Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

DOI:

10.3791/54142

⸱

19 czerwca 2016

 ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning, Beijing Normal University, 2Department of Biomedical Science, The University of Sheffield

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odpowiedzi napięciowe fotoreceptorów owadów i interneuronów wzrokowych mogą być dokładnie rejestrowane za pomocą konwencjonalnych ostrych mikroelektrod. Opisana tutaj metoda umożliwia badaczowi pomiar długotrwałych (od minut do godzin) wysokiej jakości odpowiedzi wewnątrzkomórkowych z pojedynczych fotoreceptorów Drosophila R1-R6 i dużych komórek monopolarnych (LMC) na bodźce świetlne. Ponieważ system rejestracji charakteryzuje się niskim poziomem szumów, może być używany do badania zmienności między poszczególnymi komórkami w oku muchy oraz tego, jak ich wyniki odzwierciedlają fizyczne właściwości środowiska wizualnego. Przedstawiamy wszystkie kluczowe kroki w wykonywaniu tej techniki. Opisano podstawowe etapy konstruowania odpowiedniego zestawu elektrofizjologicznego do rejestracji, takie jak projektowanie i dobór aparatury doświadczalnej. Wyjaśniamy również, jak przygotować się do nagrania, wykonując odpowiednie (ostre) elektrody rejestrujące i () elektrody referencyjne. Podano szczegółowe informacje na temat tego, jak zamocować nienaruszoną muchę w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na muchy, przygotować małe okienko w jej oku i włożyć elektrodę rejestrującą przez ten otwór przy minimalnych uszkodzeniach. Wyjaśniamy, jak zlokalizować środek pola recepcyjnego komórki, dostosować badaną komórkę do ciemności lub światła oraz rejestrować jej reakcje napięciowe na dynamiczne bodźce świetlne. Na koniec opisujemy kryteria stabilnych normalnych zapisów, pokazujemy charakterystyczne wysokiej jakości odpowiedzi napięciowe poszczególnych komórek na różne bodźce świetlne i pokrótce określamy, jak określić ilościowo ich wydajność sygnalizacyjną. Wiele aspektów tej metody jest technicznie trudnych i wymaga praktyki i cierpliwości do opanowania. Jednak po poznaniu i zoptymalizowaniu pod kątem celów eksperymentalnych badacza, zapewnia znakomite dane neurofizjologiczne in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko złożone muszki owocowej (Drosophila melanogaster) jest doskonałym modelem do badania funkcjonalnej organizacji matryc fotoreceptorów i interneuronów do próbkowania i przetwarzania obrazów neuronowych oraz do widzenia zwierząt. System ma najbardziej kompletny schemat połączeń1,2 i jest przyjazny dla manipulacji genetycznych i dokładnego monitorowania aktywności neuronalnej (o wysokim stosunku sygnału do szumu i rozdzielczości czasowej)3-10.

Oko Drosophila jest modułowe, zawiera ~750 pozornie regularnych struktur z soczewkami zwanych ommatidia, które razem zapewniają muchy panoramiczne pole widzenia, które obejmuje prawie każdy kierunek wokół jej głowy. Podstawowymi jednostkami próbkowania informacji w oku są jego fotoreceptory rabdomeryczne7,8,11. Każde ommatidium zawiera osiem komórek fotoreceptorowych (R1-R8), które mają tę samą soczewkę fasetową, ale są ustawione w siedmiu różnych kierunkach. Podczas gdy zewnętrzne fotoreceptory R1-R6 są najbardziej wrażliwe na światło niebiesko-zielone, czułość spektralna wewnętrznych komórek R7 i R8, które leżą jedna na drugiej i wskazują ten sam kierunek, wykazują trzy charakterystyczne podtypy: blady, żółty i obszar brzegu grzbietowego (DRA)12-15.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Funkcjonalna organizacja oka Drosophila. (A) Dwa pierwsze zwoje nerwu wzrokowego, siatkówka i blaszka, są podświetlone na szaro wewnątrz oka muchy. Fotoreceptory siatkówki R1-R6 i duże komórki monopolarne blaszki (LMC: L1-L3) są łatwo dostępne in vivo dla konwencjonalnych zapisów ostrych mikroelektrod. Schematyczna elektroda podkreśla normalną ścieżkę do nagrania od R1-R6 w siatkówce. Jedną ze ścieżek do nagrania z LMC w blaszce jest równoległe przesunięcie elektrody w lewo. (B) Blaszka to matryca retinotopowo zorganizowanych wkładów, z których każdy jest wypełniony neuronami, które przetwarzają informacje z określonego małego obszaru w przestrzeni wizualnej. Ze względu na superpozycję neuronalną, sześć fotoreceptorów z różnych sąsiednich ommatidów wysyła swoje aksony (R1-R6) do tego samego wkładu blaszki, tworząc histaminergiczne synapsy wyjściowe do L1-L3 i komórki amakrynowej (Am). (C) Rozprzestrzenianie się informacji neuronalnej między zakończeniami aksonów R1-R6 a interneuronami wzrokowymi (w tym L4, L5, Lawf, C2, C3 i T1) wewnątrz wkładu blaszki jest złożone. (D) Aksony fotoreceptorów R1-R6 otrzymują synaptyczne sprzężenia zwrotne z komórek monopolarnych L2 i L4. (B) i (C) zmodyfikowane z Rivera-alba i wsp.2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oko Drosophila jest typusuperpozycji neuronalnej 16. Oznacza to, że sygnały neuronalne ośmiu fotoreceptorów należących do siedmiu sąsiednich ommatidiów, które patrzą na ten sam punkt w przestrzeni, są łączone razem w jednym kartridżu nerwowym w dwóch następnych neuropilach: blaszce i rdzeniu. Podczas gdy sześć zewnętrznych fotoreceptorów R1-R6 rzutuje swoje zakończenia aksonów na kolumny nerwowe w blaszce (ryc. 1), komórki R7 i R8 omijają tę warstwę i nawiązują kontakty synaptyczne z odpowiadającą im kolumną rdzenia17-19. Te dokładne okablowanie wytwarza podłoże neuronalne do retinotopowego mapowania wczesnego widzenia much, po czym każda blaszka (ryc. 1A-C) i kolumna rdzenia (wkład) reprezentują pojedynczy punkt w przestrzeni.

Bezpośrednie dane wejściowe z fotoreceptorów R1-R6 są odbierane przez duże komórki monopolarne (LMC: L1, L2 i L3) oraz komórkę amakrynową (Am) w blaszce1,2,20. Spośród nich L1 i L2 są największymi komórkami, pośredniczącymi w głównych ścieżkach informacyjnych (rysunek 1D), które reagują na ruchome krawędzie w przód i w dół, a tym samym stanowią podstawę obliczeniową detektora ruchu21,22. Eksperymenty behawioralne sugerują, że przy pośrednim kontraście dwie ścieżki ułatwiają percepcję ruchu w przeciwnych kierunkach: tyłem do przodu w komórkach L1 i przód-tył w komórkach L223,24. Łączność sugeruje ponadto, że neurony L4 mogą odgrywać kluczową rolę w komunikacji bocznej między sąsiednimi wkładami25,26. Wzajemne synapsy znaleziono między komórkami L2 i L4 znajdującymi się w tym samym i dwóch sąsiednich wkładach. W dalszej części każda komórka L2 i trzy powiązane z nią komórki L4 rzutują swoje aksony na wspólny cel, neuron Tm2 w rdzeniu, gdzie, jak się uważa, dane wejściowe z sąsiednich wkładów są zintegrowane w celu przetwarzania ruchu przód-tył27. Chociaż neurony L1 otrzymują dane wejściowe z L2 z tego samego wkładu zarówno za pośrednictwem połączeń szczelinowych, jak i synaps, nie są one bezpośrednio połączone z L4, a tym samym z sąsiednimi wkładami blaszkowymi.

Synaptyczne sprzężenia zwrotne do aksonów fotoreceptorów R1-R6 są dostarczane tylko przez neurony należące do obwodów L2/L4, ale nie do szlaku L11,2 (Rysunek 1D). Podczas gdy połączenia tych samych wkładów są selektywnie od L2 do R1 i R2 oraz od L4 do R5, wszystkie fotoreceptory R1-R6 otrzymują synaptyczne sprzężenie zwrotne z L4 jednego lub obu sąsiednich wkładów. Ponadto istnieją silne połączenia synaptyczne od Am do R1, R2, R4 i R5, a komórki glejowe są również synaptycznie połączone z siecią i mogą w ten sposób uczestniczyć w neuronalnym przetwarzaniu obrazu6. Wreszcie, aksonalne połączenia szczelinowe, łączące sąsiednie R1-R6 oraz między fotoreceptorami R6 i R7/R8 w blaszce, przyczyniają się do asymetrii reprezentacji i przetwarzania informacji w każdym kartridżu14,20,28.

Wewnątrzkomórkowe zapisy napięcia z pojedynczych fotoreceptorów i interneuronów wzrokowych u prawie nienaruszonych Drosophila dostarczają danych o wysokim stosunku sygnału do szumu w rozdzielczości submilisekundowej3,5,7-10,29, co jest niezbędne do zrozumienia szybkich obliczeń neuronowych między połączonymi neuronami. Ten poziom precyzji jest niemożliwy do osiągnięcia przy obecnych technikach obrazowania optycznego, które są znacznie głośniejsze i zwykle działają w rozdzielczości 10 - 100 ms. Ponadto, ponieważ elektrody mają bardzo małe i ostre końcówki, metoda nie ogranicza się do ciał komórek, ale może zapewnić bezpośrednie zapisy z małych aktywnych struktur nerwowych; takie jak drzewa dendrytyczne LMC lub aksony fotoreceptorów, do których nie można uzyskać dostępu za pomocą znacznie większych końcówek elektrod krosowych. Co ważne, metoda ta jest również strukturalnie mniej inwazyjna i szkodliwa niż większość zastosowań patch-clamp, a więc w mniejszym stopniu wpływa na środowisko wewnątrzkomórkowe badanych komórek i pobieranie próbek informacji. W ten sposób konwencjonalne techniki ostrych mikroelektrod przyczyniły się i nadal przyczyniają się do fundamentalnych odkryć i oryginalnych spostrzeżeń w zakresie przetwarzania informacji neuronowych w odpowiedniej skali czasowej; Poprawa naszego mechanistycznego rozumienia widzenia3-10.

