Protokół wytwarzania nanocząstek gliadyny-cyjanoakrylanu do powlekania hydrofilowego

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nanocząsteczek na bazie białek, który zmienia hydrofobową powierzchnię na hydrofilową. Wyprodukowana nanocząstka jest zespołem kopolimerów diblokowych gliadyny i cyjanoakrylanu. Natryskiwanie wytworzonej nanocząstki zmienia powierzchnię materiału docelowego na powierzchnię hydrofilową.

Streszczenie

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nanocząsteczek na bazie białek, który zmienia hydrofobową powierzchnię na hydrofilową za pomocą prostego powlekania natryskowego. Te nanocząstki są wytwarzane w reakcji polimeryzacji cyjanoakrylanu alkilu na powierzchni cząsteczek białka zbożowego (gliadyny). Cyjanoakrylan alkilu jest monomerem, który natychmiast polimeryzuje w temperaturze pokojowej po nałożeniu na powierzchnię materiałów. Jego reakcja polimeryzacji jest inicjowana przez śladowe ilości słabo zasadowych lub nukleofilowych gatunków na powierzchni, w tym wilgoć. Po polimeryzacji spolimeryzowane cyjanoakrylany alkilowe wykazują silne powinowactwo do materiałów obiektowych, ponieważ grupy nitrylowe znajdują się w szkielecie poli(cyjanoakrylanu alkilu). Białka działają również jako inicjator tej polimeryzacji, ponieważ zawierają grupy aminowe, które mogą zainicjować polimeryzację cyjanoakrylanu. Jeśli zagregowane białko jest używane jako inicjator, agregat białkowy jest otoczony hydrofobowymi łańcuchami poli(cyjanoakrylanu alkilu) po reakcji polimeryzacji cyjanoakrylanu alkilu. Kontrolując warunki eksperymentalne, wytwarzane są cząstki w zakresie nanometrów. Wytworzone nanocząstki łatwo adsorbują się na powierzchni większości materiałów, w tym szkła, metali, tworzyw sztucznych, drewna, skóry i tkanin. Gdy powierzchnia materiału jest spryskiwana wytworzonej zawiesiną nanocząstek i spłukiwana wodą, struktura micelarna nanocząstki zmienia swoją konformację, a białka hydrofilowe są wystawione na działanie powietrza. W rezultacie powierzchnia pokryta nanocząstkami zmienia się w hydrofilową.

Wprowadzenie

Celem tego artykułu jest pokazanie protokołu przygotowania zawiesiny nanocząstek, która modyfikuje właściwości zwilżania materiałów za pomocą prostego sprayu. Prezentowana zawiesina nanocząstek wykonana jest z cyjanoakrylanu alkilu¹ i białka zbożowego gliadyny^2,3. Podczas procesu produkcyjnego w wodnym roztworze etanolu⁴ powstają agregaty białkowe. W wyniku kolejnej reakcji z monomerem (cyjanoakrylanem alkilu) powstaje nanocząstka, która składa się z rdzenia białkowego otoczonego liniowymi łańcuchami polimerowymi [poli(cyjanoakrylan alkilu)]⁵.

Poli(cyjanoakrylan alkilu)s są biodegradowalne i zostały użyte do produkcji nanocząstek poprzez polimeryzację emulsyjną⁶. Reakcja ta jest spontanicznie inicjowana przez grupy hydroksylowe zdysocjowane od wody lub przez inne grupy nukleofilowe w pożywce reakcyjnej⁷. W przypadku reakcji przedstawionej w niniejszym artykule grupy aminowe na powierzchni agregatów białkowych inicjują reakcję polimeryzacji monomerów cyjanoakrylanu^{alkilu 5,8}. W wyniku tej reakcji w środowisku reakcyjnym powstają nanocząstki. Rdzeń nanocząstki to agregaty białkowe, a warstwa zewnętrzna to łańcuchy poli(cyjanoakrylanu alkilu) (PACA). Przygotowana nanocząstka wykazuje silne powinowactwo do większości materiałów (a dokładniej do każdego materiału, do którego PACA może się adsorbować) i przylega do ich powierzchni, tworząc cienką powłokę w skali nanometrowej. Prosta powłoka natryskowa natychmiast zmienia powierzchnię materiałów na hydrofilową.

Gliadyna jest jedną z głównych frakcji glutenu, który znajduje się w bielmie pszenicy. Gliadyny to głównie białka monomeryczne o masie cząsteczkowej około 28 000 - 55 000. Wiązania niekowalencyjne, takie jak wiązania wodorowe, wiązania jonowe i wiązania hydrofobowe, są odpowiedzialne za agregację gliadyn². Chociaż gliadyna została wybrana jako reagent w tym artykule, wiele innych białek może być również używanych do tego samego celu. Jednak warunek reakcji musi być odpowiednio zmodyfikowany, ponieważ warunek indukcji agregacji zależy od rodzaju białka, które ma być zastosowane⁸. W porównaniu z innymi białkami gliadyna jest łatwiej dostępna, oczyszczanie jest proste, a koszty produkcji niskie. Chociaż cyjanoakrylan etylu (ECA) jest wybierany jako monomer do prezentowanej reakcji, do tej samej reakcji można również zastosować inne cyjanoakrylany alkilowe. Powodem, dla którego warto wybrać ECA, jest to, że jest on łatwo dostępny i tani.

