Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54142

⸱

19 czerwca 2016

 ,  ,  , 
1National Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning, Beijing Normal University, 2Department of Biomedical Science, The University of Sheffield

W tym artykule

Podsumowanie

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Streszczenie

Odpowiedzi napięciowe fotoreceptorów owadów i interneuronów wzrokowych mogą być dokładnie rejestrowane za pomocą konwencjonalnych ostrych mikroelektrod. Opisana tutaj metoda umożliwia badaczowi pomiar długotrwałych (od minut do godzin) wysokiej jakości odpowiedzi wewnątrzkomórkowych z pojedynczych fotoreceptorów Drosophila R1-R6 i dużych komórek monopolarnych (LMC) na bodźce świetlne. Ponieważ system rejestracji charakteryzuje się niskim poziomem szumów, może być używany do badania zmienności między poszczególnymi komórkami w oku muchy oraz tego, jak ich wyniki odzwierciedlają fizyczne właściwości środowiska wizualnego. Przedstawiamy wszystkie kluczowe kroki w wykonywaniu tej techniki. Opisano podstawowe etapy konstruowania odpowiedniego zestawu elektrofizjologicznego do rejestracji, takie jak projektowanie i dobór aparatury doświadczalnej. Wyjaśniamy również, jak przygotować się do nagrania, wykonując odpowiednie (ostre) elektrody rejestrujące i () elektrody referencyjne. Podano szczegółowe informacje na temat tego, jak zamocować nienaruszoną muchę w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na muchy, przygotować małe okienko w jej oku i włożyć elektrodę rejestrującą przez ten otwór przy minimalnych uszkodzeniach. Wyjaśniamy, jak zlokalizować środek pola recepcyjnego komórki, dostosować badaną komórkę do ciemności lub światła oraz rejestrować jej reakcje napięciowe na dynamiczne bodźce świetlne. Na koniec opisujemy kryteria stabilnych normalnych zapisów, pokazujemy charakterystyczne wysokiej jakości odpowiedzi napięciowe poszczególnych komórek na różne bodźce świetlne i pokrótce określamy, jak określić ilościowo ich wydajność sygnalizacyjną. Wiele aspektów tej metody jest technicznie trudnych i wymaga praktyki i cierpliwości do opanowania. Jednak po poznaniu i zoptymalizowaniu pod kątem celów eksperymentalnych badacza, zapewnia znakomite dane neurofizjologiczne in vivo.

Wprowadzenie

Złożone oko muszki owocówki (Drosophila melanogaster) stanowi doskonały system modelowy do badania organizacji funkcjonalnej macierzy fotoreceptorów i interneuronów w procesach próbkowania i przetwarzania obrazu neuronalnego oraz w wizji zwierząt. System ten posiada najbardziej kompletny schemat połączeń neuronalnych1,2 i jest podatny na manipulacje genetyczne oraz precyzyjne monitorowanie aktywności neuronalnej (o wysokim stosunku sygnału do szumu i wysokiej rozdzielczości czasowej)3-10.

Oko Drosophila ma budowę modularną i składa się z ok. 750 pozornie regularnych struktur zwieńczonych soczewką, zwanych ommatidiami, które wspólnie zapewniają musze panoramiczne pole widzenia obejmujące niemal każdy kierunek wokół głowy. Podstawowymi jednostkami pobierania informacji w oku są rhabdomeryczne fotoreceptory7,8,11. Każde ommatidium zawiera osiem komórek fotoreceptorowych (R1-R8), które dzielą tę samą soczewkę facetową, ale są skierowane w siedmiu różnych kierunkach. Podczas gdy zewnętrzne fotoreceptory R1-R6 są najbardziej czułe na światło niebiesko-zielone, czułości spektralne komórek wewnętrznych R7 i R8, które znajdują się jedna nad drugą i są skierowane w tym samym kierunku, wykazują trzy charakterystyczne podtypy: blady (pale), żółty (yellow) oraz obszaru krawędzi grzbietowej (DRA)12-15.

Budowa fotoreceptorów i połączenia synaptyczne Drosophila; schemat układu wkładów lamina.
Rysunek 1. Organizacja funkcjonalna oka Drosophila. (A) Dwa pierwsze zwoje wzrokowe, siatkówka i lamina, zostały zaznaczone na szaro wewnątrz oka muchy. Fotoreceptory R1-R6 siatkówki oraz duże komórki jednobiegunowe (LMCs: L1-L3) lamina są łatwo dostępne in vivo dla konwencjonalnych rejestracji za pomocą ostrych mikroelektrod. Schematyczna elektroda pokazuje standardową ścieżkę rejestracji z R1-R6 w siatkówce. Jedną ze ścieżek rejestracji z LMCs w lamina jest równoległe przesunięcie elektrody w lewo. (B) Lamina stanowi macierz retinotopologicznie zorganizowanych wkładów, z których każdy jest wypełniony neuronami przetwarzającymi informacje z konkretnego, niewielkiego obszaru przestrzeni wizualnej. Ze względu na superpozycję neuronalną, sześć fotoreceptorów z różnych sąsiadujących ommatidiów przesyła swoje aksony (R1-R6) do tego samego wkładu lamina, tworząc histaminergiczne synapsy wyjściowe do L1-L3 oraz komórki amacrynowej (Am). (C) Przebieg informacji neuronalnej między zakończeniami aksonów R1-R6 a interneuronami wzrokowymi (w tym L4, L5, Lawf, C2, C3 i T1) wewnątrz wkładu lamina jest złożony. (D) Aksony fotoreceptorów R1-R6 otrzymują sprzężenia synaptyczne zwrotne z komórek jednobiegunowych L2 i L4. (B) i (C) zmodyfikowano na podstawie Rivera-alba et al2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Oko Drosophila jest typu neuronowego superpozycyjnego16. Oznacza to, że sygnały neuronowe z ośmiu fotoreceptorów należących do siedmiu sąsiednich ommatidiów, które patrzą w ten sam punkt w przestrzeni, są gromadzone w jednym wkładzie neuronowym w dwóch kolejnych neuropilach: laminie i meduli. Podczas gdy sześć zewnętrznych fotoreceptorów R1-R6 rzutuje końcówki swoich aksonów do kolumn neuronowych w laminie (Rysunek 1), komórki R7 i R8 omijają tę warstwę i tworzą kontakty synaptyczne z odpowiadającą im kolumną meduli17-19. Takie precyzyjne połączenia tworzą podłoże neuronowe dla mapowania retinotopowego wczesnego wzroku muchy, w wyniku czego każda kolumna laminy (Rysunki 1A-C) i meduli (wkład) reprezentuje pojedynczy punkt w przestrzeni.

Bezpośrednie sygnały z fotoreceptorów R1-R6 są odbierane przez duże komórki monopolarne (LMCs: L1, L2 i L3) oraz komórkę amacrinową (Am) w laminie1,2,20. spośród nich L1 i L2 są największymi komórkami, pośredniczącymi w głównych szlakach informacyjnych (Rycina 1D), które reagują na krawędzie poruszające się w kierunku On i Off, tworząc tym samym podstawę obliczeniową detektora ruchu21,22. Eksperymenty behawioralne sugerują, że przy umiarkowanym kontraście oba szlaki ułatwiają percepcję ruchu w przeciwnych kierunkach: od tyłu do przodu w komórkach L1 oraz od przodu do tyłu w komórkach L223,24. Połączenia wskazują ponadto, że neurony L4 mogą odgrywać kluczową rolę w komunikacji bocznej między sąsiednimi kartridżami25,26. Synapsy zwrotne stwierdzono pomiędzy komórkami L2 i L4 znajdującymi się w tym samym oraz w dwóch sąsiednich kartridżach. W dalszej części szlaku każda komórka L2 i trzy powiązane z nią komórki L4 rzutują swoje aksony do wspólnego celu – neuronu Tm2 w meduli, gdzie sygnały z sąsiednich kartridży są prawdopodobnie integrowane w celu przetwarzania ruchu od przodu do tyłu27. Chociaż neurony L1 otrzymują sygnały z komórek L2 z tego samego kartridża zarówno poprzez złącza szczelinowe, jak i synapsy, nie są one bezpośrednio połączone z komórkami L4, a tym samym z sąsiednimi kartridżami laminy.

Sprzężenia zwrotne synaptyczne do aksonów fotoreceptorów R1-R6 są zapewniane wyłącznie przez neurony należące do obwodów L2/L4, a nie przez drogę L11,2 (Rysunek 1D). Podczas gdy połączenia w obrębie tego samego wkładu (cartridge) pochodzą selektywnie z L2 do R1 i R2 oraz z L4 do R5, wszystkie fotoreceptory R1-R6 otrzymują synaptyczne sprzężenie zwrotne z L4 jednego lub obu sąsiednich wkładów. Ponadto istnieją silne połączenia synaptyczne z Am do R1, R2, R4 i R5, a komórki glei są również połączone synaptycznie z siecią, przez co mogą uczestniczyć w neuronalnym przetwarzaniu obrazu6. Wreszcie, aksonalne połączenia szczelinowe, łączące sąsiednie fotoreceptory R1-R6 oraz fotoreceptory R6 i R7/R8 w lamina, przyczyniają się do asymetrycznej reprezentacji i przetwarzania informacji w każdym wkładzie14,20,28.

Rejestracje napięcia wewnątrzkomórkowego z poszczególnych fotoreceptorów i interneuronów wzrokowych w niemal nienaruszonych owadach Drosophila dostarczają danych o wysokim stosunku sygnału do szumu przy rozdzielczości poniżej jednej milisekundy3,5,7-10,29, co jest niezbędne do zrozumienia szybkich obliczeń neuronalnych zachodzących między połączonymi neuronami. Taki poziom precyzji jest nieosiągalny przy użyciu obecnych technik obrazowania optycznego, które charakteryzują się znacznie większym poziomem szumów i zazwyczaj operują przy rozdzielczości 10 - 100 msec. Ponadto, dzięki bardzo małym i ostrym końcówkom elektrod, metoda ta nie ogranicza się do ciał komórkowych, lecz umożliwia bezpośrednie rejestracje z małych, aktywnych struktur neuronalnych, takich jak drzewa dendrytyczne LMC lub aksony fotoreceptorów, do których nie można uzyskać dostępu za pomocą znacznie większych końcówek elektrod typu patch-clamp. Co istotne, metoda ta jest również mniej inwazyjna strukturalnie i powoduje mniejsze uszkodzenia niż większość zastosowań patch-clamp, a tym samym w mniejszym stopniu wpływa na środowisko wewnątrzkomórkowe badanych komórek oraz próbkowanie informacji. W związku z tym konwencjonalne techniki z użyciem ostrych mikroelektrod przyczyniły się i nadal przyczyniają do fundamentalnych odkryć oraz oryginalnych spostrzeżeń w zakresie przetwarzania informacji neuronalnych w odpowiedniej skali czasowej, poprawiając nasze mechanistyczne rozumienie procesu widzenia3-10.

