Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szybką i bardzo czułą kwantyfikację danych z sensora rezonansu rezonansu (FRET) za pomocą przenośnego analizatora FRET wykonanego na zamówienie. Urządzenie zostało wykorzystane do wykrywania maltozy w krytycznym zakresie temperatur, który maksymalizuje czułość wykrywania, umożliwiając praktyczną i efektywną ocenę zawartości cukru.

Streszczenie

Ostatnie ulepszenia w czujnikach transferu energii rezonansu (FRET) Förstera umożliwiły ich wykorzystanie do wykrywania różnych małych cząsteczek, w tym jonów i aminokwasów. Jednak wrodzona słaba intensywność sygnału czujników FRET jest poważnym wyzwaniem, które uniemożliwia ich zastosowanie w różnych dziedzinach i sprawia, że konieczne jest stosowanie drogich, wysokiej klasy fluorometrów. Wcześniej zbudowaliśmy ekonomiczny, wysokowydajny analizator FRET, który może mierzyć stosunek dwóch pasm długości fal emisji (530 i 480 nm) w celu uzyskania wysokiej czułości wykrywania. Niedawno odkryto, że czujniki FRET z bakteryjnymi białkami wiążącymi peryplazmatyczne wykrywają ligandy z maksymalną czułością w krytycznym zakresie temperatur 50 - 55 °C. Niniejszy raport opisuje protokół oceny zawartości cukru w dostępnych na rynku próbkach napojów przy użyciu naszego przenośnego analizatora FRET z czujnikiem FRET specyficznym dla temperatury. Nasze wyniki wykazały, że dodatkowy proces podgrzewania czujnika FRET znacznie zwiększa sygnał współczynnika FRET, aby umożliwić dokładniejszy pomiar zawartości cukru. Wykonany na zamówienie analizator i czujnik FRET zostały z powodzeniem zastosowane do ilościowego określenia zawartości cukru w trzech rodzajach napojów dostępnych na rynku. Przewidujemy, że dalsza redukcja rozmiarów i poprawa wydajności sprzętu ułatwi korzystanie z ręcznych analizatorów w środowiskach, w których nie jest dostępny wysokiej klasy sprzęt.

Wprowadzenie

Förster resonance energy transfer (FRET) jest szeroko stosowany jako czujnik biometryczny do wykrywania małych cząsteczek, takich jak cukry, jony wapnia i aminokwasy^1-4. Biosensory FRET zawierają białka fluorescencyjne, cyjanowe białka fluorescencyjne (CFP) i żółte białka fluorescencyjne (YFP), które są połączone z obydwoma końcami białek wiążących peryplazmatyczne (PBP). Cukry wiążą się z PBP znajdującymi się w środku czujnika FRET, powodując zmiany strukturalne czujnika, które następnie zmieniają odległość i orientację dipola przejściowego dwóch białek fluorescencyjnych na obu końcach PBP. Zmiana ta umożliwia ilościową analizę zawartości cukru poprzez pomiar stosunku długości fal emisji EYFP (530 nm) i ECFP (480 nm). Ze względu na wysoką czułość, swoistość, zdolność monitorowania w czasie rzeczywistym i szybki czas reakcji biosensorów FRET, czujniki te są szeroko stosowane w zastosowaniach środowiskowych, przemysłowych i medycznych⁵. Co więcej, pomiar ratiometryczny za pomocą biosensorów FRET ma ważne zalety praktyczne, ponieważ może być stosowany do pomiaru składników w złożonych próbkach biologicznych, w których stężenie czujnika nie może być łatwo kontrolowane, a fluorescencja tła jest zawsze obecna.

Pomimo tych zalet czujników opartych na FRET do wizualizacji ilościowej, małe zmiany strukturalne z niepełnym transferem ruchu domeny do białek fluorescencyjnych wytwarzają z natury słabą intensywność sygnału. Ten słaby sygnał ogranicza zastosowanie czujników opartych na FRET do analizy in vitro lub in vivo ⁶. W związku z tym większość biosensorów FRET wymaga użycia drogiego i bardzo czułego sprzętu. Wcześniej opracowaliśmy niedrogi i przenośny analizator FRET o możliwościach podobnych do istniejących analizatorów fluorescencji⁷. W tym urządzeniu jako źródło światła zastosowano niedrogą diodę elektroluminescencyjną ultrafioletową (LED) o długości fali 405 nm w celu wywołania wzbudzenia sygnału fluorescencji, zastępując drogą lampę lub laser. Układ detekcji analizatora skutecznie skupia rozpraszający sygnał fluorescencyjny na dwóch fotodetektorach z fotodiodą krzemową. W nowszym badaniu wykazaliśmy, że optymalizacja temperatury wykrywania przy 50 - 55 °C może znacznie zwiększyć ratiometryczny sygnał FRET⁸. To specyficzne dla temperatury wzmocnienie sygnału, wraz z wykonanym na zamówienie analizatorem FRET, umożliwia wykorzystanie czujników FRET w bardziej ogólnych zastosowaniach diagnostycznych z szybką i wysoką czułością.