Protokół

1. Odtłuszczająca komercyjna gliadyna

1. Odmierzyć 150 ml acetonu za pomocą cylindra z podziałką i rozlać do 250 ml kolby Erlenmeyera.
   1. Mieszając prętem wirowym na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej, dodaj 30 g dostępnego w handlu proszku gliadyny. Uszczelnić otwór kolby folią aluminiową i dalej mieszać O/N w pokrywie.
2. Przefiltrować roztwór za pomocą bibuły filtracyjnej.
   1. Przemyć filtrat świeżym acetonem (ok. 50 ml). Odstawić na 10 minut, aby aceton mógł spłynąć.
   2. Przenieś filtrat wraz z bibułą filtracyjną znajdującą się pod spodem do dużego naczynia, takiego jak kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych. Przykryj całe naczynie dużą bibułą filtracyjną, aby spowolnić parowanie resztek acetonu.
   3. Pozostawić filtrat do całkowitego wyschnięcia w okapie O/N. Przechowywać odtłuszczoną gliadynę w hermetycznym pojemniku w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie oczyszczonej gliadyny

1. Odmierzyć 150 ml wody za pomocą cylindra z podziałką i wlać do 1 000 ml kolby Erlenmeyera.
   1. Odmierzyć 350 ml absolutnego alkoholu etylowego za pomocą cylindra do bałaganu i wlać do tej samej kolby Erlenmeyera o pojemności 1 000 ml. Mieszać energicznie (800 - 1 000 obr./min) za pomocą pręta wirowego, aż z mieszaniny roztworu nie powstaną pęcherzyki.
2. Mieszając, dodaj 20 g odtłuszczonej komercyjnej gliadyny w proszku. Dodawaj gliadynę w małych ilościach na raz, aby uniknąć tworzenia się grudek zawierających powietrze w środku. Kontynuuj mieszanie O/N.
3. Przenieść cały roztwór do pojemnika na bałagan o pojemności 1 000 ml. Odstawić na dwa dni. W tym czasie zanieczyszczenia będą wytrącać się na dnie cylindra.
4. Przenieść supernatant do wyparki obrotowej za pomocą pipety i usunąć etanol z supernatantu w jak największym stopniu. Wraz ze zmniejszeniem procentowej zawartości etanolu gliadyna pojawi się w roztworze w postaci agregatu.
5. Zamrozić roztwór zawierający agregaty gliadyny przez zanurzenie/obrócenie w mieszaninie metanolu i suchego lodu i liofilizować w temperaturze -70 °C w próżni. Przed liofilizacją upewnij się, że cały roztwór jest zamrożony bez płynu.
   UWAGA: Liofilizowana gliadyna utworzy porowate ciało stałe.
6. Liofilizowaną gliadynę rozdrobnić moździerzem i tłuczkiem, a następnie zmielić młynkiem do kawy do uzyskania drobnej mocy (<0,5 mm). Przenieś produkt do hermetycznego pojemnika i przechowuj w temperaturze RT.

3. Reakcja polimeryzacji ECA z gliadyną

1. Umieścić fiolkę scyntylacyjną (objętość około 20 ml) na wadze wagowej i wytarować. Dodać 3,2 g wody destylowanej i 6,8 g absolutnego etanolu do fiolki do naczynia do napełniania.
2. Przenieść fiolkę scyntylacyjną na mieszadło magnetyczne, włożyć wirówkę magnetyczną (20 x 3 mm) do fiolki i energicznie mieszać (800 - 1 000 obr./min), aż z wodnej mieszaniny etanolu nie powstanie pęcherzyk powietrza.
3. Dodać 40 μl 4 N HCl do fiolki, mieszając. Dodać 20 mg gliadyny do fiolki, mieszając i mieszając tak długo, aż gliadyna w proszku całkowicie rozpuści się w wodnej mieszaninie etanolu.
4. Po upewnieniu się, że roztwór gliadyny jest przezroczysty gołym okiem, powoli dodaj 80 - 100 μl ECA, podczas gdy prędkość mieszania nadal wynosi 800 - 1 000 obr./min.
   1. Zmniejsz prędkość mieszania do 500 obr./min i kontynuuj mieszanie przez 1 godzinę. W miarę postępu reakcji obserwuj zmętnienie, które wskazuje, że reakcja polimeryzacji jest w toku.
5. Po zakończeniu reakcji przenieś roztwór do probówek wirówkowych i zrównoważ wagę probówek. Odwirować produkt reakcji przy 10 000 x g przez 20 minut. W tym czasie produkt uboczny wytrąca się, a nanocząstki pozostają w supernantancie. Głównym składnikiem produktu ubocznego jest homopolimer PACA.
6. Po odwirowaniu przenieś wyprodukowaną zawiesinę nanocząstek (supernatant) za pomocą pipety do fiolki scyntylacyjnej (lub dowolnego hermetycznego pojemnika) i przechowuj ją w temperaturze pokojowej.