Niniejszy artykuł wyjaśnia, w jaki sposób w laboratorium Juusoli przeprowadza się wewnątrzkomórkowe rejestracje in vivo z fotoreceptorów R1-R6 oraz komórek LMC u Drosophila. Protokół ten opisuje sposób konstrukcji odpowiedniego stanowiska elektrofizjologicznego, przygotowanie muchy oraz sposób wykonywania rejestracji. Przedstawiono reprezentatywne dane oraz omówiono typowe problemy i potencjalne rozwiązania, które mogą pojawić się podczas stosowania tej metody.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Sheffield oraz Uniwersytetu Normalnego w Pekinie.

1. Przygotowanie odczynników i sprzętu

  1. Konfiguracja sprzętu do rejestracji i stymulacji świetlnej
    1. Wybierz obszar rejestracji o wymiarach co najmniej 2,5 x 2,5 m do przeprowadzania eksperymentów elektrofizjologicznych w pomieszczeniu z klimatyzacją, regulowaną wilgotnością i możliwością zapewnienia ciemnych warunków rejestracji. Upewnij się, że obszar ten jest wystarczająco duży, aby komfortowo pomieścić: (i) stół antywibracyjny o wymiarach 1 x 1 m, na którym znajduje się zestaw [aparat do stymulacji i rejestracji much], stereomikroskop oraz zimne źródło światła z dwoma elastycznymi wysięgnikami, a wszystko to zamknięte w dużej klatce Faradaya o wysokości >180 cm; (ii) szafę rack 38U dla komputera osobistego z płaskim monitorem LCD, wzmacniacz mikroelektrod, sterowniki LED, filtry, jednostki kontroli temperatury, oscyloskopy i inne wymagane instrumenty elektryczne; oraz (iii) małe biurko i krzesło dla badacza.
    2. Umieść zestaw z dala od źródeł zakłóceń elektrycznych i mechanicznych, takich jak lodówki, wirówki i windy. Użyj oddzielnych ochronników przeciwprzepięciowych, aby chronić urządzenia elektryczne zestawu przed skokami napięcia w sieci. Idealnie będzie podłączyć zestaw do własnego zasilacza gwarantowanego (UPS), aby zminimalizować szum.
    3. Wykonaj stożkowy uchwyt na muchę z mosiądzu i czarnego tworzywa sztucznego (Rysunek 2). Wywierć w mosiężnym elemencie mały zwężający się otwór, którego zewnętrzna krawędź ma średnicę ok. 0,8 mm (odpowiadającą typowej szerokości klatki piersiowej muchy).
      Uwaga: Otwór ten musi zwężać się ku końcowi uchwytu, tak aby większa od przeciętnej mucha z rodzaju Drosophila, wypchnięta z dołu strumieniem powietrza, utknęła na wysokości „barków” przy górnej krawędzi.
    4. Zaprojektuj i zbuduj mechanicznie wytrzymały, a jednocześnie precyzyjny aparat do stymulacji i rejestracji much (Rysunek 3). Z aluminium lub mosiądzu (metali o wysokiej przewodności) wykonaj słupek platformy preparacyjnej oraz otaczający go system ramion Cardana z wbudowanymi łożyskami kulkowymi, aby zapewnić płynne i dokładne pozycjonowanie w osiach x,y oraz blokowanie bodźca świetlnego.
      Uwaga: Ta zintegrowana konstrukcja kompozytowa minimalizuje wibracje mechaniczne, które w przeciwnym razie mogłyby spowodować wysunięcie się końcówki elektrody rejestrującej z badanej komórki. Może ona dodatkowo zawierać system zamkniętej pętli kontroli temperatury oparty na ogniwach Peltiera, umożliwiając badaczom stosowanie temperaturzależnych konstruktów genetycznych, takich jak shibireTS, do oceny obliczeń w obwodach synaptycznych9,30. Anoduj aparat lub pomaluj go na czarno, aby zminimalizować rozproszenie bodźca świetlnego.
      1. Zamocuj aparat do stymulacji i rejestracji much na płycie stołu antywibracyjnego; na przykład za pomocą śrub M6, korzystając z metrycznych otworów gwintowanych. Użyj czarnej płyty lub przykryj ją czarną tkaniną, aby zminimalizować rozproszenie światła podczas eksperymentów.
      2. Ustaw i zablokuj (za pomocą śruby blokującej) pionowo regulowany słupek platformy preparacyjnej w centrum systemu ramion Cardana. Umieść preparat muchy (w uchwycie, patrz krok 2) na słupku platformy tak, aby źródło światła przytwierdzone do ramienia Cardana było skierowane promieniście na głowę muchy. Upewnij się, że środek oczu muchy znajduje się dokładnie w punkcie przecięcia (0, 0) osi x i y ramienia Cardana, co umożliwia dokładne pozycjonowanie bodźca świetlnego w dowolnym punkcie pola widzenia muchy.
        Uwaga: Ta funkcjonalność jest niezbędna do mapowania właściwości odpowiedzi poszczególnych komórek na konkretne lokalizacje w oku; np. podczas poszukiwania elektrofizjologicznych dowodów na adaptacje strukturalne, takie jak strefy jasne lub ostre, które wykazywałyby odpowiednio zwiększoną czułość lub rozdzielczość31.
    5. Zamontuj stereomikroskop za aparatem do stymulacji i rejestracji much na stole antywibracyjnym w taki sposób, aby zapewnić komfortową obserwację oka muchy przy dużym powiększeniu.
    6. Zamontuj zimne źródło światła na górze mikroskopu, tak aby dwa półsztywne elastyczne przewodniki świetlne były skierowane w dół, w stronę uchwytu preparatu muchy. Swobodnie ruchome oświetlenie dwuwiązkowe ułatwia wizualizację końcówki elektrody rejestrującej podczas wprowadzania jej przez mały otwór do oka muchy.
    7. Zamocuj odpowiedni zestaw mikromanipulatorów x,y,z (gruby i precyzyjny) dla elektrody rejestrującej i przedwzmacniacza głowicowego na stole antywibracyjnym, po prawej stronie aparatu do stymulacji i rejestracji much, używając śrub M6 lub statywów magnetycznych.
      Uwaga: W laboratorium Juusoli różne zestawy są wyposażone w różne manipulatory; szczegóły znajdują się w Tabeli Materiałów i Odczynników. Wszystkie one zapewniają wysokiej jakości rejestracje wewnątrzkomórkowe.
    8. Zamontuj mały ręczny trójosiowy mikromanipulator dla uchwytu elektrody referencyjnej na pionowo regulowanym słupku platformy preparacyjnej. Zorientuj elektrodę referencyjną tak, aby była skierowana w stronę preparatu muchy.
    9. Zbuduj wolnostojącą, ekranowaną świetlnie klatkę Faradaya z paneli stalowych wokół stołu antywibracyjnego, otaczającą aparat do stymulacji i rejestracji much, aby zapobiec zewnętrznym zakłóceniom elektromagnetycznym. Pozostaw przód klatki otwarty, aby umożliwić transport preparatu muchy na eksperymenty. Przód zasłoń czarnymi tkaninami (z wszytą miedzianą lub aluminiową siatką do uziemienia), aby odizolować szumy i światło. Pomaluj wnętrze klatki na czarno, aby zminimalizować rozproszenie światła, a stopki klatki przykręć do podłogi, aby zapobiec wibracjom.
    10. Podłącz wyjścia napięciowe i prądowe wysok impedancyjnego wewnątrzkomórkowego wzmacniacza mikroelektrod do wejść dwóch oddzielnych filtrów dolnoprzepustowych (Bessela lub podobnych) za pomocą kabli BNC. Podobnie podłącz wyjścia filtrów do odpowiednich kanałów bloków/płyt złączy AD systemu akwizycji danych (karty DA/AD). Podłącz kartę(y) DA/AD do komputera osobistego za pomocą specjalistycznych kabli, zgodnie z instrukcjami dostawcy.
    11. Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie akwizycyjne dla wybranego systemu akwizycji danych na komputerze osobistym. Upewnij się, że sterowniki akwizycji danych są kompatybilne z systemem operacyjnym komputera.
    12. Uziem elektrycznie aparat do stymulacji i rejestracji much, klatkę Faradaya, siatkę miedzianą (w zasłonach), mikroskop, mikromanipulatory, zimne źródło światła, szafę rack 38U ze wszystkimi instrumentami (wzmacniacz wewnątrzkomórkowy, filtry, jednostka kontroli temperatury, PC, monitor LCD itp.) do jednego centralnego punktu uziemienia, używając przewodu uziemiającego i miedzianych tulejek zaciskowych M6. Użyj multimetru elektrycznego, aby sprawdzić, czy wszystkie części mają wspólne uziemienie.
      Uwaga: Aby uzyskać jak najlepsze warunki rejestracji o niskim poziomie szumów, konfiguracje uziemienia zazwyczaj różnią się w zależności od zestawu.
      1. W razie potrzeby podłącz centralny punkt uziemienia dalej do uziemienia budynku i/lub centralnego uziemienia wzmacniacza mikroelektrod. Po przetestowaniu w pełni funkcjonalnego systemu podczas rzeczywistych eksperymentów elektrofizjologicznych, bądź przygotowany na zmianę konfiguracji uziemienia w celu zminimalizowania szumów w rejestracjach.
    13. Skonfiguruj wzmocnienie programowe (1 - 10X), filtrowanie sygnału (zazwyczaj filtry dolnoprzepustowe ustawione na 500 Hz, co jest odpowiednie dla danych R1-R6 oraz LMC) i częstotliwość próbkowania (co najmniej 1 KHz). Upewnij się, że ustawienia są zgodne z twierdzeniem Nyquista-Shannona o próbkowaniu32; na przykład przy akwizycji danych filtrowanych dolnoprzepustowo przy 500 Hz, zastosuj częstotliwość próbkowania 1 kHz lub wyższą, aby zminimalizować efekty aliasingu.
      1. Ponieważ charakterystyczne odpowiedzi napięciowe fotoreceptorów R1-R6 wynoszą 40 - 65 mV, a LMC 20 - 45 mV, ustaw odpowiednio wzmocnienie i skalę wyświetlania, aby umożliwić wysokorozdzielcze próbkowanie i wizualizację danych.

