Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis

Podsumowanie

Opisaliśmy protokół zapobiegania skutkom stresu cieplnego u szczurów poprzez doustne wstępne leczenie pożytecznymi bakteriami. Protokół ten może być modyfikowany i stosowany do różnych dróg podawania oraz do analizy różnych związków.

Streszczenie

To badanie miało na celu ocenę ochronnego działania szczepu Bacillus subtilis przed powikłaniami związanymi ze stresem cieplnym. W badaniu wykorzystano trzydzieści dwa szczury rasy Sprague-Dawley. Zwierzęta podawano doustnie dwa razy dziennie przez dwa dni szczepem B. subtilis BSB3 lub PBS. Następnego dnia po ostatnim zabiegu każdą grupę podzielono i dwie grupy eksperymentalne (jedną leczoną PBS i jedną leczoną B. subtilis) umieszczono w temperaturze 45 ^oC na 25 minut. Dwie grupy kontrolne przebywały przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Wszystkie szczury zostały poddane eutanazji i przeanalizowano różne parametry we wszystkich grupach. Niekorzystne skutki stresu cieplnego rejestruje się poprzez zmniejszenie wysokości kosmków i całkowitej grubości błony śluzowej w nabłonku jelitowym; translokacja bakterii ze światła; zwiększenie pęcherzyków erytrocytów i podwyższenie poziomu lipopolisacharydów (LPS) we krwi. Skuteczność ochronną leczenia ocenia się poprzez zapobieganie tym skutkom ubocznym. Protokół został opracowany do doustnego leczenia szczurów bakteriami w celu zapobiegania powikłaniom stresu cieplnego, ale protokół ten może być modyfikowany i stosowany do innych dróg podawania oraz do analizy różnych związków.

Wprowadzenie

Różne czynniki stresogenne wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt. Temperatura jest jednym z najbardziej stresujących czynników, powodującym przewlekłe, ostre, a nawet śmiertelne choroby¹. W wielu przypadkach udokumentowano zmiany w morfologii jelit i utratę integralności bariery jelitowej po stresie cieplnym^2,3. Ta bariera ochronna odpowiada za obronę przed translokacją bakterii jelitowych i ich toksyn, w szczególności lipopolisacharydów (LPS), ze światła do krążenia wewnętrznego^4,5. Stabilność mikrobioty jelitowej znacząco wpływa na funkcję bariery jelitowej, odpowiedź immunologiczną gospodarza i tolerancję na warunki stresowe⁶

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Auburn w Auburn w stanie Alabama.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, potraw i kultur bakteryjnych

1. Zaszczepić 10 ml bulionu odżywczego w kolbie pojedynczą kolonią kultury Bacillus subtilis BSB3, wyhodowaną przez noc na pożywnej płytce agarowej.
2. Przygotować 500 ml pożywki zarodnikowej¹⁹ (na litr: bulion Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (m/v) KCl, 10 ml; 1,2% (w/v) MgSO,₄ x 7H₂O, 10 ml; agar, 15 g) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ^oC przez 20 min. Pozostawić do ostygnięcia do 50 ^oC i ....

Wyniki

Średnia temperatura ciała zwierząt przed i bezpośrednio po stresie cieplnym wynosiła odpowiednio 36,7 ± 0,07 ^oC oraz 40,3 ± 0,17 ^oC (P < 0,05). Poddanie szczurów działaniu wysokiej temperatury (grupa 3) spowodowało istotne zahamowanie wzrostu wysokości kosmków oraz całkowitej grubości błony śluzowej (Ryciny 2, 3). Podawanie doustne szczepu BSB3 przed wystąpieniem stresu chroniło jelita przed szkodliwym działaniem ciepła.

Dyskusja

Narażenie na wysoką temperaturę skutkuje poważnymi schorzeniami²⁹. Zapobieganie i wczesne wykrywanie powikłań związanych ze stresem cieplnym ma kluczowe znaczenie³⁰. Przedstawiony protokół może być wykorzystany do oceny skuteczności różnych podejść do zapobiegania niekorzystnym skutkom stresu cieplnego.

Krytyczne etapy w ramach tego protokołu obejmują: procedurę obróbki cieplnej (45 ^oC, 25 min); stosowanie materiałów apirogennych podczas pobie.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
Alkohol etylowy	Pharmco products Inc. Brookfield, CT, Stany Zjednoczone	64-17-5
Agar	VWR	97064-334
Płytki agarowe MacConkey	VWR	470180-742
Płytki agarowe 5% z krwią	VWR	89405-024
Płytka z agarem z krwią brucella z heminem i witaminą K	VWR	89405-032
Bouin' s Nauka o Stabilnej	Mikroskopii Elektronowej, Hatfield, PA, USA	15990
IL-10 Zestaw ELISA dla szczurów	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0101
IL-1beta Zestaw ELISA dla szczurów	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0011
IL-6 Zestaw ELISA dla szczurów	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC0061
INF-gamma Szczur Zestaw ELISA	Invitrogen, Camarillo, CA, USA
TNF-alpha Zestaw ELISA dla szczurów	Invitrogen, Camarillo, CA, USA	KRC3011
Zestaw ELISA dla szczurów LPS	NeoBioLab, MA, USA	RL0275
Komora środowiskowa 6020-1	Caron, Marietta, OH, USA	6020-1
Wirówka	Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Stany Zjednoczone	Optima L-90K
Ultra Centrifuge
Mikroskop świetlny system optyczny	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Licznik kolonii	Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA	RE-3325
Zamrażarka	Haier, Brooklyn, NY, USA	HCMO50LA
Ultra mikropłytka czytnik	Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx 808
Auto Strip	Washer Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA	ELx50
	Gilson, Pipetman, Francja	P100, P200, P1000
C24 Wytrząsarka do inkubatora	New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA	Klasyczna
	Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, Stany Zjednoczone	55
szalek Petriego	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	875713	100 mm x 15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, Sanford, ME, USA	SG403
Kolby do uprawy kultur	Corning Incorporated, Corning, NY, USA	4995	PYREX 250 ml Kolby Erlenmeyera
Spektrometr optyczny Genesys 20	Thermo Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone.	4001
Sony DXC-33 Kamera wideo	Szkiełko
Richardson	Mikroskopia elektronowa Science, Hatfield, PA, USA	80303
System oczyszczania wody Millipore	Oprogramowanie	Direct-Q
Image-Pro Plus	Media Cybernetics, MD, USA
Triple Beam Balance	OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA
Homogenizator tkankowy, Dounce	VWR	71000-518

KRC4021 Pipety wytrząsarka bujana C24 testowe Sony