Ten artykuł wyjaśnia, jak w laboratorium Juusola przeprowadzane są wewnątrzkomórkowe zapisy in vivo z fotoreceptorów Drosophila R1-R6 i LMC. Protokół ten opisuje, jak skonstruować odpowiedni zestaw do elektrofizjologii, przygotować muchę i wykonać nagrania. Przedstawiono pewne reprezentatywne dane oraz omówiono niektóre typowe problemy i potencjalne rozwiązania, które można napotkać podczas korzystania z tej metody.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Sheffield i Uniwersytetu Normalnego w Pekinie.

1. Przygotowanie odczynników i sprzętu

  1. Konfiguracja sprzętu do nagrywania i stymulacji światłem
    1. Wybierz obszar nagrywania o wymiarach co najmniej 2,5 x 2,5 m do przeprowadzania eksperymentów elektrofizjologicznych w pomieszczeniu wyposażonym w klimatyzację z regulowaną wilgotnością i środkami zapewniającymi ciemne warunki nagrywania. Upewnij się, że obszar ten jest wystarczająco duży, aby wygodnie zmieścić się: (i) stół wibroizolacyjny o wymiarach 1 x 1 m, w którym znajduje się zestaw [aparatura do stymulacji i rejestracji much], mikroskop stereoskopowy i źródło zimnego światła z dwoma gęsimi szyjami, a wszystko to zamknięte w dużej klatce Faradaya o wysokości >180 cm; (ii) szafa rackowa 38U do umieszczenia komputera osobistego z płaskim monitorem LCD, wzmacniaczem mikroelektrod, sterownikami LED, filtrami, jednostkami kontrolującymi temperaturę, oscyloskopami i innymi wymaganymi przyrządami elektrycznymi; oraz (iii) małe biurko i krzesło dla prowadzącego dochodzenie.
    2. Umieść platformę z dala od źródeł hałasu elektrycznego i mechanicznego, takich jak lodówki, wirówki i windy. Użyj oddzielnych ochronników przeciwprzepięciowych, aby chronić urządzenia elektryczne platformy przed voltage skoki występujące w sieci. Najlepiej podłączyć platformę do własnego zasilacza awaryjnego (akumulatora UPS), aby zminimalizować hałas.
    3. Zbuduj stożkowy uchwyt na muchy z mosiądzu i czarnego tworzywa sztucznego (Rysunek 2). Wywierć mały stożkowy otwór w mosiężnej jednostce z zewnętrznym brzegiem zwężającym się do średnicy ~0,8 mm (pasującej do szerokości klatki piersiowej typowej muchy).
      Uwaga: Ten otwór musi zwężać się w kierunku końcówki uchwytu na muchy, aby większa niż przeciętna Drosophila, która jest wyrzucana od dołu przez przepływ powietrza, utknęła po ramiona na górnej krawędzi.
    4. Zaprojektuj i zbuduj mechanicznie wytrzymałą, a jednocześnie precyzyjną aparaturę do stymulacji i rejestracji much (ryc. 3). Zbuduj z aluminium lub mosiądzu (metale o wysokiej przewodności) słup platformy do przygotowania much, a wokół niego system ramienia Cardan, z osadzonymi łożyskami kulkowymi, aby zapewnić płynne i dokładne pozycjonowanie x,y i blokowanie bodźca świetlnego.
      Uwaga: Ta zintegrowana konstrukcja kompozytowa minimalizuje drgania mechaniczne, które w przeciwnym razie mogłyby spowodować wysunięcie końcówki elektrody rejestrującej z badanego ogniwa. Może on ponadto zawierać system kontroli temperatury oparty na elemencie Peltiera w zamkniętej pętli, umożliwiając badaczom wykorzystanie wrażliwych na temperaturę konstruktów genetycznych, takich jak shibireTS, do oceny obliczeń obwodów synaptycznych9,30. Anoduj urządzenie lub pomaluj je na czarno, aby zminimalizować rozpraszanie bodźców świetlnych.
      1. Zamocuj aparat do stymulacji i rejestracji muchy na płytce stykowej stołu antywibracyjnego, na przykład za pomocą M6, używając metrycznych otworów na. Użyj czarnej płytki do krojenia chleba lub przykryj ją czarną tkaniną, aby zminimalizować rozproszenie światła podczas eksperymentów.
      2. Ustaw i zablokuj (za pomocą blokującej) regulowany w pionie drążek platformy do przygotowania muchy w środku systemu ramienia Cardan. Umieść preparat do muchy (w uchwycie na muchy, patrz krok 2) na słupie platformy tak, aby źródło światła przymocowane do ramienia Cardana promieniowo skierowało się na głowę muchy. Upewnij się, że środek oczu muchy znajduje się dokładnie w punkcie przecięcia (0, 0) osi x i y ramienia Cardan, ponieważ umożliwia to dokładne ustawienie bodźca świetlnego x,y w dowolnym punkcie w polu widzenia muchy.
        Uwaga: Ta funkcja jest niezbędna do mapowania właściwości odpowiedzi poszczególnych komórek na określone lokalizacje oka; Na przykład, gdy poszukuje się elektrofizjologicznych dowodów na adaptacje strukturalne, takie jak jasne lub ostre strefy, które wykazywałyby odpowiednio rosnącą czułość lub rozdzielczość31.
    5. Zamontuj mikroskop stereoskopowy za aparatem do stymulacji i rejestracji muchy na stole antywibracyjnym tak, aby zapewniał komfortowe oglądanie oka muchy w dużym powiększeniu.
    6. Zamontuj źródło zimnego światła na górze mikroskopu z półsztywnymi prowadnicami światła na gęsiej szyi z podwójną głowicą źródła światła skierowanymi w dół w kierunku uchwytu do przygotowania much. Swobodnie poruszające się dwuwiązkowe podświetlenie ułatwia wizualizację końcówki elektrody rejestrującej podczas wprowadzania jej przez mały otwór do oka muchy.
    7. Przymocuj odpowiedni zestaw mikromanipulatorów x,y,z (zgrubny i dokładny) do elektrody rejestrującej i stopnia czołowego na stole antywibracyjnym, po prawej stronie aparatu do stymulacji i rejestracji much, za pomocą M6 lub podstawek magnetycznych.
      Uwaga: W laboratorium Juusola różne platformy są wyposażone w różne manipulatory; Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów i odczynników. Wszystkie one zapewniają wysokiej jakości nagrania wewnątrzkomórkowe.
    8. Zamontuj mały ręczny 3-osiowy mikromanipulator do uchwytu elektrody referencyjnej na regulowanej w pionie tyczce platformy do przygotowania much. Ustaw elektrodę odniesienia tak, aby była skierowana w stronę preparatu muchowego.
    9. Zbuduj wolnostojącą, osłoniętą światłem klatkę Faradaya ze stalowych paneli wokół stołu antywibracyjnego, otaczając aparaturę do stymulacji i nagrywania much, aby zapobiec zewnętrznym zakłóceniom elektromagnetycznym. Pozostaw przód klatki otwarty, zapewniając dostęp do transportu muchy przygotowanej do eksperymentów. Przymocuj czarne zasłony z tkaniny (z wszczepioną w nie miedzianą lub aluminiową siatką w celu uziemienia) z przodu, aby osłonić przed hałasem i światłem. Pomaluj wnętrze klatki na czarno, aby zminimalizować rozproszenie światła i przykręć stopy klatki do podłogi, aby zapobiec wibracjom.
    10. Podłącz wyjścia napięciowe i prądowe wewnątrzkomórkowego wzmacniacza mikroelektrodowego o wysokiej impedancji do wejść dwóch oddzielnych filtrów dolnoprzepustowych (Bessel lub podobnych) za pomocą BNC. Podobnie, podłącz wyjścia filtra do odpowiednich kanałów bloków/płytek złączy AD systemu akwizycji danych (karty DA/AD). Podłącz kartę (karty) DA/AD do komputera osobistego za pomocą specjalistycznych, zgodnie z instrukcjami dostawcy.
    11. Zainstaluj na komputerze osobistym odpowiednie oprogramowanie do gromadzenia danych dla wybranego systemu akwizycji danych. Upewnij się, że sterowniki pobierania danych są zgodne z systemem operacyjnym komputera osobistego.
    12. Uziemić elektrycznie aparat do stymulacji i rejestracji much, klatkę Faradaya, miedzianą siatkę (w zasłonach), mikroskop, mikromanipulatory, źródło zimnego światła, stojak na sprzęt 38U ze wszystkimi jego instrumentami (wzmacniacz wewnątrzkomórkowy, filtry, jednostkę kontrolującą temperaturę, monitor PC i LCD itp.) do jednego centralnego punktu uziemienia za pomocą przewodu uziemiającego sprzętu i końcówek uziemiających pierścienia zaciskanego M6. Użyj multimetru elektrycznego, aby sprawdzić, czy wszystkie części znajdują się w tym samym podłożu.
      Uwaga: Aby osiągnąć najlepsze możliwe warunki nagrywania przy niskim poziomie szumów, konfiguracje uziemienia zwykle różnią się w zależności od konfiguracji.
      1. W razie potrzeby podłącz centralny punkt uziemienia dalej do uziemienia budynku i/lub centralnego uziemienia mikroelektrody amplifier. Po przetestowaniu w pełni działającego systemu podczas rzeczywistych eksperymentów elektrofizjologicznych, należy być przygotowanym na zmianę konfiguracji uziemienia w razie potrzeby, aby zminimalizować szumy w nagraniach.
    13. Skonfiguruj programowe wzmocnienie (1 - 10X), filtrowanie sygnału (zazwyczaj filtry dolnoprzepustowe ustawione na 500 Hz, które są odpowiednie zarówno dla danych R1-R6, jak i LMC) oraz częstotliwość próbkowania (co najmniej 1 KHz). Upewnij się, że ustawienia są zgodne z twierdzeniem o próbkowaniu Nyquista-Shannona32; Na przykład podczas pobierania danych, które są filtrowane dolnoprzepustowo przy 500 Hz, należy użyć częstotliwości próbkowania 1 kHz lub wyższej, aby zminimalizować efekty aliasingu.
      1. Ponieważ charakterystyczne odpowiedzi napięciowe fotoreceptorów R1-R6 wynoszą 40 - 65 mV, a LMC 20 - 45 mV, należy odpowiednio ustawić skale wzmocnienia i wyświetlania, aby umożliwić próbkowanie w wysokiej rozdzielczości i wizualizację danych.