Porównanie geometrii dysz do analizy dynamiki płynów, z linijką jako referencją skali.
Rysunek 2. Stożkowy uchwyt muchy. Uchwyt muchy składa się z dwóch elementów: centralnej jednostki mosiężnej oraz jej stożkowej, czarnej plastikowej osłony. Centralny otwór wewnątrz mosiężnej jednostki zwęża się do niewielkiej średnicy, która ledwo przepuszcza muchę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna; układ antywibracyjny; ilustracja przygotowania much; mikroskopia; kontrolowane środowisko.
Rycina 3. Przegląd zestawu elektrofizjologicznego. Układ zawiera wolnostojącą, osłoniętą przed światłem klatkę Faradaya, stół antywibracyjny, aparat do stymulacji i rejestracji sygnałów z much oraz czarne tkaninowe zasłony z miedzianą lub aluminiową siatką wewnątrz w celu uziemienia. Szafa aparaturowa jest elektrycznie połączona z tym samym wspólnym uziemieniem co cały sprzęt znajdujący się wewnątrz klatki Faradaya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wytwarzanie mikroelektrod
    1. Wyciągnij mikroelektrodę referencyjną z kapilar borokrzemianowych (średnica zewnętrzna: 1,0 mm; średnica wewnętrzna: 0,6 mm) lub kwarcowych (średnica zewnętrzna: 1,0 mm; średnica wewnętrzna: 0,5, 0,6 lub 0,7 mm) przy użyciu wyciągarki do pipet. Staraj się uzyskać krótkie, stopniowe zwężenie.
      Uwaga: Dokładne ustawienia programu wyciągarki różnią się w zależności od urządzenia; więcej szczegółów znajduje się w tabeli materiałów i odczynników. Wielkość otworu w czubku nie jest kluczowa, ponieważ końcówka elektrody referencyjnej zostanie odłamana przed wprowadzeniem jej do preparatu muchy.
    2. Wyciągnij mikroelektrodę rejestrującą z kapilar borokrzemianowych (średnica zewnętrzna: 1,0 mm; średnica wewnętrzna: 0,6 mm) lub kwarcowych (średnica zewnętrzna: 1,0 mm; średnica wewnętrzna: 0,5, 0,6 lub 0,7 mm) przy użyciu wyciągarki do pipet. Staraj się uzyskać długie (10 - 15 mm), cienkie i stopniowe zwężenie.
    3. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy elektrody rejestrujące mają prawidłowe zwężenie. Zamocuj elektrodę na szkiełku podstawowym za pomocą plastycznego kleju i użyj obiektywu powietrznego 40X, aby obejrzeć jej czubek.
      Uwaga: Dobra elektroda zwęża się gładko aż do niewidocznie małego czubka, wokół którego widoczne są ciągłe, równoległe, ciemniejsze i jaśniejsze prążki interferencyjne. Niektóre ustawienia wyciągarki generują elektrody o wysokiej rezystancji, które nie pozwalają na skuteczną penetrację komórki, ponieważ ich końcówki przypominają „trąbki”. Dlatego ważna jest wizualna inspekcja elektrod.
    4. Zamocuj elektrody poziomo w dużej szalce Petriego za pomocą plasteliny (lub podobnego plastycznego kleju) w celu ich bezpiecznego przechowywania i transportu do zestawu elektrofizjologicznego. Upewnij się, że końcówki elektrod zawsze znajdują się w powietrzu i przypadkowo niczego nie dotykają.
    5. Tuż przed eksperymentem wypełnij elektrody rejestrującą i referencyjną od tyłu odpowiednim roztworem soli. Użyj małej strzykawki 5 ml połączonej z małym filtrem cząsteczkowym z cienką plastikową końcówką (np. mikroładowarką).
      1. W eksperymentach z fotoreceptorami wypełnij elektrodę rejestrującą do pełna (aż do utworzenia się kropli na szerokim końcu) roztworem 3 M KCl, ponieważ roztwór ten minimalizuje wpływ potencjału złącza cieczowego na rejestrowane napięcie.
      2. W przypadku badania histaminergicznych LMC, które reagują na sygnały synaptyczne z fotoreceptorów R1-R6 zmianami przewodnictwa chlorkowego, wypełnij elektrody rejestrujące octanem potasu 3 M i KCl 0,5 mM, ponieważ roztwór ten ma mniejszy wpływ na potencjał chlorkowy komórki. Wypełnij elektrodę referencyjną roztworem Ringera dla muchy, zawierającym (w mM): 120 NaCl, 5 KCl, 10 TES (C6H15NO6S), 1,5 CaCl2, 4 MgCl2 oraz 30 sacharozy5.
    6. Przetestuj rezystancję nowo wyciągniętej elektrody rejestrującej w systemie rejestrującym.
      1. Upewnij się, że srebrne druty wewnątrz uchwytów elektrod są równomiernie pokryte chlorkiem srebra (mają barwę fioletowo-szarą, a nie błyszcząco srebrną), aby zminimalizować artefakty rejestracji (takie jak dryft potencjału złącza). W przeciwnym razie wymień je na prawidłowo chlorkowane druty.
      2. W razie potrzeby schlorkuj nowe srebrne druty. Ostrożnie oczyść druty (szybko przesuwając je przez płomień), aby uzyskały jasnosrebrny kolor. Unikaj dotykania ich palcami, aby osadziła się równomierna warstwa AgCl. Namocz druty w pełnej mocy domowym wybielaczu przez 15 - 30 min, aż nabiorą fioletowo-szarego koloru. Alternatywnie można poddać każdy drut galwanizacji (czyniąc go anodą względem roztworu zawierającego 3 M KCl i przepuszczając przez niego prąd natężeniem 1 mA/cm2 powierzchni) przez 10 - 15 s, aż zostanie odpowiednio pokryty.
      3. Podłącz wypełnione elektrody rejestrującą i referencyjną do ich uchwytów. Umieść małą kąpiel z roztworem Ringera na pionowo regulowanym słupku platformy do preparatów muchy. Zanurz końcówki elektrod w roztworze Ringera i zmierz rezystancję czubka elektrody rejestrującej.
        Uwaga: Ten krok jest konieczny tylko podczas testowania właściwości rezystancyjnych elektrod wyciągniętych z nowej partii kapilar szklanych lub podczas optymalizacji programów wyciągarki do mikroelektrod metodą iteracji.
      4. Przed przystąpieniem do pomiarów rezystancji zapoznaj się z instrukcjami w podręczniku użytkownika producenta wzmacniacza w celu wybrania odpowiednich ustawień pomiarowych. Dobra elektroda rejestrująca powinna mieć rezystancję czubka ~100 - 220 MΩ.

2. Drosophila – Przygotowanie

  1. Zebrać muchy w wieku 5–10 dni (po wykluciu) i umieścić je w czystej probówce do much zawierającej standardową pożywkę. Możliwe jest uzyskanie dobrych zapisów również z młodszych much, nawet z osobników nowo wyklutych, jednak ze względu na ich bardziej miękkie oczy wycięcie otworu w rogówce dla elektrody rejestrującej jest trudniejsze.
  2. Konstrukcja probówki do chwytania much oraz statywu do preparowania much (Rycina 4). Zasada budowy tych narzędzi własnej roboty przedstawiona jest na Rycynie 4.
    1. Aby wykonać probówkę do chwytania much, należy odciąć czubek stożkowego dna plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie do tak powstałego otworu należy wsunąć i przykleić szeroki koniec końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
    2. Na koniec należy przyciąć wąski koniec końcówki pipety do rozmiaru, który umożliwi musze swobodne przejście. W celu montażu niewielkiego stolika do preparowania much, umożliwiającego obrót w dwóch osiach i blokowanie uchwytu muchy w różnych pozycjach, zaleca się skorzystanie z usług warsztatu mechanicznego.

Układ do sekcji muchy pod mikroskopem; widoczny stojak do preparowania much, podgrzewacz do wosku, nożyk.
Rycina 4. Narzędzia i urządzenia niezbędne do przygotowania preparatu muchy. Probówka do odławiania much jest wykonana poprzez przyklejenie końcówki plastikowej pipety 1 ml do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Specjalistyczny stojak do preparowania much umożliwia swobodny obrót i blokowanie uchwytu muchy w preferowanej pozycji do przygotowania preparatu. Mucha jest unieruchamiana za pomocą wosku pszczelego przy użyciu elektrycznego podgrzewacza do wosku. Wazelinę nanosi się małym aplikatorem wykonanym z grubego włosia przymocowanego do rączki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Schwytaj muchę do eksperymentu za pomocą końcówki pipety o objętości 1 ml, która jest na tyle wąska, że mucha ledwie się w niej mieści. Przymocuj rurkę do chwytania much, z założoną końcówką pipety, do rurki z muchami. Podczas chwytania muchy wykorzystaj ich naturalną tendencję do wspinania się w górę (antygrawitaksję) do wnętrza końcówki pipety. Zaleca się wybór największej samicy, ponieważ w elektrofizjologii wielkość ma znaczenie.
    Uwaga: Im większa mucha, tym większe są jej komórki i tym większa szansa na uzyskanie wysokiej jakości rejestracji wewnątrzkomórkowych. Mniejsze muchy (zarówno samice, jak i samce) mogą również zapewniać doskonałe rejestracje, ale przygotowanie preparatu jest trudniejsze. Po schwytaniu muchy do dużej końcówki pipety należy pamiętać o zamknięciu rurki z muchami, aby zapobiec ucieczce pozostałych osobników.
  2. Połącz strzykawkę o objętości 100 ml za pomocą elastycznego plastikowego wężyka z szerszym otworem końcówki pipety, w której wciąż znajduje się mucha.
  3. Umieść wąski koniec dużej końcówki pipety (rozszerzonej tylko na tyle, by przepuścić Drosophila) w otworze na dnie uchwytu do much i wtłocz niewielką ilość powietrza ze strzykawki, aby wyrzucić muchę do uchwytu.
    1. Obserwując preparat przez stereomikroskop, delikatnie wtłacz więcej powietrza, aż głowa muchy będzie wystawać z stożkowego końca uchwytu. Upewnij się, że mucha jest mocno unieruchomiona od klatki piersiowej aż do małego otworu na górze uchwytu.
  4. Użyj podgrzewacza do wosku, aby przymocować muchę do uchwytu woskiem pszczelim, zaczynając od poziomu „barków”. Dostosuj temperaturę podgrzewacza tak, aby była jak najniższa, ale wciąż zapewniała czyste topnienie wosku.
    Uwaga: Gdy temperatura jest odpowiednia, wosk staje się przezroczysty. Zbyt wysoka temperatura powoduje „przypalenie” wosku; zbyt niska sprawia, że wosk pozostaje sztywny. Podczas mocowania muchy działaj precyzyjnie i szybko, ponieważ przedłużona ekspozycja na ciepło może ją uszkodzić. Stosowanie utwardzanego światłem kleju dentystycznego nie jest tutaj zalecane, gdyż jego aplikacja jest zbyt wolna.