W tym protokole wykazaliśmy ogólną przydatność analizatora FRET w optymalnych warunkach temperatury FRET, określając ilościowo zawartość cukru w dostępnych na rynku napojach. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat działania urządzenia FRET, a także krótki opis przygotowania czujnika i próbki. Przewidujemy, że raport ten przyczyni się do promowania potencjalnego zastosowania przenośnego analizatora w małych środowiskach laboratoryjnych i stworzy podstawę do dalszego rozwoju niedrogiego urządzenia diagnostycznego na miejscu z biosensorami opartymi na FRET.

Protokół

1. Przygotowanie Biosensora

1. Skonstruuj plazmid pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6, postępując zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem².
2. Zaszczepić 5 ml bulionu Luria (LB) pojedynczą kolonią szczepu Escherichia coli DE3 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem.
3. Przenieść 1 ml kultury O/N do kolby o pojemności 500 ml zawierającej 100 ml LB i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD₆₀₀) osiągnie 0,5 (około 3 godziny).
4. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez odwirowanie w temperaturze 1 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
5. Zawiesić szybko osad w każdej probówce z 50 ml lodowatej wody destylowanej (DW) i odwirować przy 1 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Zawiesić osad w 50 μl lodowatego DW z 10% (v/v) glicerolem, delikatnie mieszając, aż roztwór (ogniwa elektrokompetentne) osiągnie OD₆₀₀ 100.
7. Umieścić mieszaninę elektrokompetentnych ogniw (50 μl ogniw o średnicy zewnętrznej₆₀₀ wynoszącej 100) i 10 ng plazmidu pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6 w lodowatej kuwecie do elektroporacji w urządzeniu do elektroporacji i elektroporować mieszaninę (18 kV/cm, 25 μF).
8. Szybko dodaj 1 ml pożywki SOC do kuwety i delikatnie ponownie zawieś ogniwa, a następnie odzyskuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem w probówce o okrągłym dnie o pojemności 15 ml.
9. Rozprowadzić komórki na płytce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
10. Wyizolować pojedynczą kolonię za pomocą pętli i zaszczepić kolonię w 10 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez 12 godzin.
11. Dodać 5 ml kultury nasiennej do 500 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
12. Dodać 0,5 mM izopropylu β-d-tiogalaktozydu (IPTG), gdy OD₆₀₀ osiągnie 0,5 i inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
13. Odwirować komórki w temperaturze 4 500 × g przez 20 minut (4 °C) i delikatnie usunąć supernatant.
14. Ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu wiążącego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA i 1 mM DTT).
15. Sonikuj komórki na lodzie za pomocą sześciu 10-sekundowych impulsów o mocy 200-300 W, po każdym impulsie z 10-sekundowym chłodzeniem.
16. Odwirować lizat w stężeniu 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych. Przenieść supernatant (białko rozpuszczalne) do nowej probówki zbiorczej.
17. Aby uzyskać oczyszczanie powinowactwa białek czujnika FRET, należy załadować 4 ml oczyszczonego lizatu komórkowego do kolumny powinowactwa Ni-NTA (objętość 5 ml) i przeprowadzić test chromatograficzny przy użyciu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)¹⁸.
18. Przemyć kolumnę raz pięcioma objętościami buforu do przemywania I (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM chlorku sodu, 10 mM imidazolu, pH 7,0).
19. Powtórzyć etap płukania z pięcioma objętościami kolumny buforu do przemywania II (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM chlorku sodu, 20 mM imidazolu, pH 7,0).
20. Eluować białko czujnika za pomocą pięciu objętości buforu elucyjnego (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM chlorku sodu, 500 mM imidazolu, pH 7,0).
21. Aby zagęścić i odsolić eluowaną próbkę, należy napełnić koncentrator (wielkość membrany 10 000 MW) do 20 ml próbki i odwirować przez 10 minut przy 3 000 × g. Uzupełnij koncentrator 0,8% solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Powtórz ten krok dwukrotnie, najpierw napełniając koncentrator 20 ml próbki, a następnie ponownie napełniając PBS.
22. Odzyskać skoncentrowane i odsolone białko czujnika i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

2. Pomiar zawartości cukru za pomocą analizatora FRET

UWAGA: Szczegóły budowy analizatora FRET zostały opisane w naszej poprzedniej pracy⁷.