figure-protocol-1
Rysunek 2.Stożkowy uchwyt na muchy. Uchwyt na muchy składa się z dwóch części: centralnej mosiężnej jednostki i stożkowej czarnej powłoki z tworzywa sztucznego. Centralny otwór wewnątrz mosiężnej jednostki zwęża się do niewielkiej średnicy, która ledwo przepuszcza muchę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 3.Przegląd platformy elektrofizjologicznej. Zestaw zawiera wolnostojącą, osłoniętą światłem klatkę Faradaya, stół antywibracyjny, aparaturę do stymulacji i rejestracji much oraz zasłony z czarnej tkaniny z miedzianą lub aluminiową siatką wewnątrz do uziemienia. Stojak na instrumenty jest elektrycznie podłączony do tego samego centralnego uziemienia, w którym znajduje się cały sprzęt wewnątrz klatki Faradaya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Wytwarzanie mikroelektrod
    1. Wyciągnąć mikroelektrodę referencyjną z rurki borokrzemianowej (średnica zewnętrzna: 1.0 mm; średnica wewnętrzna 0.6 mm) lub szkła kwarcowego (średnica zewnętrzna: 1.0 mm; średnica wewnętrzna 0.5, 0.6 lub 0.7 mm) za pomocą ściągacza do pipet. Spróbuj uzyskać krótkie, stopniowe zwężanie się.
      Uwaga: Dokładne ustawienia programu ściągacza do pipet różnią się w zależności od urządzenia; więcej szczegółów w Tabeli Materiałów i Regentów. Wielkość porów na końcówce nie jest kluczowa, ponieważ końcówka elektrody referencyjnej zostanie złamana przed włożeniem do preparatu muchowego.
    2. Wyciągnąć mikroelektrodę rejestrującą z rurki z włókna borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1.0 mm; średnica wewnętrzna 0.6 mm) lub szkła kwarcowego (średnica zewnętrzna: 1.0 mm; średnica wewnętrzna 0.5, 0.6 lub 0.7 mm) za pomocą ściągacza do pipet. Spróbuj uzyskać długie, drobne (10 - 15 mm) drobne stopniowe zwężenie.
    3. Sprawdź za pomocą mikroskopu świetlnego, czy elektrody rejestrujące wykazują prawidłowe zwężanie się. Zamontuj elektrodę na szkiełku podstawowym za pomocą kleju do formowania i użyj obiektywu pneumatycznego 40X, aby sprawdzić jej końcówkę.
      Uwaga: Dobra elektroda zwęża się płynnie, aż do niewidocznie małej końcówki, wokół której można zobaczyć ciągłe, równoległe, ciemniejsze i jaśniejsze wzory interferencyjne. Niektóre ustawienia ściągacza generują elektrody o wysokiej rezystancji, które nie mogą zapewnić udanej penetracji ogniw, ponieważ ich końcówki przypominają "trąbki". Dlatego ważna jest kontrola wzrokowa elektrod.
    4. Przymocuj elektrody poziomo na dużej szalce Petriego z plasteliną (lub podobnym klejem do formowania) w celu bezpiecznego przechowywania i transportu do stanowiska do elektrofizjologii. Upewnij się, że końcówki elektrod zawsze znajdują się w powietrzu i nie dotykają przypadkowo niczego.
    5. Tuż przed eksperymentem należy napełnić elektrody rejestrujące i referencyjne odpowiednim roztworem soli. Użyj małej strzykawki o pojemności 5 ml podłączonej do filtra cząstek stałych z drobną plastikową końcówką (takiej jak mikroładowarka).
      1. W przypadku eksperymentów z fotoreceptorami należy napełnić elektrodę rejestrującą do pełna (na jej dużym końcu tworzy się kropla) 3 M KCl, ponieważ takie rozwiązanie minimalizuje wpływ potencjału złącza cieczy na zarejestrowane napięcie.
      2. W celu zbadania histaminergicznych LMC, które reagują na wejście synaptyczne z fotoreceptorów R1-R6 poprzez zmiany przewodnictwa chlorkowego, należy wypełnić elektrody rejestrujące 3 M octanem potasu i 0,5 mM KCl, ponieważ roztwór ten ma mniejszy wpływ na baterię chlorków ogniwa. Napełnij elektrodę odniesienia Ringerem, zawierającym w mM: 120 NaCl, 5 KCl, 10 TES (C6H15NO6S), 1,5 CaCl2, 4 MgCl2 i 30 sacharozy5.
    6. Przetestuj rezystancję nowo wyciągniętej elektrody nagrywającej w systemie nagrywającym.
      1. Upewnij się, że srebrne przewody wewnątrz uchwytów elektrod są równomiernie pokryte chlorkiem srebra (wyglądającym na fioletowo-szary - nie błyszczący srebrzysty), aby zminimalizować artefakty nagrywania (takie jak dryf potencjału złącza). Jeśli nie, zastąp je odpowiednio chlorowanymi drutami.
      2. W razie potrzeby chloryzuj nowe srebrne druty. Ostrożnie wyczyść przewody (szybko przepuszczając je przez płomień), aby miały jasny srebrny kolor. Unikaj dotykania ich palcami, aby osadzać się na równej warstwie AgCl. Namocz druty w domowym wybielaczu o pełnej mocy przez 15 - 30 minut, aż pojawią się na fioletowo-szarym kolorze. Alternatywnie, galwanizować każdy drut (ustawiając go dodatnio w stosunku do roztworu zawierającego 3 M KCl i przepuszczając przez niego prąd z szybkością 1 mA/cm2 powierzchni) przez 10 - 15 sekund, aż zostanie odpowiednio pokryty.
      3. Podłącz wypełnione z tyłu elektrody rejestrujące i referencyjne do ich uchwytów elektrod. Umieść małą wannę z roztworem Ringera na regulowanym w pionie drążku platformy do przygotowania much. Wbij końcówki elektrod do roztworu Ringera i zmierz rezystancję końcówki elektrody rejestrującej.
        Uwaga: Ten krok jest potrzebny tylko podczas testowania właściwości rezystancyjnych elektrod, które są pobierane z nowej partii szklanych rurek, lub podczas optymalizacji programów przyrządów do ściągania mikroelektrod poprzez iterację.
      4. Przed wykonaniem pomiarów rezystancji należy zapoznać się z instrukcjami zawartymi w ampinstrukcja obsługi producenta lifier w celu uzyskania odpowiednich ustawień pomiaru. Aby uzyskać dobrą elektrodę nagrywającą, miej rezystancję końcówki ~100 - 220 MΩ.

2. Przygotowanie Drosophila

  1. Zbierz 5-10 dniowe muchy (po zamknięciu) i umieść je w czystej tubie muchowej zawierającej standardowe pożywienie. Możliwe jest również uzyskanie dobrych nagrań z młodszych muszek, nawet z "noworodków"; Jednak ze względu na ich łagodniejsze oczy, wycięcie otworu rogówki dla elektrody rejestrującej jest trudniejsze.
  2. Zbuduj rurkę do łapania much i stanowisko do przygotowywania much (Rysunek 4). Zobacz rysunek 4, aby uzyskać ogólne wyobrażenie o tym, jak te samodzielnie wykonane narzędzia zostały połączone.
    1. Aby zrobić rurkę do łapania much, odetnij końcówkę stożkowego dna plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie włóż i przyklej dużą końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml do tego nowego otworu.
    2. Na koniec przytnij mały koniec pipety do rozmiaru, który łatwo przepuszcza muchę. Skonsultuj się z warsztatem mechanicznym, aby zmontować mały stopień przygotowania muchy, który umożliwia obrót w 2 osiach i zablokowanie uchwytu muchy w różnych pozycjach.