Badanie oka muszki owocowej, obraz mikroskopowy, przedstawiający proces znakowania lewego oka do badań biologicznych.
Rysunek 5. Przygotowanie muchy do eksperymentów in vivo. Po lewej: Głowa Drosophila jest ustawiona prosto w uchwycie do much i przymocowana do niego w obrębie trąbki, prawego oka oraz ramion za pomocą podgrzanego wosku pszelego. Po prawej: Za pomocą ostrej żyletki w najgrubszej części oka, tuż nad równikiem i zaledwie kilka ommatidiów od tylnej kutykuli, wycina się niewielki otwór. Ostrożnie usuwa się fragment rogówki, a otwór uszczelnia wazeliną, aby zapobiec wysychaniu oka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Unieruchom głowę muchy. Nałóż wosk pszczeli na trąbkę (Rycina 5) oraz kącik prawego oka, unikając rogówki, i przymocuj głowę w tych punktach do uchwytu na muchy.
  2. Wykonaj mikronóż. Zaciśnij żyletkę wykonaną ze stali nierdzewnej dwoma uchwytami/łamaczami do ostrzy (oba z płaskim chwytem) i odłam mały pasek jej ostrej krawędzi. Ze względów bezpieczeństwa i higieny pracy należy używać okularów ochronnych (mimo że jest bardzo mało prawdopodobne, aby odłamki odbiły się podczas łamania żyletki). Idealnie byłoby uzyskać ostrą krawędź przypominającą iglicę. Upewnij się, że ta „iglica” jest mocno przymocowana do uchwytu ostrza, ale zachowaj ostrożność, aby uniknąć obrażeń!
  3. Za pomocą mikronoża przygotuj mały otwór o wielkości kilku ommatidiów w lewym oku muchy – około 4–5 ommatidiów od kutykuli grzbietowej, tuż nad równikiem oka, aby zapewnić przejście dla mikroelektrody rejestrującej. Procedurę przeprowadź pod stereomikroskopem, obserwując preparat przy dużym powiększeniu.
    Uwaga: Ponieważ oko muchy wydaje się elastyczne i stawia opór podczas nakłuwania, otwór najlepiej wycinać nożem w kształcie „iglicy”. Technika cięcia jest dość wymagająca, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na demonstrację wideo. Utrzymywanie uchwytu na muchy w określonych orientacjach (w statywie do preparacji muchy) może ułatwić sekcję. Początkowo mikrochirurgia może wydawać się trudna do opanowania, ale wraz z praktyką adaptacja neuronalna stopniowo poprawia percepcję 3D i zręczność badacza.
  4. Ostrożnie usuń mały fragment rogówki z wykonanego przed chwilą otworu, odsłaniając znajdującą się pod nim siatkówkę. Szybko zakryj otwór w oku maleńką kropelką wazeliny, używając cienkiego włosia aplikatora do wazeliny.
    Uwaga: Wazelina pełni tutaj kilka funkcji. Zapobiega odwodnieniu tkanek i koagulacji hemolimfy, która mogłaby uszkodzić wprowadzoną elektrodę rejestrującą. Przy okazji pokrywa ona mikroelektrodę, zmniejszając jej pojemność wewnątrzścienną. Może to poprawić odpowiedź częstotliwościową systemu rejestracji, a tym samym rozdzielczość czasową rejestrowanych sygnałów neuronalnych. Unikaj rozmazywania wazeliny po pozostałej części oka, ponieważ zamazuje to obraz optyczny.

3. Rejestracja sygnałów z fotoreceptorów R1-R6 lub komórek LMC

  1. Podczas obsługi wzmacniacza mikroelektrod należy zawsze być uziemionym (na przykład poprzez dotykanie metalowej powierzchni klatki Faradaya lub stołu antywibracyjnego), co zapobiega przypadkowemu przekazaniu ładunku statycznego do przedwzmacniacza głowicowego, co mogłoby uszkodzić układ elektroniczny.
  2. Oświetl słup platformy preparacyjnej much z góry za pomocą dwóch gęsich szyj prowadnic świetlnych (Rysunek 6A) (z zimnym źródłem światła wewnątrz klatki Faradaya), tak aby uchwyt na muchę można było umieścić na słupie w preferowanej pozycji pod ścisłą kontrolą wizualną.

