Artykuł metodologiczny

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

DOI:

10.3791/54161

⸱

13 lipca 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie roli czynników regulujących homeostazę nabłonka jelitowego oraz reakcję na urazy i regenerację jest ważne. W obecnej literaturze opisano kilka różnych podejść metodologicznych do uzyskiwania obrazów tkanek jelitowych w celu walidacji danych. W tym artykule nakreślamy wspólny protokół związany z pozyskiwaniem i przetwarzaniem tkanek jelitowych myszy. Omówiono prawidłowe utrwalanie tkanek jelitowych oraz techniki szwajcarskie poprawiające morfologię nabłonka jelitowego. Przetwarzanie po resekcji i reorientacja osadzonych tkanek jelitowych mają kluczowe znaczenie dla uzyskania bloków zatopionych w parafinie, które po przekroju wykazują nienaruszone cechy strukturalne jelita. Technika zwijania szwajcarskiego pomaga w ocenie histologicznej badanych całych odcinków jelita grubego lub okrężnicy. Zdolność do różnicowania cech strukturalnych jelit może być kluczowa w pomiarach ilościowych zapalenia jelit i nowotworzenia na całej długości. Wreszcie, skrawki zatopione w parafinie są idealne do solidnego przetwarzania przy użyciu metod wykrywania zarówno immunohistochemicznego, jak i immunofluorescencyjnego. Niefluorescencyjne sekcje immunohistochemiczne zapewniają żywy obraz tkanki z wyszczególnieniem różnych cech strukturalnych komórki, ale nie zapewniają elastyczności w eksperymentach kolokalizacji wewnątrzkomórkowej. Wiele kanałów fluorescencyjnych może być odpowiednio wykorzystanych z detekcją immunofluorescencyjną do eksperymentów kolokalizacyjnych, co stanowi wsparcie dla badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek jelitowy ssaków składa się z pojedynczej warstwy komórek kolumnowych. W jelicie cienkim komórki proliferacyjne są zamknięte w kryptach, podczas gdy zróżnicowane komórki zajmują obszar kosmków. Ponieważ jednak w jelicie grubym nie ma kosmków, komórki proliferacyjne są zlokalizowane na dnie krypt, a zróżnicowane komórki zajmują górną część krypt. Nabłonek jelitowy ulega szybkiemu uzupełnieniu (około 3 - 5 dni), co jest napędzane ciągłym podziałem komórek proliferacyjnych w kryptach. Komórki proliferacyjne krypt nie są jednorodną populacją i są dalej dzielone na komórki macierzyste i komórki amplifikujące tranzyt (TA)1. Komórki macierzyste znajdują się na dnie krypty, w obrębie pierwszych 4 - 5 komórek od samych2 dna. Obecny model potwierdza istnienie dwóch typów komórek macierzystych: komórek macierzystych o podstawie krypty (CBC) i rezerwowych komórek macierzystych w stanie spoczynku. Komórki macierzyste CBC aktywnie się namnażają i są oznaczone przez bogaty w leucynę receptor sprzężony z białkiem G 5 (Lgr5)3, olfaktomedynę 4 (Olfm4)4 i Achaete scute-like 2 (Ascl2)5. Z drugiej strony, rezerwowe spoczynkowe komórki macierzyste są znakowane przez specyficzne dla komórek B miejsce integracji wirusa mysiej białaczki Moloneya 1 (Bmi1)6, odwrotną transkryptazę telomerazy myszy (mTert)7, HOP Homeobox (Hopx)8, kinazę podobną do podwójnej kortyny i CAM 1 (Dclk1)9 oraz powtórzenia bogate w leucynę i domeny podobne do immunoglobuliny 1 (Lrig1)10. Aktywnie proliferujące komórki macierzyste dają początek komórkom TA, a następnie ulegają dalszemu różnicowaniu w komórki absorpcyjne (enterocyty) i komórki wydzielnicze (komórki enteroendokrynne, kubkowe, Paneth i kępki). Ciągły podział komórek w strefie proliferacyjnej powoduje ruch komórek nabłonka w górę wzdłuż osi krypta-kosmki, aż dotrą do szczytu kosmków, gdzie ulegają apoptozie i są złuszczane z powierzchni nabłonka. Różne typy komórek nabłonka jelitowego charakteryzują się ekspresją odrębnych białek (np. komórki kubkowe jelita można rozpoznać przez barwienie przeciwciałem przeciwko Muc2, a komórki Panetha przez przeciwciało przeciwko lizozymowi). Badamy rolę czynników Krüppela (KLF) w homeostazie i patobiologii nabłonka jelitowego11-13. Przedstawione tu wyniki potwierdzające wykonalność zmodyfikowanej techniki walcowania szwajcarskiego opierają się na wcześniejszych badaniach nad rolą czynnika podobnego do Krüppela 5 (KLF5) w utrzymaniu aktywnie proliferujących komórek macierzystych nabłonka jelitowego14. KLF5 jest czynnikiem transkrypcyjnym palca cynkowego, który ulega silnej ekspresji w aktywnych jelitowych komórkach macierzystych i komórkach TA12. Wcześniejsze badania wykazały, że KLF5 ulega koekspresji z Ki-67, znanym markerem proliferacyjnym w kryptach jelitowych.

