Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dużych cząsteczek DNA na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym DNA z białkiem fluorescencyjnym

DOI:

10.3791/54141

⸱

23 czerwca 2016

 , 
1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy podejście do wizualizacji dużych cząsteczek DNA wybarwionych peptydem wiążącym fluorescencyjne białko (FP-DBP) na uwięzi na powierzchni glikolu polietylenowego (PEG) i szkła pokrytego awidyną i rozciąganych za pomocą mikroprzepływowych przepływów ścinających.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duże cząsteczki DNA uwiązane na funkcjonalizowanej powierzchni szkła zostały wykorzystane w fizyce polimerów i biochemii, szczególnie do badania interakcji między DNA a białkami wiążącymi. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji dużych cząsteczek DNA uwięzionych na powierzchni. Po pierwsze, szkiełka nakrywkowe są biotynylowane i pasywowane przez powlekanie biotynylowanym glikolem polietylenowym, który specyficznie wiąże biotynylowane DNA za pośrednictwem łączników białka awidyny i znacznie zmniejsza niepożądane wiązanie z niespecyficznych interakcji białek lub cząsteczek DNA na powierzchni. Po drugie, cząsteczki DNA są biotynylowane dwiema różnymi metodami, w zależności od ich zakończeń. Tępo zakończone DNA jest znakowane biotynylowanym dUTP na jego końcu hydroksylowym 3' przez końcową transferazę, podczas gdy lepki zakończony DNA jest hybrydyzowany z biotynylowanymi komplementarnymi oligonukleotydami przez ligazę DNA. Wreszcie, mikroprzepływowy przepływ ścinający sprawia, że pojedyncze cząsteczki DNA rozciągają się do pełnej długości konturu po zabarwieniu fluorescencyjnym peptydem wiążącym białko-DNA (FP-DBP).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja dużych cząsteczek DNA uwiązanych na powierzchni szkła lub koralików została wykorzystana do badania interakcji DNA-białko, dynamiki białek na podłożu DNA,1,2 i fizyki polimerów. 3,4 Platforma dla dużych cząsteczek DNA na uwięzi ma kilka wyraźnych zalet w porównaniu z innymi metodami immobilizacji DNA. 5 Po pierwsze, duża cząsteczka DNA uwiązana na powierzchni ma naturalną konformację losowej cewki bez przepływu ścinającego, co jest niezwykle ważne, aby białko wiążące DNA rozpoznało swoje miejsce wiązania. Po drugie, bardzo łatwo jest zmienić środowisko chemiczne wokół cząsteczek DNA, aby wywołać szereg reakcji enzymatycznych w komorze przepływowej. Po trzecie, mikroprzepływowy przepływ ścinający indukuje rozciąganie molekularne DNA do 100% pełnej długości konturu, co jest bardzo trudne do osiągnięcia przy użyciu alternatywnych metod wydłużania DNA, takich jak unieruchomienie powierzchni6 i uwięzienie w nanokanałach. 7 W pełni rozciągnięta cząsteczka DNA dostarcza również informacji o położeniu, które mogą być przydatne do monitorowania ruchów enzymatycznych na mapie genomowej.

Niemniej jednak, podejście do wiązania DNA ma krytyczną wadę polegającą na tym, że barwnik interkalacyjny, taki jak YOYO-1, zazwyczaj powoduje, że cząsteczki DNA na uwięzi są łatwo rozbijane przez światło wzbudzające fluorescencję. Ogólnie rzecz biorąc, duże cząsteczki DNA muszą być barwione barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. W tym celu stosuje się przede wszystkim barwniki z serii YOYO-1 lub inne TOTO, ponieważ barwniki te fluoryzują tylko wtedy, gdy interkalują dwuniciowe DNA. 8 Wiadomo jednak, że barwnik interkalacyjny bis-powoduje fotorozszczepienie DNA wywołane światłem z powodu interkalacji fluoroforów. 9 Co więcej, fluorescencyjnie barwione cząsteczki DNA uwiązane na powierzchni są bardziej kruche, ponieważ przepływy ścinające mogą wywierać siły niszczące na swobodnie poruszające się cząsteczki DNA. W związku z tym opracowaliśmy FP-DBP jako nowatorski barwnik białkowy barwiący DNA do obrazowania dużych cząsteczek DNA uwięzionych na powierzchni. Zaletą stosowania FP-DBP jest to, że nie powoduje fotorozszczepienia cząsteczek DNA, z którymi się wiąże. 10 Ponadto FP-DBP nie zwiększa długości konturu DNA, podczas gdy barwniki bi-interkalacyjne zwiększają długość konturu o około 33%.