Układ elektrofizjologiczny z mikroskopem i elektrodami do pomiaru aktywności neuronalnej u Drosophila.
Rycina 6. Pozycjonowanie uchwytu muchy i elektrod do eksperymentów. (A-B) Uchwyt muchy jest umieszczony na platformie rejestracyjnej, która zapewnia również kontrolę temperatury za pomocą elementu Peltiera (A: biała okrągła platforma w centrum). Ramię Cardana umożliwia precyzyjne pozycjonowanie bodźca świetlnego w równej odległości (poprzez obrót w osiach x,y) wokół muchy, przy czym źródło światła (końcówka płynnego lub kwarcowego wiązki światłowodów) jest skierowane bezpośrednio na oko. W wielu naszych układach stymulacja światłem jest generowana przez diody LED (z liniowymi sterownikami prądu) lub przez monochromator. W związku z tym ich bodźce posiadają określoną (przepuszczoną pasmowo) zawartość spektralną, wybraną w zakresie 300 - 740 nm i obejmują zakres 4 - 6 jednostek logarytmicznych intensywności (osłabianą przez oddzielne filtry neutralne). (C) Dwie mikroelektrody, sterowane przez oddzielne mikromanipulatory, są pozycjonowane w głowie muchy: elektroda referencyjna (powyżej) poprzez ocelli; elektroda rejestrująca (po lewej) przez mały otwór w lewym oku. (D) Aby uzyskać maksymalną liczbę rejestracji z fotoreceptorów, rejestrująca mikroelektroda jest wprowadzana do otworu równolegle do osi proboscis-ocellus. Gdy końcówka elektrody penetruje fotoreceptor i tworzy z nim szczelne połączenie, swobodnie obrotowe źródło światła jest utrwalone w pozycji, w której komórka wykazuje maksymalną odpowiedź napięciową na dany bodziec świetlny. Punkt ten w przestrzeni znajduje się w centrum pola recepcyjnego komórki. Jeśli otwór znajduje się blisko kutykuli, penetrację LMC można dalej przeprowadzić pod tym samym kątem elektrody (po lewej). Jeśli otwór znajduje się dalej od kutykuli, pokazany jest również inny użyteczny kąt podejścia elektrody w celu uzyskania rejestracji z LMC (po prawej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Zamocuj uchwyt do muchy (z muchą wewnątrz!) na pręcie platformy do przygotowań. Obróć uchwyt tak, aby lewe oko muchy było skierowane bezpośrednio w stronę badacza (Rysunek 6B).
  2. Za pomocą małego mikromanipulatora grubościowego ostrożnie wprowadź tępą elektrodę referencyjną przez ocelli do torebki głownej, obserwując preparat przez stereomikroskop (Rysunek 6C). Nie wsuwaj elektrody zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić mózg muchy.
    1. Alternatywnie elektrodę referencyjną można wprowadzić w tylną część klatki piersiowej. Zawsze upewnij się, że mucha wydaje się zdrowa (porusza czułkami), a jej oczy są nienaruszone i nie zostały przypadkowo uszkodzone. Jeśli preparat nie wygląda nieskazitelnie, przygotuj nową muchę do eksperymentów.
  3. Wprowadź ostrą mikroelektrodę rejestrującą do lewego oka przez przygotowany wcześniej mały otwór pokryty wazeliną. Użyj dużego powiększenia w stereomikroskopie i przesuń prowadnice świetlne oraz płaszczyznę ogniskowania tak, aby położenie końcówki elektrody stało się widoczne w 3D dzięki wzorcom odbicia światła.
    Uwaga: Rysunek 6D pokazuje, jak głowa muchy powinna być ustawiona nieco inaczej (pod kątem wchodzenia mikroelektrody rejestrującej do oka) w przypadku rejestracji z fotoreceptorów i LMC. Wprowadzenie elektrody do oka bez jej złamania jest najtrudniejszą fazą eksperymentu. Jeśli końcówka elektrody ominie mały otwór w oku i uderzy w rogówkę, zazwyczaj ulega złamaniu.
  4. Włącz wzmacniacz mikroelektrod, gdy obie elektrody znajdą się stabilnie w preparacie, w kontakcie elektrycznym z płynami ustrojowymi muchy.
  5. Wyłącz źródło zimnego światła (wewnątrz klatki Faradaya) i odłącz je od sieci. Podłącz jego wtyczkę do wspólnej masy, aby zminimalizować szumy elektryczne indukowane przez pętle masy, a następnie odsuń gęsie szyje prowadnic świetlnych, aby system ramienia Cardana mógł być swobodnie przesuwany wokół muchy. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby zapewnić, że preparat muchy znajduje się teraz w względnym mroku.
  6. Zmierz rezystancję elektrody rejestrującej w oku (zgodnie z instrukcją w podręczniku użytkownika wzmacniacza). Używaj tylko elektrod rejestrujących, których rezystancja wynosi 100 – 250 MΩ.
    Uwaga: Osiągnięcie wysokiej jakości rejestracji wewnątrzkomórkowej przy użyciu elektrody o rezystancji <70 MΩ jest praktycznie niemożliwe. Jeśli rezystancja wynosi <80 MΩ, prawdopodobnie końcówka elektrody jest złamana. W takim przypadku wyłącz wzmacniacz i wymień elektrodę rejestrującą.
    1. Po wymianie elektrody i wprowadzeniu jej do oka, włącz wzmacniacz, aby zmierzyć jej rezystancję. Czasami końcówka elektrody może zostać zablokowana przez detrytus podczas wchodzenia w tkankę. Można to naprawić, korzystając z funkcji capacitive buzz i impulsów prądowych wzmacniacza, które zazwyczaj udrażniają końcówkę poprzez szybki rezonans lub odpychanie.
  7. Ustaw wzmacniacz w tryb zaciskania prądowego (current-clamp, CC) lub tryb pomiaru z mostkiem (bridge recording). Wyzeruj dowolną różnicę napięć między elektrodą rejestrującą a referencyjną, ponieważ obie spoczywają teraz w elektrycznie połączonej przestrzeni pozakomórkowej, ustawiając offset sygnału (napięcie rejestracji) na zero. Śledź zmiany offsetu sygnału za pomocą wyświetlacza wzmacniacza lub ekranu oscyloskopu.
  8. Odczekaj 2–3 min, aby oko muchy zaadaptowało się do ciemności.
  9. Stopniowo wprowadzaj końcówkę elektrody rejestrującej głębiej do oka, wykonując małe kroki o wielkości od 0,1 do 1 µm. Rób to za pomocą piezo-sterownika osi x zdalnie sterowanego mikromanipulatora lub poprzez delikatne obracanie pokrętła precyzyjnego w manipulatorze ręcznym.
  10. Stymuluj oko muchy krótkimi (1–10 msec) błyskami światła podczas wprowadzania elektrody rejestrującej w tkankę.
    Uwaga: Jeśli elektroda rejestrująca znajduje się w siatkówce i oko funkcjonuje prawidłowo, każdy błysk światła spowoduje krótki i niewielki spadek napięcia (hiperpolaryzacja 0,2–5 mV), zwany elektroretinogramem (ERG). Ta zmiana potencjału polowego w przestrzeni pozakomórkowej jest wynikiem zbiorowej odpowiedzi komórek siatkówki na światło. Jednak po wejściu końcówki elektrody do lamina, w pobliże LMC, ERG odwraca się, wykazując odpowiedzi depolaryzacyjne.
  11. Przesuwaj źródło światła wokół oka muchy za pomocą systemu ramienia Cardana i znajdź pozycję, w której światło wywołuje największą odpowiedź ERG.
    Uwaga: Pozycja ta wyznacza niewielki obszar w przestrzeni wizualnej, w którym fotoreceptory (lub LMC), znajdujące się obok końcówki elektrody rejestrującej, odbierają sygnał świetlny.
  12. Przebij komórkę elektrodą rejestrującą.
    Uwaga: Przebicie może nastąpić spontanicznie lub podczas mikro-kroków elektrody do przodu. Można to dodatkowo ułatwić, delikatnie opukując system mikromanipulatora lub korzystając z funkcji buzz wzmacniacza; działania te wprowadzają końcówkę elektrody w rezonans w tkance. Gdy elektroda przebije membranę fotoreceptora, wchodząc do jego przestrzeni wewnątrzkomórkowej, różnica napięć między elektrodą rejestrującą a referencyjną gwałtownie spada z 0 mV do ok. -65 mV (zakres od -55 do -75 mV); natomiast podczas przebicia LMC spadek ten jest zazwyczaj mniejszy (między -30 a -50 mV). Różnice napięć te reprezentują ujemne potencjały spoczynkowe danych komórek. W zależności od jakości elektrody rejestrującej (jej ostrości) oraz przebitego wypustka komórkowego, odczyt napięcia z elektrody rejestrującej może stabilizować się szybko lub stopniowo do potencjału spoczynkowego, w miarę jak błona komórkowa uszczelnia się wokół zewnętrznej warstwy elektrody. Jeśli jednak przebicie jest tylko częściowe lub słabe, elektroda zazwyczaj wysuwa się z komórki, a rejestrowany potencjał powraca w stronę zera.
  13. Zlokalizuj centrum pola recepcyjnego przebitej komórki, gdy elektroda wyda się odpowiednio uszczelniona, wykazując stabilny potencjał błonowy (potencjał spoczynkowy w ciemności). Przesuwaj stymulację błyskiem światła wokół oka muchy, używając systemu ramienia Cardana, aby znaleźć punkt w przestrzeni wizualnej, w którym błysk światła wywołuje maksymalną odpowiedź napięciową komórki. Zablokuj ramię Cardana, gdy stymulacja świetlna jest skierowana bezpośrednio w centrum pola recepcyjnego.
    Uwaga: W ciemności fotoreceptory Drosophila odpowiadają na jasne impulsy światła depolaryzacją napięcia o wartości 40–65 mV4,5, podczas gdy stabilne rejestracje z LMC wykazują odpowiedzi hiperpolaryzacyjne od 20 do 45 mV9,10,14. Przebicia glii zdarzają się rzadko, co objawia się potencjałami spoczynkowymi <-80 mV oraz znacznie wolniejszymi i mniejszymi (~5 mV) indukowanymi światłem depolaryzacjami nasyconymi. Fotoreceptory w Drosophila o różnej pigmentacji oczu, takich jak white-eye7 i cinnabar, wykazują wielkości odpowiedzi porównywalne do typu dzikiego.
  14. Używając trybu zaciskania prądowego (CC) wzmacniacza, skompensuj pojemność elektrody rejestrującej poprzez wstrzykiwanie do badanej komórki małych (0,1 nA) i krótkich (100–200 msec) impulsów prądowych, aby zminimalizować artefakty rejestracji podczas ładowania błony.
    Uwaga: Ta ważna procedura jest szczegółowo opisana w podręczniku użytkownika wzmacniacza i powinna być ćwiczona na elektrycznym modelu komórki przed właściwymi eksperymentami.
  15. Rejestruj odpowiedzi napięciowe na impulsy światła i inne interesujące bodźce o różnych właściwościach statystycznych lub fizycznych (takich jak naturalne serie czasowe natężenia światła lub losowe wzory kontrastu). Przetestuj na przykład, jak rejestrowane odpowiedzi zmieniają się w zależności od adaptacji do światła lub ciemności.
    Uwaga: Można precyzyjnie zaadaptować badaną komórkę do światła, stosując ciągłe światło o predefiniowanej intensywności poprzez dodanie filtrów neutralnych na drodze światła4,5. Alternatywnie, dla przedłużonej adaptacji do ciemności, wyłącz stymulację świetlną na określony czas. Dzięki stabilności mechanicznej systemu rejestracji, wysokiej jakości elektrodom i nienaruszonemu preparatowi, stabilne warunki rejestracji mogą czasami trwać przez wiele godzin. Dzięki temu, w dobrych warunkach, możliwe jest zebranie dużej ilości danych dla różnych warunków adaptacyjnych z jednej komórki. Gdy elektroda wysunie się z komórki, rejestrowane odpowiedzi słabną, a średnie napięcie zaczyna dążyć do zera.
  16. Ostrożnie posuwaj elektrodę rejestrującą za pomocą precyzyjnej kontroli osi x mikromanipulatora, aż elektroda nawiąże kontakt i przebije kolejną komórkę (zazwyczaj jest to najbliższy sąsiad neuronalny). Nie przesuwaj elektrody wzdłuż osi y lub z, ponieważ takie manewry spowodowałyby „zaoranie tkanki” w poprzek, uszkadzając struktury oka!
    Uwaga: Przy zastosowaniu dobrej elektrody i zdrowego preparatu można zarejestrować wysokiej jakości odpowiedzi z wielu fotoreceptorów (ale rzadko z wielu LMC) w tej samej musze w okresie kilku godzin; sporadycznie przez cały dzień roboczy (>8 hr) bez wyraźnej degradacji sygnału.
  17. Okresowo zapisuj pliki z danymi wraz z informacjami identyfikacyjnymi, takimi jak data, genotyp i zarejestrowany typ komórki. Ze względu na dużą ilość danych, jakie można zebrać podczas udanej sesji rejestracji, prowadź dokładne zapisy w dzienniku laboratoryjnym dla przyszłej analizy danych.

Wyniki

Metoda rejestracji za pomocą ostrych mikroelektrod, zaadaptowana tutaj dla oka Drosophila, może być wykorzystana do niezawodnego ilościowego określenia pobierania i przetwarzania informacji neuronalnych w komórkach siatkówki i lamina oraz komunikacji między nimi4,5,7,8,10,33. Dzięki zastosowaniu tej metody do badania kodowania w różnych szczepach typu dzikiego, mutantach lub genetycznie zmodyfikowanych liniach much, udowodniono jej wartość; nie tylko w ilościowym określaniu efektów mutacji, temperatury, diety lub selektywnej ekspresji3,4,6,9,10,14,30,34, ale także w ujawnianiu mechanistycznych przyczyn zmienionych zachowań wzrokowych14,34. Metoda ta jest również łatwo stosowalna w przypadku innych preparatów owadziego układu nerwowego35,36, co usprawnia neuroetologiczne badania nad wzrokiem. Poniżej przedstawiamy kilka przykładów jej udanego zastosowania.