4. Charakterystyka produktu

1. Przygotować 10 g wodnego roztworu etanolu o stężeniu 68% wag., mieszając 3,2 g wody i 6,8 g etanolu absolutnego w 20 ml fiolki scyntylacyjnej i mieszać tak długo, aż z mieszaniny roztworu nie powstanie pęcherzyk.
   1. Dodać 40 μl 4 N HCl do mieszaniny roztworów, mieszając. Dodać 50 μl zawiesiny nanocząstek do przygotowanego roztworu etanolu, mieszając.
2. Zmierz wielkość nanocząstki za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) przy użyciu próbki roztworu przygotowanej powyżej i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Rozmiar produktu końcowego musi być mniejszy niż 200 nm. Jeśli jest większy niż 200 nm, produkt nie będzie stabilny przez dłuższy czas. Większe nanocząstki są wytwarzane, gdy zastosowany ECA nie jest świeży.

5. Badanie produktu

1. Przygotuj szklaną płytkę, taką jak lusterko ręczne. Umyj powierzchnię szklanej płytki wodą z mydłem. Spłucz powierzchnię szklanej płytki pod bieżącą wodą. Osusz oczyszczoną powierzchnię lub użyj bez suszenia do następnego kroku.
2. Rozpylić zawiesinę nanocząstek otrzymaną w ppkt 3.6) na część płytki szklanej i natychmiast spłukać powierzchnię płynącą wodą.
3. Spryskaj czystą wodą powierzchnię szklanej płyty. Obserwuj, jak pokryta (spryskana zawiesiną nanocząstek) powierzchnia utrzymuje warstwę wody, podczas gdy niepowlekana powierzchnia jest czysta.

Wyniki

Nanocząstki można przygotować w różnych warunkach reakcji. Gliadyna tworzy agregaty w szerokim zakresie zawartości etanolu⁵. Jednakże rozmiar agregatów musi być jak najmniejszy, ponieważ do agregatu zostanie dodana dodatkowa warstwa (t.j. spolimeryzowany ECA), a proces ten zwiększy końcowy rozmiar. Jeśli końcowy rozmiar cząstki będzie zbyt duży, cząstka stanie się niestabilna i będzie łatwo ulegać precypitacji. Dlatego jako środowisko reakcyjne wybrano 68% wodny roztwó...

Dyskusja

Istnieje kilka krytycznych etapów produkcji zawiesiny nanocząstek. Jeśli oczyszczona gliadyna zawiera zanieczyszczenia, w wyniku reakcji z ECA powstaną produkty uboczne. Chociaż te niepożądane produkty mogą zostać usunięte z pożywki reakcyjnej na etapie wirowania, obniża to wydajność głównego produktu. Jeżeli roztwór gliadyny przygotowany podczas etapu doświadczalnego 2.3) nie wykazuje wyraźnego oddzielenia między supernatantem a osadem po dwóch dniach, roztwór musi stać przez dłuższy czas. Stosowanie świeżego ECA ma ogr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monomer cyjanoakrylanu etylu (ECA)	K& R International (Laguna Niguel, CA)	I-1605	Można użyć dowolnego czystego ECA.
Gliadin	MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS)	Prezent od firmy	Gliadin można kupić w Sigma-Aldrich (kat #: G3375-25G). Zamiast gliadyny, dowolna reklama  Można użyć glutenu.
HCl	Dowolna		Można użyć dowolnej substancji chemicznej klasy odczynnika.
Aceton	Dowolny		: Można użyć dowolnego odczynnika chemicznego.
Metanol	Dowolny		: Można użyć dowolnego odczynnika chemicznego.
Etanol (100%)	Można użyć dowolnego		odczynnika chemicznego.
Bibuła filtracyjna	Dowolna		Można użyć dowolnej jakości bibuły filtracyjnej większej niż 10 cm.
Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych	Dowolne		Można użyć dowolnego naczynia większego niż 20 x 20 cm.
Młynek do kawy	Dowolna		Można użyć dowolnego młynka do kawy.
Parownik obrotowy	Dowolna		Można użyć dowolnej parownika obrotowej.
Liofilizator	Dowolny		liofilizator, który może osiągnąć -70 & stopni; Można użyć C.
Wirówka	Dowolna		Można użyć dowolnej wirówki, która może zastosować 1,000 x g.
Mieszadło magnetyczne	Dowolne		Można użyć dowolnego mieszadła magnetycznego, które może obrócić pręt wirujący do 1,000 obr./min.
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)	Brookhaven Instruments Corporation	NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer	DLS firmy może być używany przez dowolną firmę.
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)	Carl Zeiss Inc.		Można użyć dowolnego SEM.
Dynamiczny kąt zwilżania (DCA)		Thermo Cahn	Można użyć dowolnego DCA.

Instrumenty