Ta metoda wideo wprowadza eksperymentalne podejście do wiązania dużych cząsteczek DNA z powierzchnią PEG-biotyny. Rysunek 1 ilustruje różne podejścia do wiązania DNA na uwięzi za pomocą i lepkich końców. Tak więc ta metoda barwienia może być stosowana do każdego rodzaju cząsteczki DNA. Rysunek 2 przedstawia schematyczne przedstawienie zespołu komory przepływowej, która może być sterowana przez pompę strzykawkową w celu generowania przepływów ścinających w celu rozciągnięcia cząsteczek DNA, a także załadowania roztworów chemicznych i enzymatycznych. Rysunek 3 przedstawia mikrofotografie w pełni rozciągniętych cząsteczek DNA uwiązanych na powierzchni PEGylowanej11 i wybarwionych FP-DBP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biotynylacja DNA

  1. Biotynylacja tępo zakończonego DNA za pomocą transferazy końcowej (TdT)
    Uwaga: Użyj DNA T4 (166 kbp), które jest DNA o końcu.
    1. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 5 μl 2,5 mM CoCl2, 5 μl 10× buforu reakcyjnego, 0,5 μl 10 mM biotyny-11-dUTP, 0,5 μl transferazy końcowej (10 jednostek) i 0,5 μl DNA T4 (0,5 μg/μl). Uzupełnić do końcowej objętości 50 μl przez dodanie 38,5 μl wody.
    2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godz.
      Uwaga: Wydłużony czas reakcji może prowadzić do powstania podwójnie uwiązanego DNA, tj. możliwe jest, że biotyny są znakowane na obu końcach.
    3. Zatrzymaj reakcję, dodając 5 μl 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C.
  2. Biotynylacja lepkiego zakończonego DNA za pomocą ligazy DNA
    Uwaga: Użyj λ DNA (48,5 kbp), które jest DNA o lepkim końcu.
    1. Dodać 1 μl ligazy DNA T4, 5 μl 10× buforu ligacyjnego, 1 μl 25 ng/μl λ DNA fagowego i dodać 43 μl wody, aby uzyskać końcową objętość 50 μl.
    2. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C.

2. Funkcjonalizowana derywatyzacja powierzchni

Uwaga: Aby przywiązać koniec cząsteczki DNA do powierzchni szkła, na szkiełku nakrywkowym silanizuje się pierwszorzędową grupę aminową, po której następuje powłoka biotynowo-PEG, jak pokazano na rysunku 1. Ten proces pegylacji jest ważny dla obrazowania pojedynczej cząsteczki DNA, ponieważ może znacznie zmniejszyć losowy szum tworzony przez przyczepienie się niepożądanych cząsteczek do powierzchni.

  1. Piranha Cleaning
    Uwaga: Roztwory Piranha energicznie reagują z materiałami organicznymi, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie, przestrzegając odpowiednich wytycznych dotyczących bezpieczeństwa.
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe na stojaku z politetrafluoroetylenu (PTFE) i przytrzymaj je za pomocą taśmy uszczelniającej z gwintem PTFE wzdłuż, połowę na krawędzi powierzchni, a połowę na stojaku. Po owinięciu pozostaw długi kawałek (~ 5 cm) taśmy do przenoszenia stojaka podczas procedury czyszczenia.
    2. Napełnić szklaną zlewkę o pojemności 1 l 350 mlH2SO4 i 150 mlH2O2w celu przygotowania roztworu piranii w dygestorium. Umieść stojak w roztworze piranii na 2 godziny.
    3. Opróżnij roztwór piranii ze zlewki i dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną, aż pH wody w zlewce osiągnie wartość neutralną. Użyj pasków papieru pH.
    4. Sonikować stojaki szkiełek nakrywkowych w zlewce zawierającej wodę przez 30 minut. Opróżnij wodę ze zlewki tuż przed silanizacją aminokwasów. Użyj 75 W mocy sonikacji do czyszczenia i derywatyzacji szklanych podłoży.
  2. Aminozylanizacja na powierzchni szkła
    1. Dodać 2 ml N-[3-(trimetoksysililo)propylo]etylenodiaminy i 10 ml lodowatego kwasu octowego do 200 ml alkoholu metylowego w czystym pojemniku polipropylenowym w celu przygotowania roztworu aminozylanizacji.
    2. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe umieścić w pojemniku z polipropylenu. Potrząsaj nimi z prędkością 100 obr./min i temperaturą pokojową przez 30 min.
    3. Sonikować zlewkę z derywatyzowanymi szkiełkami nakrywkowymi przez 15 minut przy 75 W. Potrząsać nimi z prędkością 100 obr./min i w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
    4. Opróżnij roztwór ze zlewki i dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe, raz alkoholem metylowym, a dwa razy alkoholem etylowym. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w alkoholu etylowym i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
  3. PEGylacja szkiełka nakrywkowego
    1. Przygotować 10 ml 0,1 M wodorowęglanu sodu (NaHCO3). Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    2. Rozpuścić 2 mg węglanu biotyny-PEG-sukcynimidylu (biotyna-PEG-SC) i 80 mg walerianianu PEG-sukcynimidylu (mPEG-SVG) w 350 μl NaHCO3. Użyj rurki chroniącej przed światłem.
    3. Energicznie wirować probówkę przez 10 sekund i odwirowywać ją w temperaturze 10 000 × g przez 1 minutę, aby usunąć pęcherzyki.
    4. Opłucz szkiełko szklane acetonem, a następnie spłucz alkoholem etylowym. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
    5. Umieść kroplę (50 μl) roztworu PEG na czystym szkiełku podstawowym. Delikatnie przykryj kroplę amino silanizowanym szkiełkiem nakrywkowym, nie wytwarzając żadnych pęcherzyków.
    6. Umieść szkiełka na 3 godziny do nocy w ciemnej, dobrze wypoziomowanej, wilgotnej komorze o temperaturze pokojowej. Użyj pustego uchwytu końcówki pipety jako komory, z wodą na dnie. Zamknąć resztki roztworu PEG w probówce i utrzymywać go w temperaturze 4 °C.
    7. Dokładnie spłucz pegylowane szkiełko nakrywkowe wodą dejonizowaną. Przechowuj go w ciemnym i suchym miejscu do czasu użycia.

3. Montaż komory przepływowej

  1. Wykonaj dziurkowany uchwyt akrylowy, jak na rysunku 2. Upewnij się, że średnica wkładki rurki wynosi 0.762 mm i oznacz jeden otwór jako wlot, a drugi jako wylot (Rysunek 2).
  2. Umieść dwustronne paski taśmy klejącej (szerokość 5-6 mm) na akrylowym uchwycie (Rysunek 2), wyrównując prostopadle do otworu wlotowego i wylotowego, nie naruszając żadnych otworów kanałowych. Użyj tych pasków taśmy jako ścian wielokanałowych do wykonania komór. Wyszoruj taśmę za pomocą końcówki do pipety.
  3. Umieść PEGylowane szkiełko nakrywkowe na górze, aby utworzyć komory przepływowe, stroną PEGylowaną skierowaną w dół.
  4. Aby zapobiec wyciekaniu roztworu, dociśnij górną część szkiełka nakrywkowego do obszaru, w którym umieszczane są taśmy dwustronne. Dodaj szybkoschnący klej epoksydowy, aby zamknąć krawędzie komory u góry i u dołu (żółty kolor na rysunku 2).
  5. Podłącz krótki kawałek (2,5 cm) rurki (średnica zewnętrzna, OD, 0,042") do gazoszczelnej strzykawki i uszczelnij złącze klejem epoksydowym.
  6. Podłącz długą elastyczną rurkę (OD: 0,03") do rurki połączonej ze strzykawką i uszczelnij złącze klejem epoksydowym.
  7. Napełnij rurkę połączoną ze strzykawką wodą demineralizowaną. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
  8. Włóż rurkę do otworu w komorze przepływowej uszczelnionego klejem epoksydowym.
  9. Umieść żółtą końcówkę (końcówkę 200 μl) na drugim otworze jako zbiornik.

4. Ładowanie próbki do komory przepływowej

Uwaga: Neutrawidyna może być zastąpiona innymi białkami awidyny, takimi jak streptawidyna. Wszystkie reakcje można przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że jest to wymienione. Pobrać próbkę roztworu w żółtej końcówce i zainstalować końcówkę z roztworem w otworze akrylowego uchwytu (Rysunek 2b).

  1. Ustawić natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 50 μl/min. Załadować 20 μl białka awidyny (25 μg/ml w roztworze T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8) i utrzymywać przez 10 minut.
  2. Załaduj 20 μl biotynylowanych oligodeoksynukleotydów (100 μM w 1× TE) i trzymaj przez 10 minut. Jeśli używana jest transferaza końcowa, pomiń ładowanie oligodeoksynukleotydów.
  3. Załadować 20 μl roztworu DNA z etapu 1 do komory przepływowej z prędkością przepływu 10 μl/min i przechowywać przez 30 minut.
  4. Przemyć komorę przepływową 1× TE i załadować 40 μl FP-DBP10 (~80 nM).
  5. Obserwuj DNA pod mikroskopem fluorescencyjnym z ciągłym przepływem cząsteczek barwiących w 1× TE na soczewce obiektywowej 60X. Użyj lasera półprzewodnikowego 488 nm do wzbudzenia FP(eGFP)-DBP. Aby uzyskać pełną rozciągliwość cząsteczek DNA, zastosuj różne prędkości przepływu w zależności od użytych długości DNA. Na przykład zastosuj 50 μl/min dla 48,5 kbp λ DNA i 100 μl/min dla 166 kb DNA T4.
    1. W celu recyklingu akrylowego uchwytu namocz zmontowane komory przepływowe w roztworze detergentu do użytku domowego12. Usuń taśmy i żywicę epoksydową żyletką i przetrzyj rękami, aby całkowicie je zdjąć. Odblokuj otwory za pomocą igieł strzykawkowych. Trzymaj uchwyty w wodzie dejonizowanej do czasu dalszego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje dwie różne metody wiązania DNA w zależności od końcowych struktur cząsteczki DNA. Rysunek 1a ilustruje, w jaki sposób lepkie cząsteczki DNA są hybrydyzowane z komplementarnymi biotynylowanymi oligonukleotydami, które są unieruchomione na powierzchni PEG pokrytej awidyną. Rysunek 1b przedstawia dodanie biotynylowanego ddNTP lub dNTP do grupy hydroksylowej 3' tępo zakończonego DNA przez transferazę końcową. Dodaliśmy elas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj platformę do wizualizacji długich cząsteczek DNA biotynylowanych w celu zakotwiczenia na powierzchniach. Opisaliśmy podejście do cząsteczek DNA uwiązanych na powierzchni pokrytej białkiem awidyny biotynylowaną albuminą surowicy bydlęcej. 6 We wcześniejszym podejściu znaleźliśmy kluczowy problem fotorozszczepienia DNA spowodowany przez barwniki bis-interkalacji, które barwią cząsteczki DNA uwięzione na powierzchni. Ponieważ te stale wzbudzane fluorofory mają wysokie prawdopodobieństwo zaatako...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Sogang University Research Grant z 201410036.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Biotynylacja DNA
1.1) Biotynylacja końca DNA przy użyciu transferazy końcowej (TdT)
Terminal TransferazaNew England BiolabsM0315SWyposażony w 10-krotny bufor reakcyjny, 2,5 mM chlorek kobaltu
Biotin-11-dUTPInvitrogenR0081Biotin-ddNTP jest również dostępny
T4GT7 Phage DNANippon Gene318-03971
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichE6758EDTA
1.2) Biotynylacja lepkiego końca DNA za pomocą DNA Ligaza
T4 Ligaza DNANew England BiolabsM0202S Dostarczanyz 10x buforem reakcyjnym
Lambda Phage DNABioneerD-2510Dostępne również w New England Biolabs
2. Funkcjonalizowana derywatyzacja powierzchniowa
2.1) Piranha Cleaning
CoverslipMarienfeld-Superior010105022 mm x 22 mm, nr 1 Grubość
stojaka teflonowegoProdukcja na zamówienie
Taśma uszczelniająca gwint PTFEHan Yang Chemical Co., Ltd.3032292Teflon i taśma handlowa
Kwas siarkowyJin Chemical Co. Ltd.S280823H2SO4, 95% czystości
Nadtlenek wodoruJin Chemical Co. Ltd.H290423H2O2, 35% w wodzie
SonicatorDaihan Scientific Co. Ltd.WUC-A02HStołowa myjka
2.2) Aminosilanizacja na powierzchni szkła
N-[3-(Trimethoxysililo)propyl]
etylenodiamina		Sigma-Aldrich104884
Lodowaty kwas octowyDuksan Chemicals41499% czystości
Alkohol metylowyJin Chemical Co., Ltd.M300318czystości 99,9%
QorpakPLC-04907
Alkohol etylowyJin Chemical Co., Ltd.A30020299,9% czystości
2.3) PEGylacja szkiełka nakrywkowego
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Filtr strzykawkowySartorius16534----------K
Biotin-PEG-SCLaysan BioBiotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVGLaysan BioMPEG-SVA-5000
AcetonJin Chemical Co., Ltd.A300129o czystości 99%
Marienfeld-Superior1000612~ 76 mm x 26 mm x 1  mm
3. Montaż komory przepływowej< / mocnego>
akrylowego wspornikaProdukcja na zamówienie
Taśma dwustronna3MPrzezroczysty typ
Szybkoschnąceepoksydowe 3M
Cole-Parmer06417-11, 06417-21
Gazoszczelne 250 µ l StrzykawkaHamilton81165
Pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
4. Ładowanie próbki do komory przepływowej
NeutravidinThermo Scientific31000
Tris baseSigma-AldrichT1503-5KGTrizma base
MikroskopOlympusIX70
EMCCD CameraQ Imaging RoleraEM-C2
Laser na ciele stałym (488  nm)OxxiusLBX488
Alconox AlconoxInc.
ultradźwiękowa Pojemnik polipropylenowy o Szkiełka mikroskopowe rurki polietylenowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescent Protein DNA Binding PeptideDNA VisualizationSurface tethered DNA MoleculesBiotinylated DNAAvidin Protein LinkersPolyethylene Glycol CoatingMicrofluidic Shear FlowFluorescent MicroscopyDNA StretchingFlow Chamber Assembly

Powiązane artykuły