figure-protocol-3
Rysunek 4.Narzędzia i urządzenia potrzebne do przygotowania muchy. Rurka do łapania much jest wytwarzana przez przyklejenie plastikowej końcówki pipety o pojemności 1 ml do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wykonany na zamówienie stojak do przygotowania muchy umożliwia swobodne obracanie i zablokowanie uchwytu na muchy w preferowanej pozycji do przygotowania muchy. Mucha jest mocowana woskiem pszczelim za pomocą elektrycznego podgrzewacza wosku. Wazelinę nakłada się za pomocą małego aplikatora wykonanego przez połączenie grubego włosa na uchwycie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zbierz muchę do eksperymentu w końcówce do pipety o pojemności 1 ml, która ledwo pozwala muchy się przez nią zmieścić. Przymocuj rurkę do łapania much z końcówką pipety na niej do rurki muchowej. Łapiąc muchę, wykorzystaj ich wrodzoną tendencję do wspinania się w górę (antygrawitataksja) do końcówki pipety. Najlepiej wybrać największą suczkę, ponieważ rozmiar ma znaczenie w elektrofizjologii.
    Uwaga: Im większa mucha, tym większe jej komórki i tym większe szanse na wysokiej jakości nagrania wewnątrzkomórkowe. Mniejsze muchy (zarówno samice, jak i samce) również mogą zapewnić doskonałe nagrania, ale przygotowanie jest trudniejsze do wykonania. Gdy mucha zostanie uwięziona w dużej końcówce pipety, pamiętaj, aby zamknąć rurkę muchy, aby zapobiec ucieczce innych much.
  2. Podłącz strzykawkę o pojemności 100 ml z elastycznym wężem z tworzywa sztucznego do większego otworu końcówki pipety - z wciąż w niej muchą.
  3. Umieść wąski koniec na dużej końcówce pipety, która jest powiększona tylko po to, aby przepuścić Drosophila, do otworu w dnie uchwytu na muchy i wyciśnij niewielką ilość powietrza ze strzykawki, aby wyrzucić muchę do uchwytu na muchy.
    1. Spójrz przez mikroskop stereoskopowy i delikatnie podawaj więcej powietrza, aż głowa muchy będzie wystawać ze stożkowego końca uchwytu na muchy. Upewnij się, że mucha jest mocno uwięziona od klatki piersiowej do małego otworu w górnej części uchwytu na muchy.
  4. Użyj podgrzewacza do wosku, aby przymocować muchę woskiem pszczelim od jej "ramion" do uchwytu na muchy. Dostosuj temperaturę podgrzewacza do wosku tak, aby była jak najniższa, a jednocześnie czysto topiła wosk.
    Uwaga: Gdy temperatura jest prawidłowa, wosk wydaje się przezroczysty. Zbyt wysoka temperatura sprawia, że wosk "wypala się"; Zbyt niska skóra sprawia, że wosk jest sztywny. Podczas naprawiania muchy bądź dokładny i krótki, ponieważ długotrwałe wystawienie na działanie ciepła może ją uszkodzić. Stosowanie światłoutwardzalnego kleju dentystycznego nie jest tutaj zalecane, ponieważ jego aplikacja jest zbyt wolna.

figure-protocol-4
Rysunek 5.Przygotowanie muchy do eksperymentów in vivo. Po lewej stronie głowa Drosophila jest umieszczona prosto w uchwycie na muchy i przymocowana do trąbki, prawego oka i ramion do muchy za pomocą podgrzanego wosku pszczelego. Po prawej, mały otwór jest wycinany w najgrubszej części oka, tuż nad równikiem i tylko kilka ommatidia od tylnego naskórka, za pomocą ostrej krawędzi brzytwy. Kawałek rogówki jest delikatnie usuwany, a otwór jest uszczelniany wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu oka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Unieruchom głowę muchy. Nałóż wosk pszczeli na trąbkę (ryc. 5) i kącik prawego oka, omijając rogówkę, i przymocuj głowę od tych punktów do uchwytu na muchy.
  2. Wyprodukuj mikronóż. Zaciśnij żyletkę ze stali nierdzewnej z dwoma uchwytami/łamaczami ostrzy (oba z płaskim uchwytem) i rozbij mały pasek jej ostrej krawędzi. Ze względu na zdrowie i bezpieczeństwo używaj okularów ochronnych do ochrony oczu (chociaż jest bardzo mało prawdopodobne, aby kawałki rykoszetowały, gdy maszynka do golenia jest pęknięta). Najlepiej wyprodukować ostrą krawędź brzytwy, która przypomina iglicę. Upewnij się, że ta "iglica" jest mocno przymocowana do uchwytu ostrza, ale uważaj, aby uniknąć samookaleczenia!
  3. Za pomocą mikronoża przygotuj mały otwór składający się z kilku ommatidia w lewym oku muchy - w odległości około 4 - 5 ommatidia od naskórka grzbietowego tuż nad równikiem oka, aby zapewnić przejście dla mikroelektrody rejestrującej. Wykonuj pod mikroskopem stereoskopowym, oglądając preparat w dużym powiększeniu.
    Uwaga: Ponieważ oko muchy jest elastyczne i odporne na sondowanie, otwór najlepiej wyciąć nożem "iglicy". Technika cięcia jest dość trudna, więc zwróć szczególną uwagę na demonstrację wideo. Trzymanie uchwytu na muchy w określonych pozycjach (na stanowisku do przygotowania much) może ułatwić preparację. Początkowo mikrochirurgia może wydawać się trudna do nauczenia, ale po jej podjęciu adaptacja neuronalna stopniowo poprawia percepcję 3D i zręczność badacza.
  4. Ostrożnie wyjmij mały kawałek rogówki z otworu, który właśnie został wycięty, odsłaniając siatkówkę pod spodem. Szybko zakryj dziurę w oku maleńką kropelką wazeliny, używając cienkich włosków aplikatora wazeliny.
    Uwaga: Wazelina pełni tutaj wiele ról. Zapobiega odwodnieniu tkanek i koagulacji hemolimfy, która mogłaby przerwać włożoną elektrodę rejestrującą. Przypadkowo pokrywa również mikroelektrodę, zmniejszając jej pojemność wewnętrzną. Może to poprawić charakterystykę częstotliwościową systemu nagrywającego, a tym samym rozdzielczość czasową rejestrowanych sygnałów neuronowych. Unikaj rozmazywania wazeliny na pozostałej części oka, ponieważ powoduje to rozmycie optyki.

3. Zapis z fotoreceptorów R1-R6 lub LMC

  1. Zawsze bądź uziemiony podczas obsługi wzmacniacza mikroelektrod (na przykład poprzez dotykanie metalowej powierzchni klatki Faradaya lub stołu antywibracyjnego), ponieważ wyklucza to przypadkowe dostarczenie ładunku statycznego do stopnia głównego, co mogłoby uszkodzić obwody.
  2. Oświetl słup platformy do przygotowania much od góry za pomocą dwóch światłowodów na gęsiej szyi (Rysunek 6A) (ze źródłem zimnego światła wewnątrz klatki Faradaya), tak aby uchwyt na muchy można było umieścić na tyczce w preferowanej pozycji pod ścisłą kontrolą wzrokową.

