Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Agnieszka B. Bialkowska; Amr M. Ghaleb; Mandayam O. Nandan; Vincent W. Yang

doi:10.3791/54161

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

73.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54161

⸱

13 lipca 2016

Agnieszka B. Bialkowska^*¹ , Amr M. Ghaleb^*¹ , Mandayam O. Nandan¹ , Vincent W. Yang¹^,²

¹Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, ²Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Streszczenie

Zrozumienie roli czynników regulujących homeostazę nabłonka jelitowego oraz reakcję na urazy i regenerację jest ważne. W obecnej literaturze opisano kilka różnych podejść metodologicznych do uzyskiwania obrazów tkanek jelitowych w celu walidacji danych. W tym artykule nakreślamy wspólny protokół związany z pozyskiwaniem i przetwarzaniem tkanek jelitowych myszy. Omówiono prawidłowe utrwalanie tkanek jelitowych oraz techniki szwajcarskie poprawiające morfologię nabłonka jelitowego. Przetwarzanie po resekcji i reorientacja osadzonych tkanek jelitowych mają kluczowe znaczenie dla uzyskania bloków zatopionych w parafinie, które po przekroju wykazują nienaruszone cechy strukturalne jelita. Technika zwijania szwajcarskiego pomaga w ocenie histologicznej badanych całych odcinków jelita grubego lub okrężnicy. Zdolność do różnicowania cech strukturalnych jelit może być kluczowa w pomiarach ilościowych zapalenia jelit i nowotworzenia na całej długości. Wreszcie, skrawki zatopione w parafinie są idealne do solidnego przetwarzania przy użyciu metod wykrywania zarówno immunohistochemicznego, jak i immunofluorescencyjnego. Niefluorescencyjne sekcje immunohistochemiczne zapewniają żywy obraz tkanki z wyszczególnieniem różnych cech strukturalnych komórki, ale nie zapewniają elastyczności w eksperymentach kolokalizacji wewnątrzkomórkowej. Wiele kanałów fluorescencyjnych może być odpowiednio wykorzystanych z detekcją immunofluorescencyjną do eksperymentów kolokalizacyjnych, co stanowi wsparcie dla badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy ssaków składa się z pojedynczej warstwy komórek kolumnowych. W jelicie cienkim komórki proliferacyjne są zamknięte w kryptach, podczas gdy zróżnicowane komórki zajmują obszar kosmków. Ponieważ jednak w jelicie grubym nie ma kosmków, komórki proliferacyjne są zlokalizowane na dnie krypt, a zróżnicowane komórki zajmują górną część krypt. Nabłonek jelitowy ulega szybkiemu uzupełnieniu (około 3 - 5 dni), co jest napędzane ciągłym podziałem komórek proliferacyjnych w kryptach. Komórki proliferacyjne krypt nie są jednorodną populacją i są dalej dzielone na komórki macierzyste i komórki amplifikujące tranzyt (TA)¹. Komórki macierzyste znajdują si....