Przewód pokarmowy nie jest strukturalnie ani funkcjonalnie jednorodną tkanką. Jelito cienkie jest podzielone na dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, a jelito grube na jelito ślepe i okrężnicę, przy czym ta ostatnia jest dalej podzielona na część proksymalną, środkową i dystalną. Każda z tych sekcji ma unikalne cechy histologiczne i odgrywa odrębne role15. W związku z tym skutki urazów i stopień odpowiedzi nabłonka jelitowego mogą zależeć od regionu badanej tkanki16. Ponadto różne szczepy myszy wykazują różnorodność odpowiedzi na poziomie histologicznym w zależności od rodzaju zniewagi zastosowanej w badaniach16. W związku z tym konieczne jest odpowiednie przygotowanie tkanek, aby umożliwić odpowiednią analizę histologiczną i molekularną tkanek jelitowych. W związku z tym technika Swiss-roll umożliwia analizę całej długości nabłonka jelitowego za jednym razem, a tym samym pozwala na wyciągnięcie świadomych wniosków na podstawie wyczerpujących informacji.

Technika szwajcarskiej bułki została po raz pierwszy wspomniana przez Magnusa17, a szczegółowo opisana przez Moolenbecka i Ruitenberga oraz Park i in. jako metoda przygotowania tkanek i przeprowadzania analiz histologicznych jelita gryzoniodpowiednio 18,19. Protokół opisany w niniejszej publikacji przedstawia ulepszoną wersję oryginalnej metody, która pozwala na terminowe i wiarygodne przygotowanie tkanek do celów diagnostycznych. Ta zmodyfikowana technika pozwala na sprawne pobieranie i przygotowanie nabłonka jelitowego do powszechnie stosowanych technik, takich jak immunohistochemia, immunofluorescencja, a także hybrydyzacja in situ (fluorescencyjna i chromogenna20). Co więcej, zmodyfikowana metoda przygotowania próbek tkanek wykorzystuje łatwo dostępne i stosunkowo niedrogie odczynniki, oferując jednocześnie metodę szybkiego utrwalania tkanek i pozwala na odzyskanie białka, DNA i RNA w celu dodatkowej oceny. Podsumowując, technika ta doskonale nadaje się do kompleksowej oceny histopatologicznych, patologicznych i molekularnych cech nabłonka jelitowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Myszy

  1. Wszystkie badania z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Myszy utrzymywano w cyklu jasno-ciemnym trwającym 12:12 godziny.
    1. Komercyjnie pozyskać myszy C57BL/6. Uzyskaj myszy C57BL / 6 z allelami Klf5 otoczonymi miejscami loxP (Klf5fl / fl). Myszy te zostały wcześniej opisanejako 21 i łaskawie dostarczone przez dr Ryozo Nagai.
  2. Zakup myszy C57BL / 6 z indukowalnym genem rekombinazy Cre pod regulacją promotora Lgr5 (myszy Lgr5-EGFP / CreERT2).
  3. Aby ustalić myszy Lgr5-EGFP / CreERT2 / Klf5fl / fl, skrzyżuj myszy Klf5fl / fl z myszami Lgr5-EGFP / CreERT2, a następnie krzyżuj wstecznie potomstwo z myszamiKlf5fl / fl.
  4. Leczyć myszy tamoksyfenem zgodnie z wcześniej opisanym protokołem22. Wstrzyknąć 8-tygodniowym myszom eksperymentalnym i kontrolnym dootrzewnowo (I.P.) 1 mg tamoksyfenu (10 mg / ml), rozpuszczonego w sterylnym oleju kukurydzianym, przez 5 kolejnych dni.
  5. W 14 dniu po pierwszym wstrzyknięciu tamoksyfenu należy złożyć ofiary myszy za pomocą uduszenia CO2 poprzez umieszczenie ich w komorze podłączonej do źródła gazu CO2 . Pozwól, aby gaz wpłynął do komory, aż myszy stracą przytomność i ustanie wszelki ruch. Aby zapewnić eutanazję, należy przeprowadzić zwichnięcie szyjki macicy.