Schemat odpowiedzi napięciowej fotoreceptora; układ rejestracji wewnątrzkomórkowej; wpływ temperatury na potencjał.
Rycina 7. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 muszki owocowej na impuls światła w temperaturze 20 i 25 oC. Ponieważ penetracje ostrymi mikroelektrodami są często bardzo stabilne, możliwe jest rejestrowanie odpowiedzi napięciowych tego samego fotoreceptora R1-R6 na dany bodziec świetlny w różnych temperaturach otoczenia poprzez ogrzewanie lub chłodzenie muszki. W naszych układach uchwyt do muszki jest umieszczony na systemie kontroli temperatury opartym na elemencie Peltiera z zamkniętą pętlą sprzężenia. Pozwala nam to na zmianę temperatury głowy muszki w ciągu kilku sekund. Wyższa temperatura przyspiesza odpowiedzi napięciowe i charakterystycznie obniża potencjał spoczynkowy fotoreceptorów R1-R6 (wskazane czerwonymi strzałkami). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Badanie wpływu temperatury na sygnał wyjściowy fotoreceptorów

Przy zastosowaniu odpowiednio zaprojektowanego systemu rejestracji z izolacją od wibracji, metodę tę można wykorzystać do pomiaru wpływu temperatury na sygnał neuronowy pojedynczej komórki poprzez ogrzewanie lub chłodzenie muchy. Przedstawiony przykład ukazuje odpowiedzi napięciowe na jasny impuls o długości 10 msec, zarejestrowane w tym samym fotoreceptorze R1-R6 w temperaturach 20 i 25 oC (Rycina 7). Jak określono wcześniej4,9, ogrzewanie obniża potencjał spoczynkowy fotoreceptora w ciemności i przyspiesza jego odpowiedzi napięciowe.

Rejestracja napięcia fotoreceptora Drosophila, wykres adaptacji sygnału i stosunku szumu dla bodźców świetlnych.
Rycina 8. Wydajność sygnalizacji fotoreceptora R1-R6 muszki owocowej poprawia się wraz z intensywnością światła. (A) Wyjście fotoreceptora dla słabego (poniżej) i silnego (powyżej; światło 10 000 razy jaśniejsze) powtarzających się serii czasowych naturalnej intensywności światła, zarejestrowanych tą samą mikroelektrodą w tej samej komórce w temperaturze 20 oC. Reakcje na silny bodziec są większe, ponieważ integrują więcej próbek, czyli elementarnych odpowiedzi (wyboczeń) na pojedyncze fotony4,5,7,8. (B) Nałożono na siebie 20 kolejnych jednosekundowych odpowiedzi napięciowych. Pojedyncze odpowiedzi (jasnoszare) pobrano po ustąpieniu trendów adaptacyjnych (strzałka w A) (ramka kropkowana w A). Odpowiadające im średnie odpowiedzi (sygnały) to ciemniejsze ślady. Różnica między sygnałem a pojedynczymi odpowiedziami stanowi szum. (C) Wydajność sygnalizacji komórek została ilościowo określona za pomocą stosunku sygnału do szumu (SNR) pomiarów, stosując standardowe metody4,5,7,8. Wyjście fotoreceptora ma zakres niezawodnej sygnalizacji szerszy o około 64 Hz przy silnej stymulacji (SNR'Bright  ≥1, do 84 Hz) niż przy słabej (SNR'Dim  ≥1, do 20 Hz), przy czym stosunek sygnału do szumu znacząco się poprawia: od SNRDimMAX = 87 do SNRBrightMAX = 1 868. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie adaptacji i kodowania neuronalnego za pomocą stymulacji powtarzalnej

Nieinwazyjność tej metody, powodującej stosunkowo niewielkie uszkodzenia struktur siatkówki i lamina, sprawia, że jest ona idealna do badania wydajności sygnalizacji poszczególnych komórek w odpowiedzi na różne bodźce świetlne w ich niemal naturalnym stanie fizjologicznym in vivo. Rysunek 8 przedstawia odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 na powtarzającą się serię czasową naturalnej intensywności światła o niskim i wysokim natężeniu w temperaturze 20 oC, natomiast Rysunek 9 pokazuje odpowiedzi innego fotoreceptora R1-R6 oraz komórki LMC na inny bodziec naturalistyczny w temperaturze 25 oC. Rejestracje presynaptyczne i postsynaptyczne przeprowadzono oddzielnie u dwóch różnych much, ponieważ jednoczesne rejestracje wewnątrzkomórkowe za pomocą dwóch ostrych mikroelektrod u jednej muchy – jednej w siatkówce, a drugiej w lamina – są zbyt trudne, aby były wykonalne30.

Schemat analizy odpowiedzi napięciowej wewnątrzkomórkowej; stymulacja światłem; stosunek sygnału do szumu u Drosophila.
Rycina 9. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 oraz LMC muchy owocówki na powtarzalną stymulację naturalistyczną w 25 oC. (A) Wyjścia R1-R6 (szare) i LMC (czarne) zarejestrowane za pomocą różnych mikroelektrod u różnych much. (B) W pełni zaadaptowane do światła, 20 kolejnych odpowiedzi presynaptycznych (powyżej) i postsynaptycznych (poniżej) na ten sam naturalistyczny wzór bodźca, gdzie poszczególne odpowiedzi przedstawiono w jasnoszarym kolorze, a odpowiadające im wartości średnie odpowiedzi (sygnały) jako ciemniejsze linie. Różnica między sygnałem a poszczególnymi odpowiedziami to szum. (C) Wydajność sygnalizacji komórek została ilościowo określona za pomocą stosunków sygnału do szumu (SNR) z zapisów. Wyjście LMC ma o około 10 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji (SNR'LMC  ≥1, do 104 Hz) niż wyjście R1-R6 (SNR'R  ≥1, do 94 Hz). Oba stosunki sygnału do szumu są wysokie (SNRLMCMAX = 142, SNRRMAX = 752), a ponieważ szum rejestracji był niski, różnice te odzwierciedlają rzeczywiste różnice w kodowaniu między komórkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Po wystąpieniu bodźca w rejestracjach zazwyczaj obserwuje się trendy szybkiej adaptacji, które w dużej mierze ustępują w ciągu 5–6 s. Od tego momentu komórki generują wysoce spójne odpowiedzi na każdą prezentację bodźca trwającą 1 s (każda przerywana ramka obejmuje 20 takich odpowiedzi). Powtarzalność odpowiedzi staje się oczywista po ich nałożeniu na siebie (Rysunek 8B i Rycina 9B). Poszczególne odpowiedzi przedstawiają cienkie szare ślady, a ich średnia – grubszy, ciemniejszy ślad. Średnią odpowiedź przyjmuje się za sygnał neuronalny, podczas gdy szum neuronalny jest różnicą między średnią a każdą poszczególną odpowiedzią4,5,9,37,38Odpowiednie stosunki sygnału do szumu w dziedzinie częstotliwości (Rycina 8C i Rycina 9C) uzyskano poprzez przekształcenie Fouriera fragmentów danych sygnału i szumu w widma mocy, a następnie podzielenie średniego widma mocy sygnału przez odpowiadające mu średnie widmo mocy szumu4,5,9,37,38Charakterystyczne jest to, że maksymalne stosunki sygnału do szumu rejestrowanych odpowiedzi neuronalnych na stymulację naturalistyczną są wysokie (100–1 000) i w najbardziej stabilnych preparatach z bardzo niskim szumem rejestracji mogą osiągać wartości >>1,000 (np.., Rycina 8C). Zauważmy również, że ocieplenie rozszerza zakres pasma niezawodnego przesyłania sygnałów przez komórki4 (SNRJasny≥ 1); na przykład różnica względna między dwoma wartościami R1-R6 w Rycina 8 oraz 9odpowiednio, wynosi 10 Hz (84 przy 20 oC i 94 Hz przy 25 oC).

Szybkość transferu informacji dla każdej komórki można dodatkowo oszacować na podstawie stosunku sygnału do szumu, korzystając z równania Shannona32, lub poprzez obliczenie różnicy między entropią odpowiedzi a szybkością entropii szumu za pomocą metody potrójnej ekstrapolacji39. Więcej szczegółów dotyczących analiz teorii informacji oraz ich zastosowania i ograniczeń w odniesieniu konkretnie do tej metody przedstawiono w poprzednich publikacjach7,8,39.

Rejestracja wewnątrzkomórkowej odpowiedzi napięciowej; nałożone na siebie odpowiedzi i wykres wydajności sygnalizacji.
Rysunek 10. Odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 oraz LMC muchy z rodzaju Killer Fly na powtarzającą się stymulację naturalistyczną w temperaturze 19 oC. (A) Sygnały wyjściowe R1-R6 (szary) i LMC (czarny) zarejestrowane tą samą mikroelektrodą z tej samej muchy; najpierw postsynaptycznie, a później presynaptycznie, w miarę wprowadzania elektrody w głąb oka. (B) 20 kolejnych odpowiedzi presynaptycznych (powyżej) i postsynaptycznych (poniżej) (jasnoszare ślady) na ten sam naturalistyczny wzorzec bodźca, zarejestrowanych po wstępnej adaptacji (punktowana ramka w A). Ich średnie stanowią sygnały (ciemniejsze ślady na górze), natomiast różnice między nimi a poszczególnymi odpowiedziami określają szum. (C) Odpowiednie stosunki sygnału do szumu (SNR) obliczono analogicznie jak na Rysunkach 8C i 9C. Sygnał wyjściowy LMC ma o około 100 Hz szerszy zakres niezawodnej sygnalizacji (SNR'LMCMAX ≥1, do 234 Hz) niż sygnał wyjściowy R1-R6 (SNR'RMAX  ≥1, do 134 Hz). Oba stosunki sygnału do szumu są wysokie (SNRLMCMAX = 137, SNRRMAX = 627), a ponieważ do pomiarów użyto tej samej mikroelektrody, różnice te odzwierciedlają rzeczywiste różnice w presynaptycznych i postsynaptycznych sygnałach wyjściowych neuronów. Wyniki te wskazują, że system rejestracji charakteryzował się niskim poziomem szumu, a jego wpływ na analizy był marginalny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Badania neuroetologiczne nad wzrokiem

Metodę tę można również wykorzystać do rejestracji odpowiedzi napięciowych presynaptycznych i postsynaptycznych z oczu złożonych różnych gatunków owadów7,8,35,36 (Rysunek 10), co umożliwia porównawcze badania neuroetologiczne przetwarzania informacji wizualnych. W przypadku przedstawionego systemu rejestracyjnego jedyną wymaganą adaptacją są nowe uchwyty do preparatów, z których każdy posiada otwór o odpowiedniej wielkości dla badanego gatunku. Te przykładowe pomiary wykonano u samicy muchy drapieżnej (Coenosia attenuata). Przedstawiają one wewnątrzkomórkowe odpowiedzi napięciowe fotoreceptora R1-R6 oraz LMC na identyczną, powtarzalną stymulację świetlną, taką samą, jak w przypadku odpowiedników u Drosophila na Rysunku 9, ale w temperaturze 19 oC. W tym przypadku zarówno dane presynaptyczne, jak i postsynaptyczne zarejestrowano od tej samej muchy; jedno po drugim, przy użyciu tej samej elektrody rejestrującej (wypełnionej 3 M KCl), która najpierw przechodziła przez boczna lamina, a następnie wnikała do przedniej siatkówki. W porównaniu z danymi dla Drosophila w 25 oC, dane dla Coenosia — nawet w niższej temperaturze — wykazują odpowiedzi o szybszej dynamice, co rozszerza zakres niezawodnego przesyłania sygnałów (stosunek sygnału do szumu >>1) w szerszym zakresie częstotliwości. Takie funkcjonalne adaptacje w neuronalnym kodowaniu naturalnych bodźców są zgodne z drapieżnym trybem życia Coenosia36, który wymaga precyzyjnych informacji czasowo-przestrzennych w celu realizacji szybkich zachowań łowieckich w powietrzu.