figure-protocol-5
Rysunek 6. Ustawienie uchwytu na muchy i elektrod do eksperymentów.(A-B) Uchwyt na muchy jest umieszczony na platformie rejestrującej, która zapewnia również kontrolę temperatury za pomocą elementu Peltiera (A: biała okrągła platforma pośrodku). Ramię Cardana umożliwia dokładne ustawienie bodźca świetlnego w równej odległości (poprzez obrót x,y) wokół muchy, przy czym źródło światła (ciekły lub kwarcowy koniec wiązki światłowodowej) jest skierowane bezpośrednio na jego oko. W wielu naszych zestawach stymulacja światłem jest generowana przez diody LED (z liniowymi sterownikami prądowymi) lub przez monochromator. W związku z tym ich bodźce przenoszą określoną (pasmowo-przepustową) zawartość spektralną, dobraną między 300 - 740 nm i obejmującą zakres 4 - 6 jednostek intensywności log (tłumioną przez oddzielne filtry o neutralnej gęstości). (C) W głowicy muchy umieszcza się dwie mikroelektrody, sterowane przez oddzielne mikromanipulatory: elektroda odniesienia (powyżej) przechodząca przez oczki; elektrody rejestrującej (po lewej) przez mały otwór w lewym oku. (D) W celu uzyskania maksymalnej liczby zapisów fotoreceptorów, mikroelektroda rejestrująca jest wprowadzana do otworu, równolegle do osi trąbka-ocellus. Gdy końcówka elektrody wnika i uszczelnia się z fotoreceptorem, swobodnie obracające się źródło światła jest mocowane w pozycji, w której ogniwo wytwarza maksymalną odpowiedź napięciową na dany bodziec świetlny. Ten punkt w przestrzeni leży w środku pola recepcyjnego komórki. Jeśli otwór znajduje się blisko naskórka, penetracje LMC można uzyskać przy tym samym kącie elektrody (po lewej). Jeśli otwór znajduje się dalej od naskórka, pokazany jest również inny przydatny kąt natarcia elektrody w celu uzyskania zapisów LMC (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zamontuj uchwyt na muchy (z muchą w środku!) na słupie platformy do przygotowania much. Obróć uchwyt na muchy tak, aby lewe oko muchy było skierowane bezpośrednio w stronę badacza (Rysunek 6B).
  2. Delikatnie wprowadzić elektrodę referencyjną przez occelli muchy do kapsułki głowy za pomocą małego gruboziarnistego mikromanipulatora, obserwując preparat przez mikroskop stereoskopowy (ryc. 6C). Nie wciskaj elektrody zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić mózg muchy.
    1. Alternatywnie włóż elektrodę odniesienia z tyłu klatki piersiowej. Zawsze upewnij się, że mucha wydaje się zdrowa (porusza czułkami), a jej oczy są nienaruszone; nie został przypadkowo uszkodzony. Jeśli preparat wygląda mniej niż nieskazitelnie, przygotuj nową muchę do eksperymentów.
  3. Wbij ostrą mikroelektrodę rejestrującą do lewego oka przez przygotowany wcześniej mały otwór pokryty wazeliną. Użyj dużego powiększenia w mikroskopie stereoskopowym i przesuń światłowody oraz płaszczyznę ogniskowej tak, aby położenie końcówki elektrody stało się widoczne w 3D dzięki jej wzorcom odbicia.
    Uwaga: Rysunek 6D pokazuje, jak głowa muchy powinna być ustawiona nieco inaczej (w stosunku do kąta, pod jakim mikroelektroda rejestrująca wchodzi do oka) w przypadku zapisów fotoreceptorów i LMC. Wbicie elektrody do oka bez jej złamania jest najtrudniejszą fazą eksperymentu. Jeśli końcówka elektrody nie trafi w mały otwór w oku, uderzając w rogówkę, zwykle pęka.
  4. Włącz wzmacniacz mikroelektrod, gdy obie elektrody znajdą się mocno wewnątrz preparatu, w kontakcie elektrycznym z płynami ustrojowymi muchy.
  5. Wyłącz źródło zimnego światła (wewnątrz klatki Faradaya) i odłącz je od sieci. Podłącz jego wtyczkę do centralnego uziemienia, aby zminimalizować szum elektryczny wywołany pętlą uziemienia, i odsuń prowadnice świetlne na gęsiej szyi, aby system ramienia Cardan mógł być swobodnie przesuwany wokół muchy. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby upewnić się, że preparat do muchy jest teraz we względnej ciemności.
  6. Zmierz rezystancję elektrody nagrywającej w oku (zgodnie z instrukcją w ampinstrukcja obsługi wzmacniacza). Używaj tylko elektrod rejestrujących, w których rezystancja wynosi 100 - 250 MΩ.
    Uwaga: Uzyskanie wysokiej jakości nagrań wewnątrzkomórkowych za pomocą elektrody <70 MΩ jest praktycznie niemożliwe. Jeśli rezystancja wynosi <80 MΩ, prawdopodobnie końcówka elektrody jest uszkodzona. W takim przypadku należy wyłączyć wzmacniacz i wymienić elektrodę nagrywającą.
    1. Po wymianie elektrody i umieszczeniu jej w oku włącz amplifier, aby zmierzyć jego rezystancję. Czasami końcówka elektrody może zostać zablokowana przez jakiś detrytus, gdy dostanie się do tkanki. Można temu zaradzić, korzystając z pojemnościowych funkcji brzęczenia i impulsu prądu wzmacniacza, które zwykle usuwają go przez szybkie rezonansowanie lub odpychanie.
  7. Ustaw amplifier w trybie current-clamp (CC) lub bridge recording. Zlikwiduj dowolną różnicę napięcia między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia, ponieważ obie spoczywają teraz w elektrycznie połączonej przestrzeni zewnątrzkomórkowej, ustawiając przesunięcie sygnału (napięcie nagrywania) na zero. Śledź zmiany przesunięcia sygnału za pomocą amplifier odczyt wyświetlacza lub ekran oscyloskopu.
  8. Odczekaj 2-3 minuty, aż oko muchy przystosuje się do ciemności.
  9. Stopniowo wbijaj końcówkę elektrody rejestrującej głębiej w oko małymi krokami co 0,1 do 1 mikrona. Zrób to za pomocą piezo-steppera w osi x zdalnie sterowanego mikromanipulatora lub delikatnie obracając pokrętło precyzyjnej rozdzielczości manipulatora ręcznego.
  10. Stymuluj oko muchy krótkimi (1 - 10 ms) błyskami światła, gdy elektroda rejestrująca jest przesuwana w tkance.
    Uwaga: Jeśli elektroda rejestrująca jest umieszczona w siatkówce, a oko funkcjonuje normalnie, każdy błysk światła spowoduje krótki i niewielki spadek napięcia (hiperpolaryzacja 0,2 - 5 mV), zwany elektroretinogramem (ERG). Ta zmiana potencjału pola przestrzeni zewnątrzkomórkowej jest spowodowana zbiorową reakcją komórek siatkówki na światło. Jednak gdy końcówka elektrody wejdzie w blaszkę, zamykając się na LMC, ERG odwraca się, wykazując odpowiedzi depolaryzacyjne.
  11. Przesuń źródło światła wokół muchy za pomocą systemu ramienia Cardan i znajdź pozycję, w której światło wywołuje największą reakcję ERG.
    Uwaga: Ta pozycja oznacza mały obszar w przestrzeni wizualnej, w którym fotoreceptory (lub LMC), które znajdują się obok końcówki elektrody rejestrującej, próbkują swoje światło wejściowe.
  12. Przeniknij do ogniwa za pomocą elektrody rejestrującej.
    Uwaga: Penetracja może nastąpić spontanicznie lub gdy elektroda jest mikroposunięta do przodu. Można to dodatkowo ułatwić, delikatnie stukając w system mikromanipulatora lub korzystając z funkcji brzęczenia wzmacniacza; Działania te rezonują z końcówką elektrody w tkance. Gdy elektroda przebija błonę fotoreceptora, wchodząc w jego przestrzeń wewnątrzkomórkową, różnica napięcia między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia gwałtownie spada z 0 mV do ~-65 mV (między -55 a -75 mV); podczas gdy podczas penetracji LMC spadek ten jest zazwyczaj mniejszy (od -30 do -50 mV). Te różnice napięć reprezentują ujemne potencjały spoczynkowe danych ogniw. W zależności od jakości elektrody rejestrującej (jej ostrości) i procesu komórkowego, w który przeniknęła, odczyt napięcia z elektrody rejestrującej może szybko lub stopniowo ustabilizować się do potencjału spoczynkowego, ponieważ błona ogniwa uszczelnia się z zewnętrzną warstwą elektrody. Ale jeśli penetracja jest tylko częściowa lub słaba, elektroda zazwyczaj wyślizguje się z ogniwa, a zarejestrowany potencjał wzrasta z powrotem w kierunku zera.
  13. Zlokalizuj środek pola recepcyjnego penetrowanej komórki, gdy elektroda wydaje się prawidłowo uszczelniona, wykazując stabilny potencjał błonowy (ciemny potencjał spoczynkowy). Przesuń bodziec świetlny wokół oka muchy, używając systemu ramienia Cardana, aby znaleźć punkt w przestrzeni wizualnej, w którym błysk świetlny wywołuje maksymalną odpowiedź napięciową komórki. Zablokuj ramię Cardan, gdy bodziec świetlny jest skierowany bezpośrednio w stronę (skierowany) na środek pola recepcyjnego.
    Uwaga: W ciemności fotoreceptory Drosophila reagują na jasne impulsy świetlne z 40 - 65 mV depolaryzacyjnymi odpowiedziaminapięciowymi 4,5, podczas gdy stabilne zapisy LMC wykazują odpowiedzi hiperpolaryzacyjne od 20 do 45 mV9,10,14. Przenikanie gleju może zachodzić rzadko, na co wskazują potencjały spoczynkowe <-80 mV oraz znacznie wolniejsze i mniejsze (~5 mV) depolaryzacje nasycone światłem. Fotoreceptory u Drosophila o różnych pigmentacjach oczu, takie jak white-eye7 i cinnaber, wykazują porównywalne rozmiary odpowiedzi do typu dzikiego.
  14. Korzystając z trybu cęgów prądowych (CC) wzmacniacza, skompensuj pojemność elektrody rejestrującej poprzez wstrzykiwanie małych impulsów prądu 0,1 nA i krótkich (100 - 200 ms) do badanego ogniwa, aby zminimalizować artefakty nagrywania podczas ładowania membrany.
    Uwaga: Ta ważna procedura jest szczegółowo wyjaśniona w ampinstrukcja obsługi lifier i powinna być przećwiczona z modelem ogniwa elektrycznego przed właściwymi eksperymentami.
  15. Rejestruj odpowiedzi napięciowe na impulsy świetlne i inne bodźce będące przedmiotem zainteresowania, o różnych cechach statystycznych lub fizycznych (takich jak naturalistyczne szeregi czasowe natężenia światła lub losowe wzorce kontrastu). Przetestuj na przykład, jak zarejestrowane reakcje zmieniają się wraz z adaptacją do światła lub ciemności.
    Uwaga: Można dokładnie dostosować światło badanej komórki za pomocą ciągłego światła o wybranym natężeniu, dodając filtry o neutralnej gęstości na ścieżce światła4,5. Alternatywnie, w przypadku przedłużonej adaptacji do ciemności, wyłącz bodziec świetlny na określony czas. Ze względu na stabilność mechaniczną systemu nagrywającego, wysoką jakość elektrod rejestrujących i nienaruszoność preparatu, stabilne warunki nagrywania mogą czasami trwać wiele godzin. W ten sposób w dobry dzień możliwe jest zebranie dużej ilości danych w różnych warunkach adaptacji z jednej komórki. Gdy elektroda wysuwa się z ogniwa, zarejestrowane odpowiedzi zmniejszają się, a średnie napięcie zaczyna zbliżać się do zera.
  16. Ostrożnie przesuwaj elektrodę rejestrującą z precyzyjnym sterowaniem osią X mikromanipulatora, aż elektroda zetknie się i przeniknie do następnej komórki (zwykle jest to najbliższy sąsiad neuronowy). Nie przesuwaj elektrody wzdłuż osi y lub z, ponieważ te manewry sprawiłyby, że elektroda "orałaby tkankę" na boki, uszkadzając struktury oka!
    Uwaga: Dzięki dobrej elektrodzie i zdrowemu preparatowi można zarejestrować wysokiej jakości odpowiedzi z wielu fotoreceptorów (ale rzadko z wielu LMC) u tej samej muchy w ciągu kilku godzin; Sporadycznie przez cały dzień roboczy (>8 godz.) bez wyraźnego pogorszenia sygnału.
  17. Okresowo zapisuj pliki danych z informacjami identyfikującymi, takimi jak data, genotyp i zarejestrowany typ komórki. Ze względu na dużą ilość danych, które można zebrać podczas udanej sesji nagraniowej, należy przechowywać dobre pisemne zapisy w książce laboratoryjnej do przyszłej analizy danych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda rejestracji ostrych mikroelektrod, zastosowana tutaj dla oka Drosophila, może być wykorzystana do wiarygodnego ilościowego określania próbkowania i przetwarzania informacji neuronalnych w komórkach siatkówki i blaszki oraz komunikacji między nimi4,5,7,8,10,33. Wykorzystując ją do badania kodowania w różnych stadach dzikich typów, mutantach lub genetycznie modyfikowanych szczepach much, metoda ta udowodniła swoją wartość; Nie tylko w ilościowym określaniu skutków mutacji, temperatury, diety lub wybranej ekspresji3,4,6,9,10,14,30,34, ale także w ujawnianiu mechanistycznych przyczyn zmienionych zachowań wzrokowych14,34. Metoda ta jest również łatwo stosowana do innych preparatów z owadów35,36, umożliwiając badania neuroetologiczne widzenia. Następnie przedstawiamy kilka przykładów jego udanych zastosowań.

figure-results-1
Rysunek 7. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora muszki owocowej R1-R6 na impuls świetlny o temperaturze 20 i 25 oC. Ponieważ ostre penetracje mikroelektrod są często bardzo stabilne, możliwe jest rejestrowanie odpowiedzi napięciowych tego samego fotoreceptora R1-R6 na dany bodziec świetlny w różnych temperaturach otoczenia poprzez ogrzewanie lub chłodzenie muchy. W naszych konfiguracjach uchwyt na muchę jest umieszczony w systemie kontroli temperatury opartym na elemencie Peltiera w zamkniętej pętli. Dzięki temu możemy zmienić temperaturę głowy muchy w ciągu kilku sekund. Wyższa temperatura przyspiesza odpowiedzi napięciowe i charakterystycznie obniża potencjał spoczynkowy fotoreceptorów R1-R6 (na co wskazują czerwone strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Badanie wpływu temperatury na wyjście fotoreceptora

Dzięki dobrze zaprojektowanemu i izolowanemu od wibracji systemowi rejestrowania, metoda ta może być używana do pomiaru wpływu temperatury na wyjście neuronowe pojedynczej komórki poprzez ogrzewanie lub chłodzenie muchy. Podany przykład pokazuje reakcje napięciowe na jasny impuls o długości 10 ms, zarejestrowany w tym samym fotoreceptorze R1-R6 w temperaturze 20 i 25 oC (rysunek 7). Jak określono ilościowo poprzednioza 4,9, ocieplenie obniża potencjał spoczynkowy fotoreceptora w ciemności i przyspiesza jego reakcje napięciowe.

figure-results-2
Rysunek 8. Wydajność sygnalizacji Fotoreceptor R1-R6 muszki owocowej poprawia się wraz z natężeniem światła.(A) Wyjście fotoreceptora do przyciemnienia (poniżej) i jasnego (powyżej; 10 000 razy jaśniejsze światło) powtarzających się naturalistycznych szeregów czasowych natężenia światła zarejestrowanych przez tę samą mikroelektrodę w tej samej komórce w temperaturze 20 oC. Reakcje na jasny bodziec są większe, ponieważ integrują więcej próbek, elementarne odpowiedzi (uderzenia) na pojedyncze fotony4,5,7,8. (B) Nakłada się na siebie 20 następujących po sobie jednosekundowych odpowiedzi napięciowych. Indywidualne odpowiedzi (jasnoszary) zostały zebrane po ustąpieniu trendów adaptacyjnych (strzałka w A) (kropkowane pole w A). Odpowiednimi średnimi odpowiedzi (sygnałami) są ciemniejsze ślady. Różnica między sygnałem a indywidualnymi odpowiedziami polega na szumie. (C) Wydajność sygnalizacyjną komórek określono ilościowo za pomocą stosunków sygnału do szumu (SNR) nagrań przy użyciu standardowych metod4,5,7,8. Wyjście fotoreceptora ma o około 64 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji przy jasnej stymulacji (SNR'Bright ≥1, do 84 Hz) niż przy słabym (SNR'Dim ≥1, do 20 Hz), przy znacznej poprawie stosunku sygnału do szumu; od SNRDimMAX = 87 do SNRBrightMAX = 1,868. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Badanie adaptacji i kodowania neuronalnego za pomocą powtarzającej się stymulacji

Nieinwazyjność metody, powodująca stosunkowo niewielkie uszkodzenia w strukturach siatkówki i blaszki, czyni ją idealną do badania skuteczności sygnalizacji poszczególnych komórek na różne bodźce świetlne w ich niemal naturalnym stanie fizjologicznym in vivo. Rysunek 8 przedstawia odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 na przyćmiony i jasny, powtarzający się naturalistyczny bodziec szeregów czasowych natężenia światła w temperaturze 20 oC, podczas gdy rysunek 9 pokazuje reakcje innego fotoreceptora R1-R6 i LMC na inny bodziec naturalistyczny w temperaturze 25 oC. Zapisy pre- i postsynaptyczne wykonano oddzielnie od dwóch różnych much, ponieważ jednoczesne zapisy wewnątrzkomórkowe za pomocą dwóch ostrych mikroelektrod u tej samej muchy, jednej w siatkówce, a drugiej w blaszce, są zbyt trudne, aby były żywotne.

figure-results-3
Rysunek 9. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 muszki owocowej i LMC na powtarzającą się stymulację naturalistyczną w temperaturze 25 oC. (A) Wyjścia R1-R6 (szare) i LMC (czarne) rejestrowane przez różne mikroelektrody z różnych much. (B) W pełni przystosowane do światła 20 kolejnych pre- (powyżej) i postsynaptycznych (poniżej) odpowiedzi na ten sam naturalistyczny wzorzec bodźca z indywidualnymi reakcjami, pokazanymi w kolorze jasnoszarym i odpowiadającymi im średnimi odpowiedzi (sygnałami) jako ciemniejsze ślady. Różnica między sygnałem a indywidualnymi odpowiedziami polega na szumie. (C) Wydajność sygnalizacyjną komórek określono ilościowo za pomocą stosunków sygnału do szumu (SNR) nagrań. Wyjście LMC ma o około 10 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji (SNR'LMC ≥1, do 104 Hz) niż wyjście R1-R6 (SNR'R ≥1, do 94 Hz). Oba współczynniki sygnału do szumu są wysokie (SNRLMCMAX = 142, SNRRMAX = 752), a ponieważ szum nagrywania był niski, ich różnice odzwierciedlają rzeczywiste różnice w kodowaniu między komórkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po rozpoczęciu bodźca, nagrania zazwyczaj wykazują szybko adaptujące się trendy, które w dużej mierze ustępują w ciągu 5-6 sekund. Od tego momentu komórki wytwarzają bardzo spójne odpowiedzi na każdą prezentację bodźca trwającą 1 sekundę (każde kropkowane pole zawiera 20 takich bodźców). Powtarzalność odpowiedzi staje się oczywista, gdy nałoży się je na siebie (Rysunek 8B i Rysunek 9B). Indywidualne odpowiedzi to cienkie szare ślady, a ich średnia to grubszy, ciemniejszy ślad. Średnia odpowiedź jest traktowana jako sygnał neuronowy, podczas gdy szum neuronalny jest różnicą między średnią a każdą indywidualną odpowiedzią4,5,9,37,38. Odpowiednie stosunki sygnału do szumu w dziedzinie częstotliwości (Rysunek 8C i Rysunek 9C) uzyskano poprzez Fourierowskie przekształcenie fragmentów danych o sygnale i szumie na widma mocy mocy i podzielenie średniego widma mocy sygnału przez odpowiednie średnie widmo mocy szumu4,5,9,37,38. Charakterystyczne jest to, że maksymalne proporcje sygnału do szumu zarejestrowanych wyjść neuronowych do stymulacji naturalistycznej są wysokie (100 - 1000), a w najbardziej stabilnych preparatach o bardzo niskim poziomie szumu nagrywania mogą osiągać wartości >>1000 (np. Rysunek 8C). Zauważ również, że ocieplenie rozszerza pasmo niezawodnej sygnalizacjikomórek 4 (SNR'Bright≥ 1); na przykład względna różnica między dwoma R1-R6 na rysunkach 8 i 9 wynosi odpowiednio 10 Hz (84 przy 20 oC i 94 Hz przy 25 oC).

Można dodatkowo oszacować szybkość transferu informacji w każdej komórce na podstawie jej stosunku sygnału do szumu, korzystając z równania Shannona32 lub obliczając różnicę między wskaźnikami entropii odpowiedzi a wskaźnikami entropii szumu za pomocą metody potrójnej ekstrapolacji39. Więcej szczegółów na temat informacyjnych analiz teoretycznych oraz ich zastosowania i ograniczeń związanych z tą metodą podano w poprzednich publikacjach7,8,39.

figure-results-4
Rysunek 10.Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 muchy zabójczej i LMC na powtarzającą się naturalistyczną stymulację w temperaturze 19 oC. (A) wyjścia R1-R6 (szare) i LMC (czarne) zarejestrowane przez tę samą mikroelektrodę z tej samej muchy; najpierw postsynaptycznie, a później presynaptycznie, gdy elektroda była wysunięta w oku. (B) 20 kolejnych odpowiedzi pre- (powyżej) i postsynaptycznych (poniżej) (jasnoszare ślady) na ten sam naturalistyczny wzorzec bodźca zostało uchwyconych po początkowej adaptacji (kropkowana ramka w A). Ich średnimi są sygnały (ciemniejsze ślady na górze), podczas gdy ich odpowiednie różnice w stosunku do poszczególnych reakcji dają szum. (C) Odpowiednie współczynniki sygnału do szumu (SNR) obliczono jak na rysunkach 8C i 9C. Wyjście LMC ma o około 100 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji (SNR'LMCMAX ≥1, do 234 Hz) niż wyjście R1-R6 (SNR'RMAX ≥1, do 134 Hz). Oba współczynniki sygnału do szumu są wysokie (SNRLMCMAX = 137, SNRR MAX = 627), a ponieważ w nagraniach użyto tej samej mikroelektrody, ich różnice odzwierciedlają rzeczywiste różnice w pre- i postsynaptycznych wyjściach neuronowych. Wyniki te sugerują, że system rejestracji charakteryzował się niskim poziomem szumów, a jego wpływ na analizy był marginalny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Badania Neuroetologiczne Widzenia