2. Przygotowanie tkanek i walcowanie szwajcarskie

  1. Za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych wytnij nacięcie w skórze od strony brzucha. Za pomocą kleszczy przytrzymaj skórę w miejscu nacięcia i delikatnie odciągnij od tkanki mięśniowej brzucha. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę brzucha i odsłonić mięśnie brzucha.
  2. Przytrzymaj i podciągnij otrzewną kleszczami. Upewnij się, że nie trzymasz i nie ciągniesz za jelita. Ostrożnie wykonaj nacięcie w tkance otrzewnej i kontynuuj odcinanie skóry, aby odsłonić mięśnie brzucha. Ostrożnie wykonaj nacięcie w mięśniach brzucha i kontynuuj ich wycinanie, aby odsłonić jelita.
  3. Zidentyfikuj okrężnicę i prześledź do dystalnego końca, gdzie łączy się z odbytnicą/odbytem. Za pomocą nożyczek przytnij jak najbliżej otworu odbytu.
  4. Zidentyfikuj żołądek i prześledź, gdzie łączy się z jelitem cienkim. Nożyczkami odetnij jelito w odległości około 1 cm od żołądka. Przenieść całą długość uwolnionego jelita cienkiego i okrężnicy na czystą szalkę Petriego zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  5. Jedną ręką lub parą kleszczy przytrzymaj dystalny koniec okrężnicy, a drugą ręką delikatnie rozplątaj całą długość okrężnicy z tkanki łącznej i/lub tłuszczowej krezki.
  6. Zidentyfikuj jelito ślepe (małą torebkę między jelitem cienkim a grubym) i przeciąć miejsce, w którym jelito ślepe i okrężnica łączą się (bliższy koniec okrężnicy), aby uwolnić okrężnicę.
  7. Jedną ręką lub parą kleszczy przytrzymaj jelito cienkie, a drugą ręką delikatnie rozplątaj całą długość jelita cienkiego z tkanki łącznej i/lub tłuszczowej krezki. Odetnij jelito ślepe i wyrzuć, jeśli nie ma takiej potrzeby.
    Uwaga: Proces można zatrzymać tutaj, inkubując wycięte jelita w zmodyfikowanym utrwalaczu Bouina (50% etanolu/5% kwasu octowego wdH2O) przez noc i kontynuując procedurę następnego dnia.
  8. Dotykając jednego odcinka jelita (jelita cienkiego lub okrężnicy), napełnij 10-mililitrową strzykawkę zmodyfikowanym utrwalaczem Bouina i przymocuj do niej igłębkę. Włóż igłę na około pół centymetra w przedni otwór odcinka jelitowego.
  9. Przytrzymaj igłębkę do wnętrza odcinka jelita, wywierając silny nacisk instrumentem na segment jelita. Drugą ręką trzymając strzykawkę, delikatnie ale konsekwentnie uciskać, aby wypłukać zawartość odcinka jelita za pomocą zmodyfikowanego utrwalacza Bouina. Ten krok umożliwia jednoczesne oczyszczenie odcinka jelita i natychmiastowe unieruchomienie. Użyj szalki Petriego, aby zebrać przepływające odpady. Utrwalenie można zaobserwować poprzez zmętnienie koloru jelita grubego.
    Uwaga: Upewnij się, że nie wywierasz zbyt dużego nacisku podczas płukania, ponieważ może to spowodować pęknięcie odcinka jelita.
  10. Za pomocą nożyczek rozetnij odcinek jelita wzdłuż linii krezki. Przytrzymaj go kleszczami i krótko opłucz na szalce Petriego zawierającej PBS.
    1. Przetnij jelito cienkie na 3 równe segmenty: proksymalny, środkowy i dystalny. Segment proksymalny to ten, który znajduje się bezpośrednio po żołądku, a segment dystalny to ten bezpośrednio przed okrężnicą. Segment proksymalny jest odpowiednikiem dwunastnicy, środkowy – jelita czczego, a dystalny – jelita krętego.
    2. Dla każdego segmentu zaznacz bliższy i dalszy koniec. Bliższy koniec to ten, który pierwotnie był skierowany w stronę żołądka, a dystalny był skierowany w stronę okrężnicy.
  11. Użyj górnej części szalki Petriego, aby umieścić oczyszczony i otwarty segment jelita. Umieść segment jelita stroną ze światłem skierowanym do góry.
    1. W przypadku okrężnicy zidentyfikuj stronę luminalną za pomocą różnorodnych grzbietów biegnących na całej jej szerokości i obecnych na bliższym końcu. Regiony środkowe i dystalne mają pewne odmiany, które biegną podłużnie. W przypadku jelita cienkiego zidentyfikuj stronę luminalną po szorstkiej powierzchni, która oznacza kosmki.
