Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54126

⸱

22 lipca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

W tym artykule

Podsumowanie

Wrotki to mikroskopijny zooplankton używany jako modele w badaniach ekotoksykologicznych i starzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół do skutecznego i powtarzalnego pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus. Synchronizacja warunków hodowli na przestrzeni kilku pokoleń ma szczególne znaczenie, ponieważ stan matki wpływa na historię życia potomstwa.

Streszczenie

Rotifers to mikroskopijny kosmopolityczny zooplankton używany jako modele w badaniach ekotoksykologicznych i starzeniowych ze względu na ich zalety takie jak krótka żywotność, łatwość hodowli i partenogeneza, która umożliwia hodowlę klonalną. Należy jednak zachować ostrożność przy mierzeniu czasu przeżycia dziecka, ponieważ ma na niego wpływ wiek matki i warunki żywienia przez matkę. W tym miejscu przedstawiamy protokół do wydajnego i powtarzalnego pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus po starannej synchronizacji warunków hodowli przez kilka pokoleń. Empirycznie, słaba synchronizacja skutkuje wczesną śmiertelnością i stopniowym spadkiem wskaźnika przeżycia, co skutkuje słabą mocą statystyczną. Rzeczywiście, w takich warunkach ograniczenie kalorii (CR) nie przedłużyło znacząco żywotności B. plicatilis, chociaż długowieczność wywołana CR została wykazana z dobrze zsynchronizowanymi próbkami wrotków w przeszłych i obecnych badaniach. Protokół ten jest prawdopodobnie przydatny dla innych modeli bezkręgowców, w tym muszki owocowej Drosophila melanogaster i nicienia Caenorhabditis elegans, ponieważ u tych gatunków odnotowano również wpływ na wiek matki.

Wprowadzenie

Wrotki to mikroskopijny kosmopolityczny zooplankton (<1 mm), który tworzy gromadę Rotifera 1. Mają prosty plan ciała składający się z około 1000 komórek somatycznych, a także charakterystyczny przypominający koło aparat rzęskowy zwany koroną, który służy do poruszania się i karmienia. Większość wrotków należy do klas Monogononta lub Bdelloidea, które zawierają odpowiednio około 1,600 i 500 gatunków2. Wrotki monogonontowe mają na ogół zarówno płciową, jak i bezpłciową fazę rozrodczą (cykliczna partenogeneza), podczas gdy wrotki bdelloidalne rozmnażają się przez obowiązkową partenogenezę 3. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie genetycznie identycznych osobników wrotków, co zapewnia wysoką powtarzalność w eksperymentach. Ponadto mają kilka innych zalet jako organizmy modelowe, takich jak krótka długość życia, łatwość hodowli, dostępność danych sekwencji genomicznych i transkryptomicznych 4-7 oraz wyjątkowa pozycja filogenetyczna z dala od stawonogów i nicieni 8. Wrotki są zatem obiecującymi modelami bezkręgowców w badaniach ekologicznych, toksykologicznych i starzeniowych 9-12.

Czas przeżycia w warunkach stresu środowiskowego lub chemikaliów jest często mierzonym parametrem w tych dziedzinach badawczych 13-19. Należy jednak zachować ostrożność przy pomiarze czasu przeżycia wrotków, ponieważ są one podatne na warunki środowiskowe ich matek. Mianowicie, u wrotka jednoogonowego Brachionus manjavacas, potomstwo płci żeńskiej ze starszych matek ma krótszą długość życia niż potomstwo młodych matek; jednak ograniczenie kalorii u matki (CR) częściowo równoważy szkodliwe skutki zaawansowanego wieku matki 20 lat. U B. plicatilis matczyny CR zapewnia potomstwu długowieczność, długi czas przeżycia w warunkach głodu i wysoką odporność na stres oksydacyjny związaną ze zwiększoną ekspresją enzymów przeciwutleniających 21,22. Wpływ na wiek matki zaobserwowano również u wrotków bdelloidalnych 23. W związku z tym warunki doświadczalnych wrotków powinny być starannie zsynchronizowane przez kilka pokoleń przed pomiarami czasu przeżycia.

Tutaj udostępniamy protokół pomiaru czasu przeżycia u wrotków Brachionus po synchronizacji warunków hodowli przez kilka pokoleń. Post przerywany (IF), odmiana CR, w której wrotki są karmione okresowo, została zastosowana w celu ujawnienia wpływu synchronizacji ze względu na dobrze znany wpływ IF na długowieczność 22,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

Uwaga: Użyj do połowy rozcieńczonej sztucznej wody morskiej Brujewicza o zasoleniu 16,5 ppt (PSU). Inne sztuczne wody morskie są również często wykorzystywane do hodowli wrotków Brachionus 25,26.

  1. Dodaj 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl i 10 mM CaCl2 do 4,5 l wody destylowanej (końcowa objętość wyniesie 5 l). Alternatywnie użyj dejonizowanej wody rozcieńczającej zamiast wody destylowanej. Dodaj CaCl2 po rozpuszczeniu wszystkich innych soli.
  2. Przygotować 0,48 M roztwór podstawowy NaHCO3 (stężenie 200x). Dodaj 25 ml do powyższego roztworu. Końcowe stężenie NaHCO3 wynosi 2,4 mM.
  3. Przygotować 0,4 M roztwór podstawowy NaBr (stężenie 500x). Dodaj 10 ml do powyższego roztworu. Końcowe stężenie NaBr wynosi 0,8 mM. Uzupełnić do 5 l wodą destylowaną.
  4. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra membranowego 0,45 μm. Przed użyciem rozcieńczyć go dwa razy sterylną wodą (v/v).
    Uwaga: Możliwe jest wykonanie 2x stężenia sztucznej wody morskiej Brujewicza jako roztworu podstawowego.

2. Ogólne warunki hodowli

  1. Hodowla wrotków hodowanych w laboratorium lub dziko żyjących w sterylnej zlewce o pojemności 100 ml w temperaturze od 20 do 30 °C. Wyższe temperatury skutkują krótszą żywotnością i przyspieszoną reprodukcją. Użyj 25 °C dla wygody eksperymentów. Gęstość wrotka czy objętość sztucznej wody morskiej nie jest tutaj dużym problemem.
  2. Hodowla dietetycznych gatunków mikroalg w sztucznej wodzie morskiej 11. Zobacz Snell et al. (2014) w celu uzyskania szczegółowych informacji 11. Zazwyczaj stosuje się Tetraselmis tetrathele (~2 x 105 komórek/ml 27,28), T. suecica (~6 x 105 komórek/ml 25,29) i Nannochloropsis oculata (~7 x 106 komórek/ml 30,31). Ponieważ glony dietetyczne (gatunek, warunki hodowli, skład biochemiczny) znacząco wpływają na czas przeżywalności wrotków Brachionus, należy stosować tę samą partię mikroalg we wszystkich grupach eksperymentalnych.
  3. Utrzymuj populację wrotków w hodowli okresowej, karmiąc i zmieniając od czasu do czasu pożywkę (np. karmić co 2 dni i zaszczepiać co tydzień). Wiele noworodków i dorosłych noszących 2-3 jaja można zaobserwować, gdy wrotki są w optymalnych warunkach.
    Uwaga: Alternatywnym sposobem uzyskania eksperymentalnych wrotków jest wykluwanie jaj spoczynkowych. Wrotki wyklute z jaj spoczynkowych uważa się za dobrze zsynchronizowane, a ich długość życia nie różni się znacząco od żywotności wrotków wyklutych z jaj amiktycznych 11. Jednak wrotki z jaj spoczynkowych zaczynają rozmnażać się wcześniej niż te z jaj amiktycznych. Dlatego należy zachować ostrożność przy pomiarach ich cech rozrodczych.

3. Synchronizacja wrotków przez prekulturę

  1. Należy wybrać pojedynczy wrotek z populacji i kultury podstawowej, jak opisano w ppkt 2.1-2.3, aby ustalić subpopulację, która zostanie wykorzystana do eksperymentów. Zazwyczaj uprawa przez dwa tygodnie.
  2. Zbierz jajonośne wrotki z subpopulacji (zbierz podwójną liczbę osobników, które zostaną wykorzystane do eksperymentu). Hoduj je jako pojedynczą kohortę (gęstość: ~ 50 osobników/ml) na 6-dołkowej płytce hodowlanej, jak opisano w 2.1-2.3, w świeżej pożywce pod wpływem ad libitum. Kontrolowanie zagęszczenia populacji jest ważne, ponieważ kondycjonowana pożywka wpływa na fizjologię rozrodu wrotków Brachionus 32,33.
  3. Przenieść noworodki, które wykluły się z pierwszych jaj dorosłych osobników, do nowo przygotowanych pożywek hodowlanych. Powtórz tę procedurę przez 2-3 pokolenia
    4. .
  4. Do pomiaru czasu przeżycia wykorzystuje się noworodki, które wykluły się w określonym czasie (np. <3 godziny). Aby uniknąć możliwego błędu w wyborze pojedynczego osobnika, choć jest to bardzo mało prawdopodobne, sprawdź odtwarzalność przy użyciu kilku niezależnych subpopulacji.
    Uwaga: Ponieważ wrotki zwykle rozmnażają się tylko bezpłciowo w tych warunkach, upewnij się, że podczas eksperymentu nie ma samców. Samce są mniejsze od noworodków i zazwyczaj poruszają się szybciej niż samice. Samice miktyczne mają inną długość życia niż samice amiktyczne w pewnych warunkach 29.

4. Pomiary czasu przeżycia

  1. Umieść noworodki na plastikowych płytkach (zwykle 24- lub 48-dołkowych, z których każda zawiera 1 ml sztucznej wody morskiej).
  2. W odstępach 24-godzinnych przenieść wrotki na nowo przygotowane pożywki hodowlane lub w odstępach 12-godzinnych, jeśli temperatura jest wyższa (30 °C lub wyższa). Zapisz liczbę potomstwa i to, czy każdy osobnik jest żywy, czy martwy. Zapisz wrotek jako martwy, gdy ruch rzęsek korony całkowicie ustał.
    Uwaga: Wrotki często mocują się do bocznych ścian studni. Delikatne pipetowanie wody pomaga je znaleźć. Jeśli wrotki nie zostaną znalezione lub zostaną przypadkowo uszkodzone przez pipetowanie, zapisz je jako "ocenzurowane", a nie jako "martwe".
  3. Usuń noworodki, gdy eksperymentalne wrotki aktywnie się rozmnażają. Noworodki rosną szybko i czasami trudno je odróżnić od eksperymentalnych wrotków.

5. Analiza danych

  1. Utwórz krzywą przeżycia Kaplana-Meiera (rysunki 1 i 2), wykreślając skumulowany współczynnik przeżycia na osi Y i czas na osi X. Jest to najczęstsza reprezentacja danych dotyczących przeżycia. Użyj nieparametrycznego testu logarytmicznego rangi (zwanego również testem Mantela-Coxa) do statystycznego porównania czasu przeżycia 34. Test log-rank jest również zawarty w innych standardowych pakietach statystycznych, takich jak JMP i R.
    Uwaga: Nie należy stosować testu t Studenta ani analizy wariancji (ANOVA), po którym następuje parametryczne wielokrotne porównanie, ponieważ rozkład normalny zwykle nie jest spełniony przez dane dotyczące przeżycia 35. Ponadto metody te nie uwzględniają osób ocenzurowanych. Test U Manna-Whitneya może być stosowany, jeśli nie ma ocenzurowanych danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki


Rycina 1 przedstawia reprezentatywne krzywe przeżywalności słabo zsynchronizowanych populacji (z dwóch powtórzeń). W tym eksperymencie wrotki były karmione albo codziennie [grupa ad libitum (AL)], albo co drugi dzień (grupa IF). Mediana przeżywalności wynosiła odpowiednio 13 i 18 dni w grupach AL i IF. Choć wiadomo, że IF wydłuża czas życia wrotka, w tym eksperymencie nie udało się wykryć statystycznie istotnej różnicy między długością życia grup AL i IF. Em...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół opisuje metodę pomiaru czasu przeżycia wrotków Brachionus . Krytycznym krokiem jest synchronizacja warunków panujących w wrotku przez kilka pokoleń. Gdy eksperymentalne wrotki są dobrze zsynchronizowane, obserwuje się typową krzywą przeżycia typu I z bardzo małą wczesną śmiertelnością, jak podano w kilku poprzednich badaniach 18,24,37,38. Odchylenia standardowe ich czasu przeżycia stają się zatem mniejsze w porównaniu ze słabo zsynchronizowanymi wrotkami, co skutkuje wysoką mocą statys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni George'owi Jarvisowi, Marcie Bock i Bette Hecox-Lea, Morskiemu Laboratorium Biologicznemu, za pomoc w filmowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduWako190-13921
Chlorek magnezuWako136-03995
Siarczan magnezuWako131-00427
Chlorek potasuWako168-22111
Chlorek wapniaWako035-00455
Wodorowęglan soduWako199-05985
Bromek soduWako190-01515
Filtr membranowy (0,45 &mikro; m wielkość porów)MilliporeHAWP04700
Płytka hodowlana, 6-dołkowa, niepoddana obróbceThomas Scientific6902D01
Płaska płytka hodowlana, 48-dołkowa, niepoddana obróbceThomas Scientific6902D07
Tetraselmis, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPadSoftware Version 6.0d

Bibliografia

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Czas prze ycia pier cienicsynchronizacja kondycji matekBrachionus plicatiliswp yw ograniczenia kalorii na d ugo yciaprotok przerywanego postuhodowla noworodk wpobieranie osobnik w z jajamiprzygotowanie sztucznej wody morskiejanaliza krzywej prze ywalno cipomiar mocy statystycznej
Pomiar czasu przeżycia u wrotków Brachionus: synchronizacja warunków matczynych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.