Metoda może być również używana do rejestrowania pre- i postsynaptycznych odpowiedzi napięciowych z oczu złożonych różnych gatunków owadów7,8,35,36 (Rysunek 10), co pozwala na porównawcze badania neuroetologiczne przetwarzania informacji wizualnych. Dla prezentowanego systemu rejestracji jedyną wymaganą adaptacją są nowe uchwyty na preparaty, każdy z odpowiednio dobranym otworem dla badanego gatunku. Te przykładowe nagrania pochodzą od samicy muchy zabójcy (Coenosia attenuata). Wykazują one wewnątrzkomórkowe odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 i LMC na identyczną powtarzającą się stymulację światłem, jak w przypadku odpowiedników Drosophila na rycinie 9, ale w temperaturze 19 oC. W tym przypadku zarówno dane pre-, jak i postsynaptyczne zostały zarejestrowane od tej samej muchy; jeden po drugim, z tą samą elektrodą rejestrującą (wypełnioną 3 M KCl) najpierw przechodząc przez blaszkę boczną, zanim wejdzie do siatkówki czołowej. W porównaniu z danymi dotyczącymi Drosophila w temperaturze 25 oC, dane dotyczące Coenosia - nawet w niższej temperaturze - wykazują reakcje z większą dynamiką; Rozszerzenie zakresu niezawodnej sygnalizacji (stosunek sygnału do szumu >>1) w szerszym zakresie częstotliwości. Takie funkcjonalne adaptacje w neuronalnym kodowaniu bodźców naturalistycznych są zgodne z drapieżnym stylem życia Coenosia 36, który wymaga bardzo precyzyjnych informacji czasoprzestrzennych, aby osiągnąć szybkie zachowania łowieckie w powietrzu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy podstawowe kluczowe kroki, jak używać ostrych konwencjonalnych mikroelektrod do rejestrowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi fotoreceptorów R1-R6 i LMC w nienaruszonych oczach much. Metoda ta została zoptymalizowana, wraz z dostosowanymi do potrzeb narzędziami sprzętowymi i programowymi, w ciągu ostatnich 18 lat, aby zapewnić wysokiej jakości, długotrwałe nagrania, które odpowiedzą na szeroki zakres pytań eksperymentalnych. Inwestując czas i zasoby w konstruowanie solidnych i precyzyjnych zestawów eksperymentalnych oraz w produkcję mikroelektrod o korzystnych właściwościach elektrycznych, wysokiej jakości nagrania mogą stać się normą w każdym laboratorium zajmującym się neurofizjologią wzrokową Drosophila . Podczas gdy dobrze zaprojektowane systemy rejestracji i stymulacji światłem są ważne dla szybkiego przeprowadzenia różnych paradygmatów eksperymentalnych, istnieją trzy kroki proceduralne, które są jeszcze bardziej krytyczne dla osiągnięcia udanych zapisów: (i) przygotowanie muchy przy minimalnym uszkodzeniu oka, (ii) wyciągnięcie mikroelektrod o odpowiednich właściwościach elektrycznych oraz (iii) wbicie elektrody rejestrującej do oka bez złamania jej końcówki. Ostatecznie, aby zarejestrować znaczące dane, badacz musi zrozumieć fizyczne podstawy elektrofizjologii i sposób wytwarzania odpowiednich mikroelektrod dla docelowych typów komórek.

Dlatego ograniczenia tej techniki wyznacza przede wszystkim cierpliwość, doświadczenie i zdolności techniczne badacza. Ponieważ opanowanie tej techniki w przypadku małych komórek Drosophila może zająć dużo czasu, zaleca się, aby elektrofizjolodzy stażyści najpierw ćwiczyli z większymi oczami owadów, takimi jak plujka36 lub szarańcza35, przy użyciu tego samego zestawu. Gdy wykonywanie wysokiej jakości nagrań wewnątrzkomórkowych z większych fotoreceptorów i interneuronów stanie się rutyną, nadszedł czas, aby przejść do oka Drosophila . Kolejne ograniczenie tej techniki dotyczy identyfikacji komórkowej. Przeniknięte komórki Drosophila mogą być ładowane elektroforetycznie barwnikami, w tym żółcią Lucyfera lub neurobiotyną. Jednak ze względu na mały rozmiar końcówki mikroelektrod, elektroforeza działa mniej wydajnie niż w przypadku elektrod o niższej rezystancji, takich jak elektrody krosowe. Co więcej, mikroelektrody wypełnione barwnikiem mają charakterystycznie mniej korzystne właściwości elektryczne, co znacznie utrudnia rejestrowanie wysokiej jakości odpowiedzi z nich z fotoreceptorów Drosophila i LMC.

Problemem technicznym, który czasami występuje, jest niestabilny sygnał wejściowy lub jego całkowity brak. Jest to często związane z tym, że sygnał napięciowy jest albo stale dryfowany, albo wyższy/niższy niż zakres nagrywania wzmacniacza. W większości przypadków takie zachowanie jest spowodowane zablokowaniem elektrody rejestrującej (lub jej końcówką jest zbyt cienka - o zbyt dużej rezystancji lub pojemności wewnętrznej - aby prawidłowo przeprowadzić szybkie zmiany sygnału). Chociaż można próbować odblokować końcówkę, brzęcząc pojemnością elektrody, co czasami działa, często sytuację najlepiej rozwiązać, po prostu zmieniając elektrodę nagrywającą. Może to również wymagać regulacji parametrów w przyrządzie do ściągania mikroelektrod w celu obniżenia rezystancji końcówki nowych elektrod. Końcówka elektrody może również ulec zablokowaniu w preparatach, w przypadku których pokrycie otworu rogówki wazeliną zajęło zbyt dużo czasu. Długotrwały kontakt z powietrzem może wysuszyć świeżo odsłoniętą tkankę siatkówki, zamieniając jej warstwę powierzchniową w substancję podobną do kleju. W takim przypadku badacz zazwyczaj widzi czerwoną plamę tkanki przyklejoną do elektrody rejestrującej podczas wyciągania jej z oka. Jedynym rozwiązaniem jest tutaj zrobienie nowego preparatu. Wazelina może przynieść wiele korzyści w zapisach elektrofizjologicznych: (i) zapobiega koagulacji hemolimfy, która mogłaby złamać końcówkę elektrody; (ii) powleka końcówkę elektrody, zmniejszając jej pojemność wewnętrzną, co obniża stałą czasową elektrody, a tym samym może poprawić rozdzielczość czasową rejestrowanych sygnałów nerwowych40,41; (iii) utrzymuje końcówkę elektrody w czystości, ułatwiając penetracje; A po penetracji, (iv) może nawet pomóc uszczelnić końcówkę elektrody do błony komórkowej42.

Sygnał może być dodatkowo niestabilny lub utracony, gdy drut chlorku srebra uchwytu elektrody zostanie uszkodzony lub odchlorowany; W takim przypadku wystarczy wymienić lub ponownie nachlorować stary drut. Brakujący sygnał może również wynikać z tego, że jeden (lub oba) uchwyty elektrod nie są bezpiecznie podłączone do swoich gniazd. Jednak niezwykle rzadko zdarza się, aby jakiś element wyposażenia działał nieprawidłowo. Jeśli sygnał jest niewykrywalny, a wszystkie inne możliwości zostały wyczerpane, sprawdź, czy każda część aparatury rejestrującej, w tym scena główna, wzmacniacz, filtry dolnoprzepustowe i przetworniki AD/DA, są prawidłowo podłączone i działają normalnie. Jednym ze sposobów osiągnięcia tego celu jest zastąpienie każdego instrumentu innym z zestawu, o którym wiadomo, że działa normalnie. Alternatywnie użyj generatora sygnału, aby sprawdzić wydajność komponentów elektronicznych jeden po drugim.

Ale być może najczęstszym problemem technicznym, z którym borykają się elektrofizjolog, jest rejestrowanie hałasu. Ogólnie rzecz biorąc, rejestrowanie hałasu to obserwowana aktywność elektryczna inna niż bezpośrednia odpowiedź neuronalna na dany bodziec. Ze względu na to, że przygotowanie muchy, jeśli jest prawidłowo wykonane, jest bardzo stabilne, obserwowany szum (wykraczający poza naturalną zmienność reakcji) najczęściej wynika z pętli uziemienia w sprzęcie rejestrującym lub jest odbierany przez pobliskie urządzenia elektryczne. Taki szum to typowo szum sieciowy 50/60 Hz i jego harmoniczne; ale czasami składa się z bardziej złożonych przebiegów. Aby ustalić pochodzenie hałasu, wyjmij uchwyt na muchy z zestawu, podłącz elektrody rejestrujące i referencyjne przez kroplę muchowego Ringera (lub umieść je w małej kąpieli z roztworem Ringera; patrz krok 1.2.6) i nagraj sygnał w trybie CC lub bridge. Jeśli szum jest możliwy do zaobserwowania w nagranym sygnale, prawdopodobnie oznacza to, że szum jest zewnętrzny w stosunku do preparatu muchowego.

Innym dobrym testem do identyfikacji pochodzenia szumów jest zastąpienie uchwytów elektrod modelem ogniwa elektrycznego podłączonym do wzmacniacza. W idealnie skonfigurowanym i uziemionym układzie nagrany sygnał powinien być teraz praktycznie pozbawiony szumów, pokazując tylko stochastyczny szum bitowy z przetwornika AD (w najlepszym przypadku nawet to!). Jeśli hałas jest nadal obecny, sprawdź ponownie, czy wszystkie urządzenia platformy są prawidłowo uziemione. Wygodnym podejściem do wykrywania pętli uziemienia jest: (i) odłączenie wszystkich przewodów uziemiających od wszystkich części w platformie; (ii) zapewnić, że po wykonaniu tej czynności każda pojedyncza część jest rzeczywiście odizolowana od masy za pomocą omomierza; (iii) Połączyć części, jedna po drugiej, z centralnym podłożem bezpośrednio, a nie za pośrednictwem jakiejkolwiek innej części platformy. Spróbuj również zmienić konfiguracje sprzętu. Na przykład czasami odsunięcie komputera i monitora dalej od platformy może zmniejszyć hałas; Jeszcze w innych przypadkach przeniesienie komputera do szafy sprzętowej zmniejsza hałas. Warto również odłączyć pobliski sprzęt, aby sprawdzić, czy hałas jest zredukowany, lub osłonić dodatkowe komponenty. Ponadto spróbuj odłączyć lub wymienić różne elementy sprzętu nagrywającego, zwłaszcza kable BNC (które mogą mieć wadliwe połączenia uziemiające). Jeśli podczas korzystania z modelu komórkowego obserwuje się tylko szum bitowy, początkowym źródłem szumu są albo elektrody, albo sam preparat muchowy. Na przykład, może się zdarzyć, że elektroda referencyjna przypadkowo dotyka nerwu ruchowego lub aktywnych włókien mięśniowych wewnątrz torebki głowy (lub zakłóca mięśnie lotu w klatce piersiowej - jeśli są tam umieszczone). Zwykle najprościej jest przygotować nową muchę do nagrywania, dbając o zminimalizowanie uszkodzeń muchy. Ale jeśli szum utrzymuje się i jest szerokopasmowy, jest prawdopodobne, że elektrody są nieoptymalne dla eksperymentów; zbyt ostry/drobny (a więc zbyt głośny) lub po prostu nieodpowiedni do celu; Widzieliśmy nawet elektrody kwarcowe działające jak anteny - odbierające słabe sygnały nadawcze! Chociaż iteracja ustawień parametrów ściągacza-instrumentu w celu wygenerowania odpowiednich mikroelektrod w celu uzyskania spójnych, wysokiej jakości nagrań z określonych typów komórek może wymagać wiele wysiłku, jest tego warta. Gdy elektrody rejestrujące są dobrze dopasowane do eksperymentów, mogą zapewnić długotrwałe nagrania o wyjątkowej jakości.

