCR i dodatek PCR (wzmacniacz GC)
15 ml stożkowa probówka	Corning	430025
Pipety wielokanałowe (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
Płytka PCR, 96-dołkowa	Fisher Scientific	14230232
96-dołkowa uszczelka Excel	Scientific	F-96-100
Veriti 96-dołkowy termocykler	Applied Biosystems	4375786
6x barwnik ładujący żel	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Bromek etydyny	Bio-Rad	161-0433
Oświetlacz UV (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.
http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation Bufor EB	Qiagen	19086
96-dołkowe, czarnościenne, przezroczyste płytki testowe z dnem	Corning	3651
Lambda phage DNA	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA Odczynnik	Invitrogen	P7581	używany w kroku protokołu 2.2.4
Czytnik mikropłytek Victor 3 V	PerkinElmer
	Zymo Research	D4003
Probówki do mikrowirówek	Corning	3621
Oświetlacz UV o długich falach	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Bufor do ekstrakcji DNA w żelu agarozowym	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202S
EVB100 elektrokompetentny elektroporator E. coli	Avidity	EVB100
(E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Kuwety do elektroporacji	Bio-Rad	165-2089
Spektrofotometr (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 ml probówki stożkowe	Corning	430828
Zestaw do oczyszczania plazmidu	Macherey-Nagel	740588.25
8-dołkowe probówki paskowe do PCR	Axygen	321-10-551
Zestaw testowy Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32854	dsDNA odczynnik do oznaczania
ilościowego Probówki do oznaczania kubitów	Invitrogen	Q32856
Fluorometr kubitowy	Invitrogen	Q32866
Sól sodowa ampicyliny	Akron Biotechnology	50824296
MiSeq zestaw odczynników v2 (500 cykli)	Illumina	MS-102-2003
Sekwencer biurkowy MiSeq	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	alternatywnie można sekwencjonować na platformie Illumina HiSeq
Oprogramowanie FLASh	John Hopkins University - oprogramowanie open source	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	do łączenia odczytów sparowanych końców z danych sekwencjonowania nowej generacji
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
AGTCCCAAGTTCAGACGTAC	OP3_R
			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R			TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F			AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R			TATAACAGGCTGCTGCTGAGACC
Group1_F			ACACTCTCTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F			AATGATACGGCGACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC
503_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
504_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC
505_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC
701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG powiedział: