Artykuł metodologiczny

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

DOI:

10.3791/54131

⸱

31 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja jest jedną z podstawowych modyfikacji epigenetycznych DNA, która odpowiada za precyzyjną regulację genów niezbędnych do stabilnego rozwoju i różnicowania różnych typów tkanek. Rozregulowanie tego procesu jest często cechą charakterystyczną różnych chorób, takich jak rak. W tym miejscu przedstawiamy jedną z najnowszych technik sekwencjonowania, sekwencjonowanie wychwytywania DNA wiążącego metylo (MBDCap-seq), stosowane do ilościowego określania metylacji w różnych tkankach normalnych i chorobowych dla dużych kohort pacjentów. Opisujemy szczegółowy protokół tego podejścia do wzbogacania powinowactwa wraz z potokiem bioinformatycznym w celu osiągnięcia optymalnej kwantyfikacji. Technika ta została wykorzystana do sekwencjonowania setek pacjentów z różnymi typami nowotworów w ramach projektu 1000 methylome (Cancer Methylome System).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetyczna regulacja genów poprzez metylację DNA jest jednym z podstawowych mechanizmów wymaganych do określenia losu komórki poprzez stabilne różnicowanie różnych typów tkanek w organizmie1. Wiadomo, że rozregulowanie tego procesu powoduje różne choroby, w tym raka2.

Proces ten polega głównie na dodawaniu grup metylowych do reszty cytozyny w dinukleotydach CpG DNA3. Istnieje kilka różnych technik stosowanych obecnie do badania tego mechanizmu, z których każda ma swoje zalety, jak opisano w wielu badaniach2-8. Tutaj omówimy jedną z tych technik zwaną sekwencjonowaniem wychwytywania DNA wiążącego metyl (MBDCap-seq), w której używamy techniki wzbogacania powinowactwa do identyfikacji metylowanych regionów DNA. Technika ta opiera się na zdolności białka MBD2 do wiązania metylu w celu wzbogacenia genomowych fragmentów DNA zawierających metylowane miejsca CpG. Używamy komercyjnego zestawu do wzbogacania metylowanego DNA do izolacji tych metylowanych regionów. Nasze laboratorium przebadało setki próbek pacjentów przy użyciu tej techniki i tutaj zapewniamy kompleksowy zoptymalizowany protokół, który można wykorzystać do badania dużych kohort pacjentów.

Jak widać w przypadku każdej technologii sekwencjonowania nowej generacji, MBDCap-seq wymaga również specjalnego podejścia bioinformatycznego w celu dokładnego ilościowego określenia poziomów metylacji w próbkach. W ostatnim czasie przeprowadzono wiele badań mających na celu optymalizację procesu normalizacji i analizy danych sekwencjonowania 9,10. W tym protokole demonstrujemy jedną z tych metod, w której wdraża się unikalne podejście do odzyskiwania odczytu — LONUT — po którym następuje liniowa normalizacja każdej próbki, aby umożliwić bezstronne porównania dużej liczby próbek pacjentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie tkanki są uzyskiwane po zatwierdzeniu przez komisję Institutional Review Board i po wyrażeniu zgody przez wszystkich uczestników zarówno na analizy molekularne, jak i badania kontrolne. Protokoły są zatwierdzone przez Komitet Badań nad Ludźmi w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.

1. Wychwytywanie DNA wiążącego metyl (MBDCap)

  1. Pobieranie próbek i izolacja DNA
    1. Pobrać masowe próbki guza lub normalnych tkanek z próbek tkanek zatopionych w parafinie pacjenta.
    2. Użyj komercyjnego mini zestawu DNA, aby wyizolować genomowe DNA z próbek tkanek zatopionych w parafinie zgodnie z protokołem producenta.
    3. Użyj zestawu do wzbogacania metylowanego DNA z opisaną tutaj procedurą zgodnie z protokołem producenta.
  2. Wstępne mycie ściegu
    Uwaga: Koraliki są używane do łączenia się z białkiem MBD-biotyny, które wykrywa metylację DNA w genomie. Koraliki są zwykle zawieszone w roztworze podstawowym. Wykonaj poniższe czynności, aby zmyć ten płyn.
    1. Zawiesić zapas kulek streptawidyny (patrz tabela materiałów), delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Nie mieszaj koralików przez wirowanie.
    2. Na jeden μg wejściowego DNA dodaj 10 μl kulek do probówki z 90 μl 1x buforu Bind/Wash. Obracaj przez 1 min. Nie mieszać przez wirowanie.
    3. Umieść probówkę (probówki) na stojaku magnetycznym na 1 minutę.
    4. Usuń płyn pipetą i wyrzuć płyn.
    5. Dodaj 250 μL 1x Bind/Wash Buffer do kulek i obracaj przez 1 min.
    6. Powtórz kroki 1.2.3 - 1.2.5 dwukrotnie.
  3. Sprzężenie białka MBD-biotyny z kulkami
    1. Aby uzyskać 1,2 μg wejściowego DNA, dodaj 7 μl (3,5 μg) białka MBD-Biotyny do każdej probówki.
    2. Dodaj 93 μL 1x Bind/Wash Buffer do białka, aby uzyskać końcową objętość 100 μL.
    3. Mieszaj mieszaninę kulek i białek na mieszalniku obrotowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Rozdrobnione DNA (dane wejściowe)
    1. Sonizacja DNA poprzez dodanie 1,2 μg całkowitego genomowego DNA do 96 μl buforu TE i 24 μl 5x buforu Bind/Wash w celu uzyskania 120 μl roztworu. Użyj 30 s power ON i 30 s power off podczas sonikacji, 20 - 25 razy.
    2. Uruchom 1 μl sonikowanego roztworu DNA za pomocą systemu bioanalizatora z komercyjnym zestawem DNA o wysokiej czułości, aby sprawdzić, czy rozmiar fragmentów mieści się w zakresie 150 - 350 pz zgodnie z protokołem producenta.
  5. Umyj koraliki MBD
    1. Umieść probówkę zawierającą kulki MBD na stojaku magnetycznym na 1 minutę.
    2. Usuń i wyrzuć płyn za pomocą pipety, nie dotykając kulek.
    3. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 250 μl 1x buforu Bind/Wash.
    4. Mieszaj koraliki na mikserze obrotowym w temperaturze RT przez 5 minut.
    5. Powtórz kroki 1.5.1 - 1.5.4 dwukrotnie.
  6. Reakcja wychwytywania fragmentarycznego DNA (1 μg wejściowego DNA)
    1. Przenieść mieszaninę DNA/buforu do probówki zawierającej kulki MBD.
    2. Mieszać kulki MBD z DNA na mieszalniku obrotowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, mieszać O/N w temperaturze 4 oC.
  7. Usuwanie nieprzechwyconego DNA z kulek
    1. Po wymieszaniu kulek DNA i MBD umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby skoncentrować wszystkie kulki na wewnętrznej ściance probówki.
    2. Usunąć ciekłość sklarowaną nad osadem za pomocą pipety i zachować ją w czystej probówce mikrowirówkowej bez DNaz jako niemetylowane DNA. Próbkę należy przechowywać na lodzie.
    3. Dodaj 200 μl 1x buforu Bind/Wash do kulek, aby umyć kulki.
    4. Mieszaj koraliki na mikserze obrotowym przez 3 minuty.
    5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę.
    6. Usuń płyn pipetą i zachowaj go w probówce do mikrowirówki.
    7. W przypadku reakcji wychwytywania ≤1 μg wejściowego DNA należy powtórzyć kroki 1.7.3 - 1.7.6 dla łącznie 2 dodatkowych frakcji przemywania.
  8. Elucja jednofrakcyjna
    1. Zmieszać bufor o niskiej zawartości soli z buforem o wysokiej zawartości soli (1:1), aby uzyskać bufor elucyjny (1,000 mM NaCl).
    2. Zawiesić kulki w 200 μl buforu elucyjnego (1 000 mM NaCl).
    3. Inkubuj koraliki na obrotowym mikserze przez 3 minuty.
    4. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę.
    5. Trzymając probówkę na stojaku magnetycznym, usuń płyn za pomocą pipety, nie dotykając kulek końcówką pipety i zachowaj ją w czystej, wolnej od DNaz probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Próbkę należy przechowywać na lodzie.
    6. Powtórzyć kroki 1.8.1 - 1.8.4 jeden raz, zbierając drugą próbkę do tej samej probówki (całkowita objętość wyniesie 400 μl). Zbiorczą próbkę należy przechowywać na lodzie.
  9. Wytrącanie etanolu (oczyszczanie DNA)
    1. Do każdej niewychwyconej, przemywającej i elucyjnej frakcji z poprzednich etapów dodać 1 μl glikogenu (20 μg/μL, zawarty w zestawie), 1/10 objętości próbki 3M octanu sodu o pH 5,2 (np. 40 μL na 400 μL próbki) i 2 objętości próbki 100% etanolu (np. 800 μL na 400 μL próbki). Całkowita objętość wynosi 1 241 μL.
    2. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -80 oC przez co najmniej 2 godziny.
    3. Odwirowywać probówkę przez 15 minut w temperaturze 11,363 x g w temperaturze 4 oC.
    4. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu.
    5. Dodaj 500 μl zimnego 70% etanolu.
    6. Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 11,363 x g w temperaturze 4 oC.
    7. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu.
    8. Powtórzyć kroki 1.9.6 - 1.9.7 jeden raz i usunąć resztki supernatantu.
    9. Suszyć pellet na powietrzu przez ~5 min. Nie susz całkowicie granulatu.
    10. Zawiesić osad DNA w 37,5 μl wody wolnej od DNaz lub innej odpowiedniej objętości buforu.
    11. Umieścić DNA na lodzie lub przechowywać je w temperaturze -20 oC lub niższej do czasu dalszego użycia.
    12. Sprawdź, czy całkowita ilość DNA przekracza 20 ng (np. użyj fluorometrycznego systemu oznaczania ilościowego, patrz Tabela materiałów).

2. Sekwencjonowanie

  1. Do sekwencjonowania należy wykorzystać fragmenty DNA odzyskane w procedurze MBDCap. Dla każdej próbki, która ma być zsekwencjonowana, wymagana jest całkowita ilość 20 - 40 ng DNA do przygotowania biblioteki.
  2. Do przygotowania biblioteki DNA-seq należy użyć w pełni zautomatyzowanego systemu budowy biblioteki (patrz tabela materiałów) i postępować zgodnie ze standardowym protokołem dostarczonym przez producenta. Do przygotowania biblioteki należy wybrać fragmenty DNA o wielkości 200 - 400 pz. Zautomatyzowany system przygotowania biblioteki pozwala na standaryzację procedury przygotowania biblioteki i zminimalizowanie różnic między próbkami spowodowanych ręcznym przygotowaniem.
  3. Użyj podkładów adaptacyjnych i rozcieńczyć do 100-krotnego stężenia. Z tego należy użyć 10 μl na każdą próbkę.
  4. Postępując zgodnie z krokiem 2.2, wyjąć reakcję i określić ilościowo bibliotekę sekwencjonowania DNA za pomocą fluorometrycznego systemu ilościowego (patrz tabela materiałów).
    1. Ustaw procedurę amplifikacji PCR. Wybór głównej mieszanki PCR ma na celu poprawę wydajności PCR regionu genomu wzbogaconego w GC. W probówce do PCR dodaj 15 μl biblioteki sekwencyjnej DNA, 25 μl mieszanki wzorcowej PCR (patrz tabela materiałów), 2 μl mieszaniny starterów PCR (patrz tabela materiałów) i 8 μl H2O.
  5. Postępuj zgodnie z zaleceniami PCR producenta mieszanki wzorcowej PCR, zmieniając czasy cykli i temperatury dla różnych materiałów wyjściowych: 98 oC przez 45 s, X cykli 98 oC przez 15 s, 65 oC przez 30 s, 72 oC przez 30 s, a następnie 72 oC przez 1 min. Przytrzymaj w 4 oC.
    1. Wykonaj wystarczającą liczbę cykli, aby uzyskać 2 - 10 nM DNA biblioteki (8 - 10 cykli).
  6. Oczyść reakcję PCR w stosunku 1:1 kulek oczyszczających PCR zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
  7. Eluować za pomocą buforu elucyjnego o pojemności 20 - 30 μl.
  8. Oznacz kreskowo każdą próbkę i połącz 4 próbki razem w jednym torze komory przepływowej. Do sekwencjonowania należy użyć standardowego protokołu pojedynczego odczytu 50 bp (patrz tabela materiałów).

3. Analiza bioinformatyczna

Uwaga: Dalsze przetwarzanie surowych plików fastq uzyskanych z sekwencjonowania w celu przeprowadzenia kontroli jakości i mapowania krótkich sekwencji DNA (odczytów) do genomu.

  1. Użyj nakładki do krótkiego odczytu Bowtie, narzędzia do mapowania genomu na każdym pliku fastq próbki, aby zmapować odczyty do genomu referencyjnego. Do wykonania tego kroku dostępnych jest wiele narzędzi do mapowania odczytu, które mogą być używane w zależności od indywidualnych preferencji.
    1. Zezwalaj na maksymalnie 2 niezgodności w całych odczytach podczas mapowania do genomu referencyjnego. Raportuj do 20 najlepszych wyrównań dla każdego odczytu. Na przykład użyj muszki -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 .
  2. Użyj LONUT9, aby odzyskać wielokrotnie zmapowane odczyty, aby poprawić wykrywanie wzbogaconych regionów. Dla każdego odczytu zostanie odzyskane co najwyżej jedno wyrównanie, gdy znajdzie się wystarczająco blisko któregokolwiek z wyżej wymienionych szczytów. Na przykład użyj: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 . LONUT wykona następujące kroki.
    1. Podziel wyrównania na unikatowo zamapowane odczyty i wielokrotnie zamapowane odczyty. Szczyt połączenia na unikatowo zmapowanych odczytach przy użyciu szczytowego wywołującego BELT11. Opcje -w 250 i -p 99 w przykładowym poleceniu są dla BELT.
    2. Połącz jednoznacznie zmapowane odczyty z odzyskanymi odczytami uzyskanymi z LONUT, a połączone odczyty, w formacie BED, zostaną wykorzystane w dalszej analizie. Oblicz liczbę połączonych odczytów dla przyszłej normalizacji.
  3. Wyrzuć odczyty do kosza. Wyodrębnianie odczytuje w obszarze zainteresowania za pomocą skryptu perla: perl methyPipeline.pl -up -dn. Dla każdego pliku łóżka wymienionego w sampleInfoFile, skrypt perla wykonuje następujące zadania.
    Uwaga: Zobacz dodatkowy plik kodowania dla skryptu perla.
    1. Odczyty z pojemnika o stałym rozmiarze, np. 100 pz, dla 24 chromosomów.
    2. Dla każdego genu określonego w refGeneFile wyodrębnij pojemniki wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS), aż do długości rozszerzenia określonej przez opcje -up i -dn. Na przykład wyodrębnij dane w regionie, który jest w górę i w dół 4 kb usług TSS. Przy rozmiarze pojemnika 100 pz wyodrębnione dane mają 81 pojemników, a środkowy pojemnik odpowiada TSS.
    3. W przypadku genu na nici antysensownej odwróć wyekstrahowany region od lewej do prawej, tak aby pojemniki nadrzędne były zawsze umieszczane po lewej stronie za pomocą skryptu perla.
    4. Dalej podziel region TSS ±4 kb na trzy podregiony: Po lewej, w górę 4 kb do w górę 2 kb; Środek, góra i dół 2 kb; Po prawej, w dół od 2 kb do 4 kb.
    5. Dla każdej próbki podzielić liczbę odczytów w każdym bloku przez całkowitą liczbę połączonych odczytów odwzorowanych obliczoną zgodnie z ppkt 3.3.3. Normalizacja wyeliminuje różnice w odczycie specyficzne dla próbki i pozwoli porównać odczyty w różnych próbkach.
  4. Uruchom skrypt bash (jak wskazano w pliku skryptu), aby wykonać test statystyczny na znormalizowanych odczytach uzyskanych z lewego regionu, aby wykryć różnicową metylację między grupą normalną a grupą przypadków w regionach opisanych jako w regionie bocznym.
    Uwaga: Zobacz dodatkowy plik kodowania dla skryptu bash. W oparciu o regiony, które są różnie metylowane, istnieje siedem kombinacji:
    Cały region: zróżnicowana metylacja w całym regionie TSS ±4 kb
    Środkowy po lewej: różnicowa metylacja zarówno w środkowym, jak i lewym obszarze
    Środkowy po prawej: metylacja różnicowa zarówno w środkowym, jak i prawym obszarze
    Bok: metylacja różnicowa zarówno w lewym, jak i prawym regionie
    Po lewej: metylacja różnicowa tylko w lewym obszarze
    Po prawej: metylacja różnicowa tylko w prawym obszarze
    Środek: różnicowa metylacja tylko w środkowym regionie
  5. Użyj tego samego skryptu bash, aby zwizualizować różnicową metylację na wykresie tornada. Wykreślić geny hiper i hipometylacji na osobnym panelu i posortować w kolejności kombinacji regionów, jak opisano odpowiednio w 3.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy MBDCap-seq do zbadania zmian metylacji DNA u dużej liczby pacjentek z różnych typów raka, w tym między innymi raka piersi12, endometrium13, prostaty14 i wątroby. Poniżej przedstawiamy kilka informacji z badania nad rakiem piersi opublikowanego niedawno12. W tym przypadku zastosowaliśmy podejście sekwencjonowania całego genomu, aby zidentyfikować wyspy CpG, które są różnie metylowane w guzie w odniesieniu do normalnych w różnych regionach genomu. Badanie wykazało, że spośród wszystki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika MBDCap-seq jest podejściem opartym na wzbogacaniu powinowactwa3, uważanym za opłacalną alternatywę podczas badania kohort z dużą liczbą pacjentów15. Przedstawiony tutaj pipeline opisuje kompleksowe podejście od pobierania próbek po analizę i interpretację danych. Jednym z najważniejszych kroków jest ustanowienie procedury amplifikacji PCR w celu poprawy skuteczności PCR regionów wzbogaconych w GC w genomie, ponieważ to właśnie tam zachodzi metylacja DNA. Konieczne jest również upewnienie się, że po sekwencjonow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został opracowany w laboratoriach dr Tima Huanga i dr Victora Jina w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace są wspierane przez CPRIT Research Training Award RP140105, a także częściowo wspierane przez amerykańskie National Institutes of Health (NIH) granty R01 GM114142 oraz przez William & Ella Owens Medical Research Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do wzbogacania DNA metylomineraInvitrogenME10025
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen112-05D
Bioruptor Plus Sonication DeviceDiagenodeB01020001
3 M octan sodu, pH 5,2SigmaS7899100 mL
SPRIworks Fragment Library System IBeckman CoulterA50100W pełni zautomatyzowany system budowy biblioteki
Adapter StarteryBioo Scientific 514104Mieszanka starterów PCR
QubitInvitrogenQ32854Fluorometryczny system ilościowy
PCR master mixKAPA scientificKK2621PCR master mix
AMPure XPBeckman CoulterA63881PCR Kulki oczyszczające
EB BufferQiagen19086
System sekwencjonowania HiSeq 2000Illumina

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
  2. Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
  3. Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
  4. Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233(2012).
  5. Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
  6. Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
  7. Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
  8. Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
  9. Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788(2013).
  10. Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980(2013).
  11. Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
  12. Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13(2015).
  13. Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
  14. Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
  15. Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
  16. Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza metylacji DNApr bki tkanek pacjent wizolacja genomowego DNAprotok sonikacjiprzygotowanie buforu elucyjnegopotok bioinformatycznymetylacja wysp CpGprojekt Cancer Methylome Projectodkrywanie biomarker w epigenetycznych

Powiązane artykuły