Dyskusja

Przedstawiliśmy podstawowe kluczowe kroki, jak używać ostrych konwencjonalnych mikroelektrod do rejestrowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi fotoreceptorów R1-R6 i LMC w nienaruszonych oczach much. Metoda ta została zoptymalizowana, wraz z dostosowanymi do potrzeb narzędziami sprzętowymi i programowymi, w ciągu ostatnich 18 lat, aby zapewnić wysokiej jakości, długotrwałe nagrania, które odpowiedzą na szeroki zakres pytań eksperymentalnych. Inwestując czas i zasoby w konstruowanie solidnych i precyzyjnych zestawów eksperymentalnych oraz w produkcję mikroelektrod o korzystnych właściwościach elektrycznych, wysokiej jakości nagrania mogą stać się normą w każdym laboratorium zajmującym się neurofizjologią wzrokową Drosophila . Podczas gdy dobrze zaprojektowane systemy rejestracji i stymulacji światłem są ważne dla szybkiego przeprowadzenia różnych paradygmatów eksperymentalnych, istnieją trzy kroki proceduralne, które są jeszcze bardziej krytyczne dla osiągnięcia udanych zapisów: (i) przygotowanie muchy przy minimalnym uszkodzeniu oka, (ii) wyciągnięcie mikroelektrod o odpowiednich właściwościach elektrycznych oraz (iii) wbicie elektrody rejestrującej do oka bez złamania jej końcówki. Ostatecznie, aby zarejestrować znaczące dane, badacz musi zrozumieć fizyczne podstawy elektrofizjologii i sposób wytwarzania odpowiednich mikroelektrod dla docelowych typów komórek.

Dlatego ograniczenia tej techniki wyznacza przede wszystkim cierpliwość, doświadczenie i zdolności techniczne badacza. Ponieważ opanowanie tej techniki w przypadku małych komórek Drosophila może zająć dużo czasu, zaleca się, aby elektrofizjolodzy stażyści najpierw ćwiczyli z większymi oczami owadów, takimi jak plujka36 lub szarańcza35, przy użyciu tego samego zestawu. Gdy wykonywanie wysokiej jakości nagrań wewnątrzkomórkowych z większych fotoreceptorów i interneuronów stanie się rutyną, nadszedł czas, aby przejść do oka Drosophila . Kolejne ograniczenie tej techniki dotyczy identyfikacji komórkowej. Przeniknięte komórki Drosophila mogą być ładowane elektroforetycznie barwnikami, w tym żółcią Lucyfera lub neurobiotyną. Jednak ze względu na mały rozmiar końcówki mikroelektrod, elektroforeza działa mniej wydajnie niż w przypadku elektrod o niższej rezystancji, takich jak elektrody krosowe. Co więcej, mikroelektrody wypełnione barwnikiem mają charakterystycznie mniej korzystne właściwości elektryczne, co znacznie utrudnia rejestrowanie wysokiej jakości odpowiedzi z nich z fotoreceptorów Drosophila i LMC.

Problemem technicznym, który czasami występuje, jest niestabilny sygnał wejściowy lub jego całkowity brak. Jest to często związane z tym, że sygnał napięciowy jest albo stale dryfowany, albo wyższy/niższy niż zakres nagrywania wzmacniacza. W większości przypadków takie zachowanie jest spowodowane zablokowaniem elektrody rejestrującej (lub jej końcówką jest zbyt cienka - o zbyt dużej rezystancji lub pojemności wewnętrznej - aby prawidłowo przeprowadzić szybkie zmiany sygnału). Chociaż można próbować odblokować końcówkę, brzęcząc pojemnością elektrody, co czasami działa, często sytuację najlepiej rozwiązać, po prostu zmieniając elektrodę nagrywającą. Może to również wymagać regulacji parametrów w przyrządzie do ściągania mikroelektrod w celu obniżenia rezystancji końcówki nowych elektrod. Końcówka elektrody może również ulec zablokowaniu w preparatach, w przypadku których pokrycie otworu rogówki wazeliną zajęło zbyt dużo czasu. Długotrwały kontakt z powietrzem może wysuszyć świeżo odsłoniętą tkankę siatkówki, zamieniając jej warstwę powierzchniową w substancję podobną do kleju. W takim przypadku badacz zazwyczaj widzi czerwoną plamę tkanki przyklejoną do elektrody rejestrującej podczas wyciągania jej z oka. Jedynym rozwiązaniem jest tutaj zrobienie nowego preparatu. Wazelina może przynieść wiele korzyści w zapisach elektrofizjologicznych: (i) zapobiega koagulacji hemolimfy, która mogłaby złamać końcówkę elektrody; (ii) powleka końcówkę elektrody, zmniejszając jej pojemność wewnętrzną, co obniża stałą czasową elektrody, a tym samym może poprawić rozdzielczość czasową rejestrowanych sygnałów nerwowych40,41; (iii) utrzymuje końcówkę elektrody w czystości, ułatwiając penetracje; A po penetracji, (iv) może nawet pomóc uszczelnić końcówkę elektrody do błony komórkowej42.

Sygnał może być dodatkowo niestabilny lub utracony, gdy drut chlorku srebra uchwytu elektrody zostanie uszkodzony lub odchlorowany; W takim przypadku wystarczy wymienić lub ponownie nachlorować stary drut. Brakujący sygnał może również wynikać z tego, że jeden (lub oba) uchwyty elektrod nie są bezpiecznie podłączone do swoich gniazd. Jednak niezwykle rzadko zdarza się, aby jakiś element wyposażenia działał nieprawidłowo. Jeśli sygnał jest niewykrywalny, a wszystkie inne możliwości zostały wyczerpane, sprawdź, czy każda część aparatury rejestrującej, w tym scena główna, wzmacniacz, filtry dolnoprzepustowe i przetworniki AD/DA, są prawidłowo podłączone i działają normalnie. Jednym ze sposobów osiągnięcia tego celu jest zastąpienie każdego instrumentu innym z zestawu, o którym wiadomo, że działa normalnie. Alternatywnie użyj generatora sygnału, aby sprawdzić wydajność komponentów elektronicznych jeden po drugim.

Ale być może najczęstszym problemem technicznym, z którym borykają się elektrofizjolog, jest rejestrowanie hałasu. Ogólnie rzecz biorąc, rejestrowanie hałasu to obserwowana aktywność elektryczna inna niż bezpośrednia odpowiedź neuronalna na dany bodziec. Ze względu na to, że przygotowanie muchy, jeśli jest prawidłowo wykonane, jest bardzo stabilne, obserwowany szum (wykraczający poza naturalną zmienność reakcji) najczęściej wynika z pętli uziemienia w sprzęcie rejestrującym lub jest odbierany przez pobliskie urządzenia elektryczne. Taki szum to typowo szum sieciowy 50/60 Hz i jego harmoniczne; ale czasami składa się z bardziej złożonych przebiegów. Aby ustalić pochodzenie hałasu, wyjmij uchwyt na muchy z zestawu, podłącz elektrody rejestrujące i referencyjne przez kroplę muchowego Ringera (lub umieść je w małej kąpieli z roztworem Ringera; patrz krok 1.2.6) i nagraj sygnał w trybie CC lub bridge. Jeśli szum jest możliwy do zaobserwowania w nagranym sygnale, prawdopodobnie oznacza to, że szum jest zewnętrzny w stosunku do preparatu muchowego.

Innym dobrym testem do identyfikacji pochodzenia szumów jest zastąpienie uchwytów elektrod modelem ogniwa elektrycznego podłączonym do wzmacniacza. W idealnie skonfigurowanym i uziemionym układzie nagrany sygnał powinien być teraz praktycznie pozbawiony szumów, pokazując tylko stochastyczny szum bitowy z przetwornika AD (w najlepszym przypadku nawet to!). Jeśli hałas jest nadal obecny, sprawdź ponownie, czy wszystkie urządzenia platformy są prawidłowo uziemione. Wygodnym podejściem do wykrywania pętli uziemienia jest: (i) odłączenie wszystkich przewodów uziemiających od wszystkich części w platformie; (ii) zapewnić, że po wykonaniu tej czynności każda pojedyncza część jest rzeczywiście odizolowana od masy za pomocą omomierza; (iii) Połączyć części, jedna po drugiej, z centralnym podłożem bezpośrednio, a nie za pośrednictwem jakiejkolwiek innej części platformy. Spróbuj również zmienić konfiguracje sprzętu. Na przykład czasami odsunięcie komputera i monitora dalej od platformy może zmniejszyć hałas; Jeszcze w innych przypadkach przeniesienie komputera do szafy sprzętowej zmniejsza hałas. Warto również odłączyć pobliski sprzęt, aby sprawdzić, czy hałas jest zredukowany, lub osłonić dodatkowe komponenty. Ponadto spróbuj odłączyć lub wymienić różne elementy sprzętu nagrywającego, zwłaszcza kable BNC (które mogą mieć wadliwe połączenia uziemiające). Jeśli podczas korzystania z modelu komórkowego obserwuje się tylko szum bitowy, początkowym źródłem szumu są albo elektrody, albo sam preparat muchowy. Na przykład, może się zdarzyć, że elektroda referencyjna przypadkowo dotyka nerwu ruchowego lub aktywnych włókien mięśniowych wewnątrz torebki głowy (lub zakłóca mięśnie lotu w klatce piersiowej - jeśli są tam umieszczone). Zwykle najprościej jest przygotować nową muchę do nagrywania, dbając o zminimalizowanie uszkodzeń muchy. Ale jeśli szum utrzymuje się i jest szerokopasmowy, jest prawdopodobne, że elektrody są nieoptymalne dla eksperymentów; zbyt ostry/drobny (a więc zbyt głośny) lub po prostu nieodpowiedni do celu; Widzieliśmy nawet elektrody kwarcowe działające jak anteny - odbierające słabe sygnały nadawcze! Chociaż iteracja ustawień parametrów ściągacza-instrumentu w celu wygenerowania odpowiednich mikroelektrod w celu uzyskania spójnych, wysokiej jakości nagrań z określonych typów komórek może wymagać wiele wysiłku, jest tego warta. Gdy elektrody rejestrujące są dobrze dopasowane do eksperymentów, mogą zapewnić długotrwałe nagrania o wyjątkowej jakości.