      Uwaga: W przypadku jelita cienkiego nie ma zewnętrznego makroskopowego anatomicznego rozgraniczenia obszarów proksymalnych, środkowych i dystalnych. Jednak obszary te można zidentyfikować w sekcjach pod mikroskopem. Kosmki są najdłuższe w okolicy proksymalnej i stają się stopniowo krótsze dystalnie, gdzie są najkrótsze. Mikroskopowo krypty okrężnicy są najkrótsze w obszarze proksymalnym, który można również zidentyfikować po obecności grzbietów. Krypty okrężnicy są najwyższe w części środkowej i krótsze w okolicy dystalnej, ale nadal wyższe niż w okolicy proksymalnej.
  12. Kontynuuj szwajcarskie toczenie dwukropka:
    1. Utrzymuj okrężnicę płasko otwartą i pociągnij ją kleszczami od bliższego końca w kierunku krawędzi szalki Petriego.
    2. Trzymaj świecącą stronę skierowaną do góry i jedną ręką przytrzymaj proksymalny koniec kleszczami, a drugą ręką trzymaj wykałaczkę.
    3. Owiń krawędź bliższego końca wokół wykałaczki za pomocą kleszczy i lekko ściśnij owiniętą krawędź do wykałaczki, aby utrzymać ją na miejscu.
    4. Delikatnie i powoli zacznij toczyć wykałaczkę palcami, aby zwinąć okrężnicę wokół wykałaczki, aby uformować szwajcarską bułkę.
    5. Gdy cała długość okrężnicy zostanie zwinięta, użyj kleszczy, aby ostrożnie zsunąć szwajcarską rolkę okrężnicy z wykałaczki do kasety do przetwarzania / osadzania tkanek. Umieść kasetę w 10% buforowanej formalinie na noc w temperaturze pokojowej.
  13. Kontynuuj szwajcarskie zwijanie jelita cienkiego:
    1. Dotykając jednego segmentu na raz, utrzymuj segment płasko otwarty, świetlaną stroną do góry i pociągnij go kleszczami od bliższego końca w kierunku krawędzi szalki Petriego.
    2. Kontynuuj zwijanie szwajcarskie zgodnie z opisem dla okrężnicy.
  14. Kontynuuj przetwarzanie tkanek utrwalonych w formalinie do zatapiania parafiny. Postępuj w następujący sposób:
    UWAGA: Użyj automatycznego procesora (szczegółowe informacje można znaleźć w materiałach i sprzęcie).
    1. Gdy tkanka znajduje się w kasecie, spłucz tkankę PBS, aż utrwalacz zostanie całkowicie usunięty.
    2. Odwodnić tkankę za pomocą etanolu w następującej kolejności: 50% etanolu przez 10 min, 70% etanolu przez 10 min, 80% etanolu przez 10 min, 95% etanolu przez 10 min, 100% etanolu przez 10 min, 100% etanolu przez 10 min i 100% etanolu przez 10 min.
    3. Wymiana etanolu z ksylenem w następującej kolejności: etanol 2:1 : ksylen przez 10 - 15 min, etanol 1:1 : ksylen przez 10 - 15 min, etanol 1:2 : ksylen przez 10 - 15 min, 100% ksylen przez 10 - 15 min, 100% ksylen przez 10 - 15 min i 100% ksylen przez 10 - 15 min. UWAGA: Ksylen stanowi zagrożenie dla zdrowia, dlatego miejsce pracy powinno być wyposażone w miejscową wentylację wyciągową z odpowiednim okapem oraz odpowiedni sprzęt ochronny być noszone przez personel.
    4. Zamień ksylen na parafinę. W piecu próżniowym ustawionym na 54 - 58 °C wykonaj następujące czynności: ksylen 2:1 : parafina przez 30 min, ksylen 1:1 : parafina przez 30 min, ksylen 1:2 : parafina przez 30 min, 100% parafina przez 1 - 2 godz. i 100% parafina przez 1 - 2 godz. lub na noc.
      Uwaga: Nie pozwól, aby parafina przekroczyła 60 °C przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to degradację polimerów parafinowych i uczynienie ich twardymi i kruchymi.
    5. Zanurz w świeżej nowej parafinie i zorientuj tkankę zgodnie z życzeniem, zanim parafina stwardnieje. W przypadku bułek szwajcarskich, po zaparafinowaniu tkankowym, ważne jest, aby podczas zatapiania parafiny przestawić każdą rolkę na bok. Gwarantuje to, że podczas cięcia zostaną wyprodukowane odcinki na całej długości każdej rolki.
  15. Do barwienia należy ciąć odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu. Zebrać skrawki na naładowanych szkiełkach i wysuszyć (upiec) w piekarniku o temperaturze 65 °C przez noc; Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie użyj ich do barwienia.
    Uwaga: Czas pieczenia można skrócić do 1 - 2 godzin w zależności od tego, jak świeżo pokrojone są szkiełka. Jeśli od podziału minął mniej niż miesiąc, zaleca się pieczenie przez noc. Jeśli minął więcej niż miesiąc, wystarczy 1-2 godziny pieczenia, aby zaoszczędzić czas. Jeśli skończy się czas, zawsze można użyć podkładu nocnego.