Ostre techniki zapisu mikroelektrod mogą być podobnie stosowane do badania przetwarzania informacji neuronalnych w wielu preparatach, w tym w różnych warstwach przetwarzania w oczach owadów i mózgu43,44. Ponieważ końcówki mikroelektrod mogą być wykonane bardzo delikatnie, zazwyczaj uszkadzają one badane ogniwa w mniejszym stopniu niż większość zastosowań patch-clamp. Co ważne, nowoczesne wzmacniacze mikroelektrod typu sample-and-hold umożliwiają dobrą kontrolę właściwości elektrycznych końcówek40,45-47. Tak więc, przy prawidłowym zastosowaniu, technika ta może dostarczyć wiarygodnych danych zarówno z preparatów in vivo3,5,7-10,44 , jak i in vitro48 z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w rozdzielczości submilisekundowej. Taka precyzja byłaby niemożliwa przy dzisiejszych technikach obrazowania optycznego, które są głośniejsze i wolniejsze. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do scharakteryzowania właściwości błony elektrycznej małych komórek zarówno w konfiguracjach cęgów prądowych, jak i napięciowych5,29,33,36,40-42,49, dostarczając cennych danych dla podejść do modelowania biofizycznego i empirycznego7,8,11,33,49-54 , które łączą eksperymenty z teorią.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Mickowi Swannowi, Chrisowi Askhamowi i Martinowi Gautreyowi za ich ważny wkład w projektowanie i budowę wielu elektrycznych i mechanicznych komponentów platform. Obecne badania MJ są wspierane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (Grant BBSRC: BB/M009564/1), otwarty fundusz badawczy State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning (Chiny), High-End Foreign Expert Grant (Chiny), stypendium Fundacji Jane and Aatos Erkko (Finlandia) oraz grant Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy do przygotowania muchyOkulary OlympusSZX12 DFPLFL1,6x PF: WHN30x-H/22Możliwość powiększenia ~150X przy dużej odległości roboczej; Wykonany na zamówienie ciężki stalowy stojak do montażu na stole
Stereomikroskop w konfiguracji wewnątrzkomórkoweji środkowej;   OlympusOlympus SZX7; okulary: WHN30x-H/22Okulary 30X są potrzebne do dobrego widzenia odbicia końcówki elektrody podczas wprowadzania jej przez mały otwór rogówki do oka
MikroskopNikon SMZ645; okulary: C-W30x/7
Stół antywibracyjnyMelles GriotZ metrycznymi otworami M6 na płytcestykowejNasze zestawy na zamówienie mają duży otwór wywiercony w grubej płytce stykowej, który wpuszcza słup platformy do przygotowania much (mieści miedziany radiator z elektroniką) od spodu
Newport
MikromanipulatoryNarishigeNarishige NMN-21W naszych zestawach wewnątrzkomórkowych stosuje się różne systemy mikromanipulatorów do wprowadzania elektrod rejestrujących shap do oka muchy. Wszystkie wymienione manipulatory z powodzeniem zapewniają długotrwałe, stabilne zapisy z fotoreceptorów Drosophila i LMC.
Huxley BertramHuxley Oś xyz z precyzyjnym sterowaniem
SensapexPotrójna oś
Sensapex Mä RZH&AUML; użytkownikMä RZH&AUML; użytkownik DC-3K z dodatkowym krokowym piezoelektrycznym osi X i sterownikiem
Stojaki magnetyczneWystarczy dowolna podstawa magnetyczna z włącznikiemNa przykład do zarządzania wewnątrz klatki Faradaya
Uchwyty elektrodAparat HarvardaESP/W-F10N
Silver WireWorld Precision Instruments AGW1510średnicy 0,3 - 0,5 mm; musi być chlorowany dla uchwytów elektrod
Światłowodowe źródło światłaWiele różnych, w tym
TechnologiaAby dostarczyć bodziec świetlny LED do systemu ramienia Cardan. Używamy zarówno płynnych, jak i kwarcowych światłowodów (zakres od UV do IR)
Thorn Labs
Fly Cathing TubeP80-50P 50ml Cent. Tube PP., opakowanie 100 szt.Odetnij stożkowe dno z plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przyklej do niej końcówkę do pipety o pojemności 1 ml.
Cyfrowy system akwizycjiNational Instruments
Jednoelektrodowy wzmacniacz mikroelektrod prądowo-napięciowychnpi SEC-10LXhttp://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.htmlZnakomita wydajność!
Stopień głównyStandard (+/- 150 nA)npi SEC-10LX
2-kanałowa dioda OptoLED (Cairn Research Ltd., Wielka Brytania)Wiele z naszych systemów stymulacyjnych jest zbudowanych we własnym zakresie 
Samodzielnie zaprojektowane i skonstruowane
oprogramowanie do akwizycji i analizWiele firm do wyboru Biosyst; Napisany na zamówienie system oparty na Matlabie do prac eksperymentalnych i teoretycznych w laboratorium Juusola
Komputer osobisty lub MacUpewnij się, że komputer PC lub Mac jest kompatybilny z systemem akwizycji danych i oprogramowaniem
System ramienia Cardan Samodzielnie zaprojektowany i skonstruowanyZapewnia dokładne pozycjonowanie bodźców świetlnych x,y,z
System kontroli temperatury Peltiera Samodzielnie zaprojektowana i skonstruowana
klatka FaradayaSamodzielnie skonstruowanaosłona przed szumami elektromagnetycznymi
szkła borokrzemianowegoŚrednica zewnętrzna: 1 mm
Średnica wewnętrzna: 0,5 - 0,7 mm
szkła kwarcowego z włóknamiŚrednica zewnętrzna: 1 mm
Średnica wewnętrzna: 0,5 -
Sutter Instrument CompanyModel P-2000 laserowy ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowychW przypadku elektrod referencyjnych borokrzemianowych użyj wstępnie ustawionego programu #11 (elektrody łatek): Ciepło = 350; Żarnik = 4; Prędkość 36; Opóźnienie = 200).1.2.1). W przypadku elektrod borokrzemianowych należy użyć wstępnie ustawionego programu #12 (zazwyczaj wyciąga on dobre konwencjonalne ostre narzędzia  dla nagrań fotoreceptorowych): Ciepło = 355; Żarnik = 4; Prędkość 50; Opóźnienie = 225; Ciąg = 150. W przypadku nagrań LMC, które wymagają elektrod z drobniejszymi końcówkami, wartości te należy dostosować. Do wyciągania kapilar kwarcowych instrukcja P-2000 sugeruje programy dla mikroelektrod z cienką końcówką. Programy te" Wstępnie ustawione parametry służą jako użyteczne punkty wyjścia do systematycznych modyfikacji w celu wygenerowania elektrod o dobrym sukcesie penetracji i niskim poziomie szumów nagrywania.
Zewnątrzkomórkowy roztwór Dzwonka dla elektrody referencyjnejChemikalia z Fisher Scientific10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacharozaZobacz przepis w sekcji protokołu
3 M Roztwór KCl do wypełnienia włóknistej mikroelektrody rejestrującejSole z Fisher Scientific10010310, KCl
WazelinaVaselin
Żyletki
Uchwyt/wyłącznik ostrzaFine Science Tools By Dumont10053-099 cm
Blu-tackBostikAlternatywnie użyj kleszczy do formowania
gliny Narzędzia do nauki o nauce Przez Dumont11252-00#5SF (bardzo cienkie końcówki)
ręcznymMS 314/wyłącznikiem wiązki światłowodowe Olympus UltraFine Do źródeł światła i sterowników LED Kapilary zeKapilary ze Ściągacz do pipet 0,7 mm ze stali nierdzewnej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
  2. Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
  3. Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
  4. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
  5. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
  6. Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
  7. Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
  8. Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
  9. Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
  10. Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
  11. Hardie, R. C., Juusola, M. Phototransduction in Drosophila. Curr opin neurobiol. 34, 37-45 (2015).
  12. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
  13. Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
  14. Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
  15. Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
  16. Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
  17. Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
  18. Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
  19. Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
  20. Shaw, S. R. Early Visual Processing in Insects. J Exp Biol. 112, 225-251 (1984).
  21. Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
  22. Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
  23. Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
  24. Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
  25. Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
  26. Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
  27. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
  28. Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
  29. Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
  30. Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
  31. Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. , Springer. Netherlands. (1999).
  32. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. At&T Tech J. 27, 379-423 (1948).
  33. Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
  34. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
  35. Faivre, O., Juusola, M. Visual Coding in Locust Photoreceptors. Plos One. 3, e2173(2008).
  36. Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
  37. Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
  38. Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
  39. Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
  40. Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
  41. Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
  42. Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
  43. Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
  44. Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
  45. Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
  46. Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
  47. Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
  48. Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
  49. Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
  50. Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
  51. Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
  52. French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
  53. Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
  54. Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja wewn trzkom rkowametoda elektrofizjologicznamikroelektrody ostreuchwyt do muchypole recepcyjneadaptacja do ciemno cistosunek sygna u do szumu

Powiązane artykuły