Ostre techniki zapisu mikroelektrod mogą być podobnie stosowane do badania przetwarzania informacji neuronalnych w wielu preparatach, w tym w różnych warstwach przetwarzania w oczach owadów i mózgu43,44. Ponieważ końcówki mikroelektrod mogą być wykonane bardzo delikatnie, zazwyczaj uszkadzają one badane ogniwa w mniejszym stopniu niż większość zastosowań patch-clamp. Co ważne, nowoczesne wzmacniacze mikroelektrod typu sample-and-hold umożliwiają dobrą kontrolę właściwości elektrycznych końcówek40,45-47. Tak więc, przy prawidłowym zastosowaniu, technika ta może dostarczyć wiarygodnych danych zarówno z preparatów in vivo3,5,7-10,44 , jak i in vitro48 z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w rozdzielczości submilisekundowej. Taka precyzja byłaby niemożliwa przy dzisiejszych technikach obrazowania optycznego, które są głośniejsze i wolniejsze. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do scharakteryzowania właściwości błony elektrycznej małych komórek zarówno w konfiguracjach cęgów prądowych, jak i napięciowych5,29,33,36,40-42,49, dostarczając cennych danych dla podejść do modelowania biofizycznego i empirycznego7,8,11,33,49-54 , które łączą eksperymenty z teorią.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Autorzy dziękują Mickowi Swannowi, Chrisowi Askhamowi i Martinowi Gautreyowi za ich ważny wkład w projektowanie i budowę wielu elektrycznych i mechanicznych komponentów platform. Obecne badania MJ są wspierane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (Grant BBSRC: BB/M009564/1), otwarty fundusz badawczy State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learning (Chiny), High-End Foreign Expert Grant (Chiny), stypendium Fundacji Jane and Aatos Erkko (Finlandia) oraz grant Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop stereoskopowy do przygotowania muchyOkulary OlympusSZX12 DFPLFL1,6x PF: WHN30x-H/22Możliwość powiększenia ~150X przy dużej odległości roboczej; Wykonany na zamówienie ciężki stalowy stojak do montażu na stole
Stereomikroskop w konfiguracji wewnątrzkomórkoweji środkowej;   OlympusOlympus SZX7; okulary: WHN30x-H/22Okulary 30X są potrzebne do dobrego widzenia odbicia końcówki elektrody podczas wprowadzania jej przez mały otwór rogówki do oka
MikroskopNikon SMZ645; okulary: C-W30x/7
Stół antywibracyjnyMelles GriotZ metrycznymi otworami M6 na płytcestykowejNasze zestawy na zamówienie mają duży otwór wywiercony w grubej płytce stykowej, który wpuszcza słup platformy do przygotowania much (mieści miedziany radiator z elektroniką) od spodu
Newport
MikromanipulatoryNarishigeNarishige NMN-21W naszych zestawach wewnątrzkomórkowych stosuje się różne systemy mikromanipulatorów do wprowadzania elektrod rejestrujących shap do oka muchy. Wszystkie wymienione manipulatory z powodzeniem zapewniają długotrwałe, stabilne zapisy z fotoreceptorów Drosophila i LMC.
Huxley BertramHuxley Oś xyz z precyzyjnym sterowaniem
SensapexPotrójna oś
Sensapex Mä RZH&AUML; użytkownikMä RZH&AUML; użytkownik DC-3K z dodatkowym krokowym piezoelektrycznym osi X i sterownikiem
Stojaki magnetyczneWystarczy dowolna podstawa magnetyczna z włącznikiemNa przykład do zarządzania wewnątrz klatki Faradaya
Uchwyty elektrodAparat HarvardaESP/W-F10N
Silver WireWorld Precision Instruments AGW1510średnicy 0,3 - 0,5 mm; musi być chlorowany dla uchwytów elektrod
Światłowodowe źródło światłaWiele różnych, w tym
TechnologiaAby dostarczyć bodziec świetlny LED do systemu ramienia Cardan. Używamy zarówno płynnych, jak i kwarcowych światłowodów (zakres od UV do IR)
Thorn Labs
Fly Cathing TubeP80-50P 50ml Cent. Tube PP., opakowanie 100 szt.Odetnij stożkowe dno z plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przyklej do niej końcówkę do pipety o pojemności 1 ml.
Cyfrowy system akwizycjiNational Instruments
Jednoelektrodowy wzmacniacz mikroelektrod prądowo-napięciowychnpi SEC-10LXhttp://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.htmlZnakomita wydajność!
Stopień głównyStandard (+/- 150 nA)npi SEC-10LX
2-kanałowa dioda OptoLED (Cairn Research Ltd., Wielka Brytania)Wiele z naszych systemów stymulacyjnych jest zbudowanych we własnym zakresie 
Samodzielnie zaprojektowane i skonstruowane
oprogramowanie do akwizycji i analizWiele firm do wyboru Biosyst; Napisany na zamówienie system oparty na Matlabie do prac eksperymentalnych i teoretycznych w laboratorium Juusola
Komputer osobisty lub MacUpewnij się, że komputer PC lub Mac jest kompatybilny z systemem akwizycji danych i oprogramowaniem
System ramienia Cardan Samodzielnie zaprojektowany i skonstruowanyZapewnia dokładne pozycjonowanie bodźców świetlnych x,y,z
System kontroli temperatury Peltiera Samodzielnie zaprojektowana i skonstruowana
klatka FaradayaSamodzielnie skonstruowanaosłona przed szumami elektromagnetycznymi
szkła borokrzemianowegoŚrednica zewnętrzna: 1 mm
Średnica wewnętrzna: 0,5 - 0,7 mm
szkła kwarcowego z włóknamiŚrednica zewnętrzna: 1 mm
Średnica wewnętrzna: 0,5 -
Sutter Instrument CompanyModel P-2000 laserowy ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowychW przypadku elektrod referencyjnych borokrzemianowych użyj wstępnie ustawionego programu #11 (elektrody łatek): Ciepło = 350; Żarnik = 4; Prędkość 36; Opóźnienie = 200).1.2.1). W przypadku elektrod borokrzemianowych należy użyć wstępnie ustawionego programu #12 (zazwyczaj wyciąga on dobre konwencjonalne ostre narzędzia  dla nagrań fotoreceptorowych): Ciepło = 355; Żarnik = 4; Prędkość 50; Opóźnienie = 225; Ciąg = 150. W przypadku nagrań LMC, które wymagają elektrod z drobniejszymi końcówkami, wartości te należy dostosować. Do wyciągania kapilar kwarcowych instrukcja P-2000 sugeruje programy dla mikroelektrod z cienką końcówką. Programy te" Wstępnie ustawione parametry służą jako użyteczne punkty wyjścia do systematycznych modyfikacji w celu wygenerowania elektrod o dobrym sukcesie penetracji i niskim poziomie szumów nagrywania.
Zewnątrzkomórkowy roztwór Dzwonka dla elektrody referencyjnejChemikalia z Fisher Scientific10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacharozaZobacz przepis w sekcji protokołu
3 M Roztwór KCl do wypełnienia włóknistej mikroelektrody rejestrującejSole z Fisher Scientific10010310, KCl
WazelinaVaselin
Żyletki
Uchwyt/wyłącznik ostrzaFine Science Tools By Dumont10053-099 cm
Blu-tackBostikAlternatywnie użyj kleszczy do formowania
gliny Narzędzia do nauki o nauce Przez Dumont11252-00#5SF (bardzo cienkie końcówki)
ręcznymMS 314/wyłącznikiem wiązki światłowodowe Olympus UltraFine Do źródeł światła i sterowników LED Kapilary zeKapilary ze Ściągacz do pipet 0,7 mm ze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
  2. Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
  3. Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
  4. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
  5. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
  6. Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
  7. Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
  8. Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
  9. Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
  10. Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
  11. Hardie, R. C., Juusola, M. Phototransduction in Drosophila. Curr opin neurobiol. 34, 37-45 (2015).
  12. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
  13. Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
  14. Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
  15. Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
  16. Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
  17. Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
  18. Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
  19. Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
  20. Shaw, S. R. Early Visual Processing in Insects. J Exp Biol. 112, 225-251 (1984).
  21. Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
  22. Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
  23. Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
  24. Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
  25. Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
  26. Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
  27. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
  28. Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
  29. Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
  30. Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
  31. Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. , Springer. Netherlands. (1999).
  32. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. At&T Tech J. 27, 379-423 (1948).
  33. Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
  34. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
  35. Faivre, O., Juusola, M. Visual Coding in Locust Photoreceptors. Plos One. 3, e2173(2008).
  36. Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
  37. Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
  38. Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
  39. Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
  40. Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
  41. Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
  42. Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
  43. Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
  44. Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
  45. Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
  46. Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
  47. Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
  48. Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
  49. Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
  50. Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
  51. Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
  52. French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
  53. Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
  54. Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracja wewnątrzkomórkowametoda elektrofizjologicznamikroelektrody ostreuchwyt do muchypole recepcyjneadaptacja do ciemnościstosunek sygnału do szumu
Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.