3. Analiza histologiczna i barwienie immunofluorescencyjne

Wykonaj analizę histologiczną i barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z wcześniejszym opisem23,24, z modyfikacjami. W celu uzyskania wzmocnionej immunofluorescencji białka zielonej fluorescencji (EGFP):

  1. Piecz szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 °C przez 1 godzinę w celu dezaktywacji endogennej fosfatazy alkalicznej, a następnie odparafinowania w ksylenie.
  2. Inkubować skrawki w kąpieli z 3% nadtlenkiem wodoru w metanolu w celu zablokowania endogennych peroksydaz tkankowych; następnie ponownie nawodnić przez inkubację w malejącej serii kąpieli alkoholowych (100%, 95%, 70%), a następnie pobrać antygen w roztworze buforowym cytrynianu (10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween-20, pH 6,0) w temperaturze 125 °C przez 10 minut przy użyciu komory demaskatorskiej.
  3. Narysuj okrąg wokół skrawków tkanek za pomocą pisaka do znakowania, który zapewnia barierę hydrofobową i inkubuj skrawki z buforem blokującym (2,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w TBS-Tween) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko EGFP (rozcieńczenie 1:500) w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze, delikatnie wstrząsając.
  4. Przemyć skrawki i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie w odpowiednim stężeniu przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Przemyć szkiełka po wtórnym leczeniu przeciwciałami i wybarwieć jądra za pomocą Hoechst i zamocować za pomocą pożywki montażowej.
    1. W przypadku jednoczesnego barwienia Klf5/EGFP/Ki-67 należy przetworzyć szkiełka podstawowe zgodnie z opisem w krokach 3.1 - 3.3 i przeprowadzić barwienie Klf5 przez inkubację z przeciwciałem Klf5 (rozcieńczenie 1:150) przez noc.
    2. Zastosuj wykrywanie polimeru AP królika do szkiełek zgodnie z protokołem.
    3. Ujawnij barwienie Klf4 za pomocą chromogenowego barwienia immunohistochemicznego zgodnie z protokołem producenta.
    4. Przeprowadzić elucję przeciwciał przy użyciu wcześniej opisanego protokołu25. Inkubować szkiełka podstawowe w temperaturze 50 °C w roztworze Glycine-SDS (pH 2,0) z mieszaniem przez 1 godzinę.
    5. Dokładnie umyć szkiełka wodą destylowaną i inkubować z buforem blokującym (2,5% BSA w TBS-Tween) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Dodać jednocześnie przeciwciała Ki-67 (rozcieńczenie 1:500) i EGFP (rozcieńczenie 1:500) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    7. Przeprowadzić detekcję fluorescencyjną z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przed barwieniem Hoechst (dane nie pokazane) i zamontować za pomocą pożywki montażowej.
  6. Obserwuj morfologię histologiczną tkanek na wycinkach 5 μm barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E)26. W przypadku obrazów fluorescencyjnych użyj długości fal emisyjnych 535, 646 i 700, aby uwidocznić barwienie odpowiednio EGFP, Klf5 i Ki-67.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szwajcarska technika walcowania w połączeniu z barwieniem immunohistochemicznym pozwala na kompleksową analizę tkanki jelita cienkiego lub grubego. Przykład barwienia H&E jelita grubego myszy C57BL/6 (ryc. 1) ilustruje wykonalność i skuteczność tej techniki. Jak pokazano na rysunku 1, obraz jest w stanie uchwycić wszystkie części okrężnicy: proksymalną, środkową i dystalną. Tym samym pozwala na kompleksową ocenę histologiczną. Szwajcarskie zwijanie i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szwajcarska technika walcowania jest potężną metodą przygotowania tkanki jelitowej do oceny histologicznej i morfologicznej na dużą skalę. W przeciwieństwie do wcześniej opisanej techniki walcowania szwajcarskiego, która została pierwotnie opracowana do przygotowania zamrożonych skrawków18,19, przedstawiona tutaj procedura umożliwia szybkie przygotowanie i utrwalenie tkanki jelitowej do utrwalenia formaliny i zatopienia w parafinie (FFPE). W porównaniu z tkanką zamrożoną, tkanka FFPE ma znacznie dłuższy okres ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Ainara Ruiz de Sabando za dostarczenie zdjęć H&E. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (DK052230, DK093680 i CA172113) przyznane dr Vincentowi W. Yangowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestawy preparacyjne ze stali nierdzewnejVWR25640-002