1. Przygotować roztwór detencyjny o stężeniu 0,8% PBS zawierający 0,2 μM białek czujnika.
2. Włącz analizator FRET. Naciśnij przycisk "UP" przez 2 sekundy, aby skalibrować optymalną temperaturę. Ustaw temperaturę na 53 °C za pomocą przycisków "UP" i "DOWN" i naciśnij przycisk "SET".
3. W celu kalibracji naciśnij i przytrzymaj jednocześnie przyciski "UP" i "DOWN" przez 2 sekundy. Upewnij się, że na panelu LED wyświetla się "CALIB" i naciśnij przycisk "SET".
4. Umieścić prostokątne naczynie równoległościenne (kuwetę) o średnicy 12,5 × 12,5 × 45 mm (długość × szerokość × wysokość) zawierające tylko bufor PBS w uchwycie kuwety analizatora i nacisnąć przycisk "SET".
5. Zastąp kuwetę taką, która zawiera tylko roztwór wykrywający (patrz 2.1) bez cukru (maltoza/sacharoza) i naciśnij przycisk "SET", aby skalibrować linię podstawową.
6. Wymień kuwetę na taką, która zawiera roztwór detekcyjny z 10 mM cukru i naciśnij przycisk "SET".
7. Aby określić zawartość cukru w próbce napoju, umieść 1 ml próbki napoju w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i odwiruj przy 16 000 × g przez 1 min.
   UWAGA: Pomiar fluorescencji oparty na czujniku FRET ma tę zaletę, że nie wymaga specjalnej obróbki wstępnej próbki, ponieważ tylko 1% (v/v) próbki jest uwzględniony w całkowitej objętości. Zalecamy jednak usunięcie wszelkich materiałów, które mogą mieć wpływ na pomiar fluorescencji (np. komórek, nierozpuszczalnych cząstek, lipidów, tłuszczów lub innych materiałów z autofluorescencją). Ponadto, jeśli mocny kwas, mocna zasada, środek czyszczący (detergent) lub środek emulgujący (emulgator) występuje w wysokim stężeniu i może wpływać na właściwości czujnika biologicznego FRET, należy go usunąć za pomocą rozpuszczalnika organicznego lub neutralizatora. Na przykład, gdy tłuszcz mleczny i emulgatory są eliminowane z mrożonych przekąsek, próbki są odwirowywane w probówce do mikrokrów o masie 16 000 × g przez 30 minut, a ciecz między osadem dennym a górną warstwą tłuszczu mlecznego jest ekstrahowana. Następnie dodaje się równą ilość heksanu, a następnie odwirowuje się w stężeniu 15 000 × g przez 30 minut w celu wyeliminowania lipidów.
8. Usunąć supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy (wielkość porów 0,2 μm).
9. Umieścić 0,1 ml przefiltrowanej próbki napoju w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 0,9 ml PBS i delikatnie przemieszać.
   UWAGA: Bardzo ważne jest prawidłowe rozcieńczenie próbki napoju. W tym przypadku przeprowadzono 1000-krotne rozcieńczenie, tak aby stężenie cukru mieściło się w zakresie dynamicznym urządzenia. Zalecamy wcześniejsze oszacowanie docelowego stężenia cukru poprzez odniesienie do zawartości cukru na etykiecie napoju.
10. Dodać 5 μl rozcieńczonej próbki napoju (1%, v/v) do kuwety zawierającej 0,495 ml roztworu wykrywającego.
11. Umieścić kuwetę w uchwycie na kuwetę analizatora FRET i podgrzać roztwór próbki do 53 °C.
12. Naciśnij przycisk "SET", aby zmierzyć zawartość cukru.
    Uwaga: Możliwa jest ocena pomiaru FRET za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami lub spektrofotometru fluorescencyjnego wyposażonego w urządzenie Peltiera do kontroli temperatury poprzez odczyt stosunku przy długości fali 488/535 nm^7,8. W celu wykrycia sacharozy wykonaj czynności od 1.1 do 2.12 za pomocą czujnika CSY-LH².

Wyniki

Aby przeprowadzić ilościową analizę zawartości cukru za pomocą analizatora FRET, konieczne jest opracowanie dopasowanej krzywej szacującej stężenie docelowego cukru na podstawie obserwowanego stosunku FRET. Niech r definiuje stosunek intensywności emisji CFP przy 480 nm do intensywności emisji YFP generowanej przy 530 nm (Równanie 1).

Dyskusja

Protokół ten umożliwia szybkie i wydajne ilościowe oznaczanie zawartości cukru w próbkach napojów przy użyciu specjalnie zaprojektowanego analizatora FRET⁷ w temperaturze optymalnej dla czujników FRET. Analizator został zaprojektowany z niedawno opracowanym, niedrogim ultrafioletowym diodą LED o długości fali 405 nm jako źródłem światła oraz dwoma fotodetektorami z fotodiodą krzemową. To urządzenie jest bardziej opłacalne niż inne porównywalne fluorometry. Urządzenie wykazało się wysoką czułością detekcji, szc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB	BD	#244620
izopropyl β-D-tiogalaktozyd (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4
SOC			2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Zasób glukozy
Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 & razy; 30 mm kolumna chromatografii anionowej
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Kuweta kwarcowa	Sigma	Z802875
AKÄ KTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		spektrofotometr fluorescencyjny
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	wieloetykietowy czytnik płyt<
i>E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetence
cells A (napój)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Napoje fermentowane
B (napój)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Napój bezalkoholowy
C (Napój)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Napój sportowy