Komora demonstracyjnaBiocare MedicalDC2012
Strzykawka 10 mlVWR89215-218
Swingsette Kaseta do zatapiania/przetwarzania tkanek z pokrywkąSimportM515
Superfrost Plus Slides [rozmiar: 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
Ręczny zestaw do barwienia szkiełekTissue-Tek/Sakura4451
Naczynie do barwienia GreenTissue-Tek/Sakura4456
Naczynie do barwienia BiałeTissue-Tek/Sakura4457
24-suwakowy uchwyt na suwaki z odłączanym uchwytemTissue-Tek/Sakura4465
PiekarnikThermo Scientific6243do pieczenia szkiełków w temperaturze 65 stopni
Mikroskop preparacyjnyZeissStemi 2000C
Mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse 90iJasne i fluescencyjne światło, z obiektywami: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Etanol 200 proofAAPR111000200
MetanolVWRBDH1135-4LP
Lodowaty kwas octowyAAPR281000ACS
KsylenFisher ScientificX5P-1GAL
Nadtlenek wodoru 25% roztwór w wodzieACROS202465000
10% formalina buferowanaFisher Scientific22-026-213
Surowica bydlęca frakcja V, szok termicznyRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Cytrynian soduFisher ScientificS279
Igła do zgłębnikaVWR20068-624
Królicze przeciwciało anty Klf5Santa Cruz Biotechnologysc-22797Rozcieńczenie 1:150
Kurczak przeciwciało anty EGFPMiliporeAB16901Rozcieńczenie 1:500
Królicze przeciwciałoanty Ki67Biocare MedicalCRM325BRozcieńczenie 1:500
Zestaw do wykrywania polimerów AP królika Mach3Biocare MedicalM3R533L
Warp czerwony zestaw chromogenówBiocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 Laboratoria Jacksona008875 
Automatyczny procesorLeicaLeica TP1020

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  3. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  4. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  5. van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
  6. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
  7. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
  8. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  9. May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
  10. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  11. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
  12. McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
  13. McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
  14. Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
  15. Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
  16. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
  17. Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
  18. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  19. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
  20. Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
  21. Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
  22. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  23. McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
  24. Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
  25. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
  26. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza immunohistochemicznaanaliza immunofluorescencyjnazmodyfikowany utrwalacz Bouinatkanka jelita myszybarwienie histologicznebloki zatopione w parafiniekaseta do przetwarzania tkanekmetody detekcji fluorescencyjnej

Powiązane artykuły